全自動固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定蜂蜜中4種吡咯里西啶類生物堿

朱秀煥 郝勝玉 玄紅專 常晨陽 趙成新 李愛峰

摘 要：建立了全自動固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質譜測定蜂蜜中4種吡咯里西啶類生物堿（野百合堿、倒千里光堿、千里光寧、千里光菲啉）含量的方法。樣品用50%甲醇水溶液提取，采用SCX固相萃取柱進行在線凈化，以Agilent Eclipse Plus C18色譜柱為分析柱，含0.1%甲酸、10 mmol/L乙酸銨的水溶液和乙腈的流動相等度洗脫，在電噴霧電離源正離子模式和多反應監(jiān)測模式下進行檢測。結果表明，4種生物堿均在0.1～20 μg/kg范圍內與其對應的峰面積呈現良好的線性關系，相關系數均大于0.999，方法的檢出限（S/N=3）和定量限（S/N=10）分別為0.1μg/kg和0.2 μg/kg。以空白蜂蜜樣品為基質，在1 μg/kg、2.5 μg/kg、5 μg/kg加標水平下做回收實驗，回收率在83.98%～94.75%，相對標準偏差（RSD，n=6）均低于5%，該方法準確度高、靈敏度高、穩(wěn)定性好、操作簡便，適用于蜂蜜中吡咯里西啶類生物堿的測定。對國產20個不同產地、不同種類的蜂蜜樣品進行測定，結果發(fā)現3個樣品檢出了倒千里光堿，1個樣品檢出了千里光菲啉，野百合堿和千里光寧均未檢出。

關鍵詞：全自動固相萃取;高效液相色譜-串聯(lián)質譜法;吡咯里西啶類生物堿;蜂蜜

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經充分釀造而成的天然物質[1]，是營養(yǎng)豐富的天然滋養(yǎng)食品。隨著蜂蜜市場需求量的不斷提高，蜂蜜的安全問題也日益嚴重，農藥、獸藥殘留、摻雜、摻假等問題不斷出現[2]，嚴重影響了我國蜂蜜產品的市場秩序和出口貿易。

吡咯里西啶類生物堿（Pyrrolizidine Alkaloids，PAs）是一種在開花植物中廣泛存在的毒性生物堿，其毒性表現在肝臟毒性、腎臟毒性、肺臟毒性、致癌作用等許多方面[3-5]。蜜蜂采集了這類植物的花蜜釀造出的蜂蜜含有PAs，給人類的健康帶來潛在的威脅。近年來，GRIFFIN等[6]對59份澳大利亞蜂蜜樣本進行分析，發(fā)現其中41份樣品中含有PAs，這一研究報告使蜂蜜的質量問題再一次引起人們的關注。中國是全球最大的蜜蜂養(yǎng)殖國，蜂蜜的生產量和出口量穩(wěn)居世界第一。蜂蜜是人體攝入PAs的重要途徑之一，并且存在長期食用的可能性，其低水平、長期暴露的風險值得關注。鑒于PAs的廣泛來源及強烈的毒性，建立蜂蜜及植物源性食品中PAs的檢測方法及加強PAs的監(jiān)測具有十分重要的意義。

現有的PAs的檢測方法包括液相色譜法[7]、酶聯(lián)免疫吸附分析[8]、氣相色譜-質譜法[9]及液相色譜-質譜法[10-12]。高效液相色譜-串聯(lián)質譜法結合了液相色譜高效的在線分離能力和質譜的高選擇性、高靈敏度，具有同時檢測多種不同性質目標物的能力，在藥物多殘留分析中顯示出越來越廣闊的應用前景，但該方法對樣品的前處理要求比較高。有文獻報道采用強陽離子型固相萃取柱凈化蜂蜜樣品[13]，另外杜鳳君等人采用了QuEChERS方法優(yōu)化了蜂蜜中33種生物堿的凈化方法[14]。但上述兩種方法存在操作步驟煩瑣耗時、測定成本高、凈化效果不好等問題。近年來，由固相萃取發(fā)展而來的全自動萃取，采用全自動固相萃取裝置的程序設置實現了全自動化的樣品前處理過程，不僅可以解決傳統(tǒng)固相萃取操作耗時的缺點，還可以減少人為誤差[15-19]。

本文以蜂蜜基質中4種吡咯里西啶類生物堿（野百合堿、倒千里光堿、千里光寧、千里光菲啉）為研究對象，通過全自動固相萃取技術凈化樣品，采用高效液相色譜-串聯(lián)質譜法（HPLC-MS/MS）同時測定，有效縮短了測定時間，為蜂蜜等植物源性產品中PAs的安全風險評估提供了技術支持。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260 高效液相色譜儀-6460三重四級桿串聯(lián)質譜儀，美國Agilent公司;全自動固相萃取儀，美國萊伯泰科公司;渦旋混勻器，德國IKA公司;十萬分之一分析天平，德國塞多利斯公司;高速冷凍離心機，日本日立公司。

野百合堿標準品（純度>99%）;倒千里光堿標準品（純度>98%）;千里光寧標準品（純度>99%）;千里光菲啉標準品（純度>99%），均為美國Stanford公司;甲酸、甲醇、乙腈、乙酸銨，色譜純，美國Fisher公司;去離子水，自制;強陽離子固相萃取柱（SCX，60 mg/3 mL）天津Agela公司;混合型陽離子交換固相萃取柱（CX，60 mg/3 mL），美國Ameritech公司;高聚物固相萃取柱（HLB，60 mg/3 mL），日本島津公司;蜂蜜樣品分別由貴州省農科院提供和購于當地超市。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的前處理

（1）渦旋提取。準確稱取蜂蜜樣品2.0 g（精確至0.01 g）于50 mL帶蓋聚四氟乙烯離心管中，加入10 mL 50%甲醇水（V/V）溶液，3 000 r/min渦旋提取10 min，10 000 r/min離心5 min后取上清液，待凈化。

（2）樣品凈化。采用全自動固相萃取儀設定洗脫程序，按設定程序凈化樣品。洗脫液用氮吹儀在45 ℃下吹干，加入1 mL 0.1%甲酸水溶液溶解殘渣，過0.22 μm濾膜后上機檢測。

1.2.2 分離及檢測條件

（1）色譜分離條件。Agilent Eclipse Plus C18柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm）;流動相：A（0.1%甲酸，10 mmol/L乙酸銨水溶液）︰B（乙腈）=86︰14（V/V）;流速：0.4 mL/min;進樣量10 μL;柱溫30 ℃。

（2）質譜檢測條件。掃描方式：電噴霧正離子掃描模式（ESI+）;檢測方式：多反應監(jiān)測（MRM）;毛細管電壓：

4 000 V;干燥氣流速：11 L/min;霧化器溫度：350 ℃;霧化器壓力：310.26 kPa;4種PAs的質譜檢測條件見表1。

2 結果與分析

2.1 樣品前處理

向空白蜂蜜基質中加入4種PAs，使其濃度為10 μg/kg，以50%甲醇水溶液（V/V）為提取溶劑，確定渦旋提取時間為10 min。

2.2 固相萃取凈化

采用全自動固相萃取儀設定洗脫程序，分別比較了3種固相萃取柱（SCX、CX、HLB）的凈化效果，結果如圖1所示，使用SCX固相萃取柱凈化，PAs的回收率最高。另外利用全自動萃取技術可以真正做到不用人工動手的情況下完成相關工作，節(jié)約了人工時間，同時將實驗中的誤差降到了最低，比傳統(tǒng)的人工操作方便且穩(wěn)定性強，還更加環(huán)保。

2.3 色譜-質譜條件的優(yōu)化

2.3.1 色譜分離條件的優(yōu)化

4種PAs的同時測定依賴于色譜柱的選擇，不同類型的色譜柱對4種PAs的分離效果存在一定的差異。實驗考察了Agilent Poroshell 120 EC-C18柱（100 mm×3.0 mm，2.7 μm）和Agilent Eclipse Plus C18柱（100 mm×2.1 mm，3.5 ?m），部分PAs在Agilent Poroshell 120 EC-C18柱上拖尾嚴重，峰形不對稱，分離效果不好。4種PAs 在Agilent Eclipse Plus C18柱上峰形對稱尖銳，可以實現良好的分離。

2.3.2 質譜檢測條件的優(yōu)化

分別用0.1%甲酸溶液稀釋4種PAs儲備液，在正離子模式下進行母離子全掃描，確定待測物的母離子，再分別進行子離子全掃描。選擇兩個特征子離子，分別取信噪比高、峰形好看、干擾小的離子對作為定量離子對。以多反應監(jiān)測正離子模式優(yōu)化各個質譜參數，4種PAs混合物標準溶液的總離子圖見圖2。

2.4 標準曲線與線性范圍

以0.1%甲酸溶液為定溶液，配制PAs的質量濃度為分別為0.1 μg/L、0.2 μg/L、0.5 μg/L、1.0 μg/L、2.0 μg/L、

5.0 μg/L、10.0 μg/和20.0 μg/L的系列標準溶液，以信噪比（S/N）大于3確定為本方法的檢出限，以信噪比（S/N）大于10，

回收率大于60%的濃度點確定為本方法的定量限，方法的線性、檢出限和定量限如表2所示。

2.5 準確度

向空白蜂蜜基質中按1 μg/kg、2.5 μg/kg、5 μg/kg這3個不同加標水平加入相應量的混合標準溶液，按優(yōu)化的方法測定，計算加標回收率，如表3所示4種PAs的加標回收率在83.98%～94.75%，相對標準偏差（RSD，n=6）均低于5%，表明方法的準確度較高。

分別對20個不同產地、不同種類的蜂蜜樣品中PAs的含量進行了測定，其中3個樣品檢出了倒千里光堿，含量分別為0.53 μg/kg、0.49 μg/kg、0.23 μg/kg，1個樣品檢出了千里光菲啉，含量為0.27 μg/kg，野百合堿和千里光寧均未檢出。

3 結論

本文建立了全自動固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定蜂蜜中4種PAs，并用于實際樣品的檢測。結果表明該方法靈敏度高、回收率高、操作簡便、定量準確、經濟環(huán)保且高效穩(wěn)定，適用于蜂蜜中PAs的測定，為蜂蜜中PAs的檢測提供了一種高效簡便的方法，可以為蜂蜜等植物源性產品中PAs的安全風險評估提供技術支持。

參考文獻

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部.食品安全國家標準 蜂蜜：GB 14963—2011[S].北京：中國標準出版社，2011.

[2]NOORI A W，KHELOD S，AHMED A G，et al.Antibiotic，pesticide，and microbial contaminants of honey：human health hazards[J].The Scientific World Journal，2012：930849.

[3]JI L L，MA Y B，WANG Z Y，et al.Quercetin prevents pyrrolizidine alkaloid clivorine-induced liver injury in mice by elevating body defense capacity[J].PLoS One，2014，9（6）：98970.

[4]DOMINIK S，PAUL A W，ZHU X C，et al.Metabolic profiling of pyrrolizidine alkaloids in Foliage of two Echium spp. Invaders in Australia-A Case of Novel Weapons？[J]International journal of molecular sciences，2015，16（11）：26721-26737.

[5]BRUNO P S P，RAVENA P N，VICTOR D A S，et al.The role of astrocytes in metabolism and neurotoxicity of the pyrrolizidine alkaloid monocrotaline，the Main Toxin of Crotalaria retusa[J].Front Pharmacol，2012（3）：144-150.

[6]CAROLINE T G，SIMON M M，MARTIN D，et al.Development of a fast isocratic LC-MS/MS method for the high-throughput analysis of pyrrolizidine alkaloids in Australian honey[J].Food Additive Contam aminants：Part A，2015，32（2）：214-228.

[7]OPLATOWSKA M，ELLIOTT C T，HUET A C，et al.Development and validation of a rapid multiplex ELISA for pyrrolizidine alkaloids and their N-oxides in honey and feed[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry，2014，406（3）：757-770.

[8]MICHAEL K，SANDRA H，IRIS H，et al.Pyrrolizidine alkaloids in pollen and pollen products[J].Molecular Nutrition Food Research，2010，54（2）：292-300.

[9]熊愛珍，楊莉，張芳，等.LC-MSn鑒定肝毒性吡咯里西啶類生物堿千里光堿大鼠體內代謝產物[J].中國藥學雜志，2012，47（1）：54-60.

[10]張芳，王長虹，王崢濤.植物中吡咯吡咯里西啶類生物堿的檢測與分析[J].天然產物研究與開發(fā)，2006（6）：1057-1063.

[11]LIU F，WAN S Y，JIANG Z J，et al.Determination of pyrrolizidine alkaloids in comfrey by liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry[J].Talanta，2009，80（2）：916-923.

[12]DUBECKE A，BECKH G，LULLMANN C.Pyrrolizidine alkaloids in honey and bee pollen[J].Food Additive Contaminants：Part A，2011，28（3）：348-358.

[13]程莉，王丹，周爽，等.超高效液相相色譜-三重四極桿串聯(lián)質譜法測定蜂蜜中吡咯里西啶類生物堿[J].環(huán)境化學，2014，33（11）：1971-1977.

[14]杜鳳君，徐敦明，張志剛，等.QuEChERS-高效液相色譜-串聯(lián)質譜法同時分析蜂蜜中33種生物堿[J].分析科學學報，2019，35（6）：817-823.

[15]毛思浩，劉柱，梁晶晶，等.全自動固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定蜂蜜中硝基呋喃類代謝物[J].分析科學學報，2020，36（4）：572-578.

[16]林麒，羅赟，華永有，等.全自動固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定水中16種喹諾酮類抗生素[J].現代預防醫(yī)學，2018，45（2）：335-339.

[17]朱群英，朱玉玲，索莉莉，等.在線固相萃取-高效液相色譜法同時測定豆芽中11種植物生長劑和殺菌劑[J].分析科學學報，2018，34（4）：507-512.

[18]曾三妹，徐敦明，魏一婷，等.全自動固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定食糖中的雌二醇[J].色譜，2016，34（7）：

703-707.

[19]徐瀟穎，趙超群，梁晶晶，等.全自動固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定豆芽中15種喹諾酮類藥物的殘留量[J].理化檢驗（化學分冊），2020，56（5）：583-589.