龍膽苦苷通過調(diào)控miR-34c-5p/XBP1軸抑制作胃癌細(xì)胞HGC-27增殖、遷移和侵襲的分子機(jī)制研究

周為東,徐鎮(zhèn)杰,蕢乙文

周為東,徐鎮(zhèn)杰,蕢乙文,中國科學(xué)院大學(xué)寧波華美醫(yī)院(寧波市第二醫(yī)院)消化內(nèi)科 浙江省寧波市 315010

0 引言

胃癌發(fā)病率呈增長趨勢,嚴(yán)重威脅人類生命健康[1].目前,胃癌的治療缺乏有效的藥物.龍膽苦苷(gentiopicroside,GPS)主要存在于龍膽草、秦艽等龍膽科龍膽屬植物中,屬于環(huán)烯醚萜苷類單體化合物,具有治療風(fēng)濕、抗肝損傷及抗炎等功效[2,3].研究顯示,龍膽苦苷還發(fā)揮一定的抗腫瘤作用.鐘春蕾等[4]研究顯示,龍膽苦苷可抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞分泌炎癥因子及細(xì)胞侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,發(fā)揮抗肺癌作用.陳杰等[5]研究顯示,龍膽苦苷對卵巢癌SKOV3細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡起促進(jìn)作用,其可能通過抑制Nrf2通路發(fā)揮抗卵巢癌作用.然而,龍膽苦苷對胃癌的影響尚未見報(bào)道.

微小RNA-34c-5p(microRNA-34c-5p,miR-34c-5p)屬于微小RNA(microRNA,miRNA),其在在結(jié)腸癌[6]、骨肉瘤[7]和鼻咽癌[8]等腫瘤中表達(dá)降低,上調(diào)miR-34c-5p表達(dá)能夠抑制腫瘤細(xì)胞的惡性表型,進(jìn)而對腫瘤的發(fā)展進(jìn)程起抑制作用.有報(bào)道稱,miR-34c-5p在紫杉醇耐藥的胃癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),過表達(dá)miR-34c-5p可增加對紫杉醇耐藥的胃癌細(xì)胞的化學(xué)敏感性[9].然而,miR-34c-5p對胃癌細(xì)胞惡性表型的影響還未知.Starbase靶基因預(yù)測軟件顯示,X盒結(jié)合蛋白1(X-box binding protein-1,XBP1)可能是miR-34c-5p的靶基因.XBP1是有一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,參與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞細(xì)胞活性.有報(bào)道稱,XBP1在胃癌組織中表達(dá)升高,敲減其表達(dá)可降低胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[10].因此,本研究主要觀察了龍膽苦苷對胃癌細(xì)胞HGC-27增殖、遷移和侵襲的影響,并基于miR-34c-5p/XBP1軸探討了龍膽苦苷影響HGC-27細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的分子機(jī)制,以期為其用于胃癌的治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料 HGC-27細(xì)胞系,中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫;龍膽苦苷,純度＞98%,成都普菲德生物技術(shù)有限公司;RPMI 1640培養(yǎng)液、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)試劑盒、雙熒光素酶活性檢測試劑盒和二喹啉甲酸(bicinchoninicacid,BCA)蛋白檢測試劑盒,北京索萊寶;LipofectamineTM2000試劑盒,美國Invitrogen公司;miR-34c-5p抑制劑(anti-miR-34c-5p)和陰性對照序列(anti-miRNC)、miR-34c-5p模擬物(mimics)和模擬對照序列(miRNC),上海吉瑪制藥技術(shù);胎牛血清(fetal bovine serum,FBS),杭州四季青;RNA抽提試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒,大連寶生物;兔抗人XBP1和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體,美國Santa Cruz公司.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染:復(fù)蘇HGC-27細(xì)胞,加含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng).取對數(shù)期HGC-27細(xì)胞接種至6孔板中(2.5×105個(gè)/孔),培養(yǎng)12 h后,棄培養(yǎng)基.用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法,分別轉(zhuǎn)染miR-34c-5p mimics、miR-NC、anti-miR-34c-5p和anti-miR-NC至HGC-27細(xì)胞.轉(zhuǎn)染6 h后,更換為含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液,再培養(yǎng)24 h,收集細(xì)胞,實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RTqPCR)檢測細(xì)胞中miR-34c-5p表達(dá)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果,并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.2.2 細(xì)胞分組處理:HGC-27細(xì)胞分為對照組和不同劑量(6、30、150 μg/mL)GPS組,其中對照組細(xì)胞用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng),不同劑量(6、30、150 μg/mL)GPS組細(xì)胞分別用含6、30、150 μg/mL[11]GPS和10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng).轉(zhuǎn)染miR-34c-5p、miRNC的HGC-27細(xì)胞處理同對照組,分別記為miR-34c-5p組、miR-NC組.轉(zhuǎn)染anti-miR-34c-5p和anti-miR-NC的HGC-27細(xì)胞處理同150 μg/mL GPS組,分別記為150 μg/mL GPS+anti-miR-34c-5p組和150 μg/mL GPS+anti-miRNC組.

1.2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖:將HGC-27細(xì)胞及轉(zhuǎn)染miR-34c-5p mimics、miR-NC、anti-miR-34c-5p和antimiR-NC的HGC-27細(xì)胞均接種至96孔板中(2.5×104個(gè)/孔),培養(yǎng)4 h后,棄培養(yǎng)液,按1.2.2分組處理.培養(yǎng)一定時(shí)間(24 h、48 h和72 h)后,加10 μL CCK-8.孵育2 h,酶標(biāo)儀(λ=450 nm)測光密度(optical density,OD)值.

1.2.4 Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲:將HGC-27細(xì)胞及轉(zhuǎn)染miR-34c-5p mimics、miR-NC、anti-miR-34c-5p和anti-miR-NC的HGC-27細(xì)胞均接種至6孔板中(1.0×105個(gè)/孔),培養(yǎng)4 h后,棄培養(yǎng)液,按1.2.2分組處理.培養(yǎng)24 h后,收集各組細(xì)胞.遷移實(shí)驗(yàn):將Transwell小室置于24孔板中,將收集的各組細(xì)胞懸液分別加至上室(5.0×104個(gè)/孔),下室加500 μL培養(yǎng)液.培養(yǎng)24 h后,棄培養(yǎng)液,用多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色后,顯微鏡觀察,計(jì)數(shù).侵襲實(shí)驗(yàn):在Transwell小室上室鋪適量厚度的基質(zhì)膠,晾干后,加各組細(xì)胞懸液(5.0×104個(gè)/孔),后續(xù)操作同遷移實(shí)驗(yàn).

1.2.5 RT-q P C R檢測細(xì)胞中m i R-34c-5p表達(dá):將HGC-27細(xì)胞及轉(zhuǎn)miR-34c-5p mimics、miR-NC、antimiR-34c-5p和anti-miR-NC的HGC-27細(xì)胞均接種至6孔板中(1.0×105個(gè)/孔),培養(yǎng)4 h后,棄培養(yǎng)液,按1.2.2分組處理.培養(yǎng)24 h后,用miRNA抽提試劑盒提取細(xì)胞中總RNA.經(jīng)轉(zhuǎn)錄后,行PCR擴(kuò)增.引物序列:miR-34c-5p上游5'-GCTGCTGTAGGCAGTGTAGTTAG-3',下游5'-C T C A A C T G G T G T C G T G G A G T C-3';U6上游5'-C T C G C T T C G G C A G C A A-3',下游5'-AACGCTTCACGAATTGCGT-3'.2－△△Ct法計(jì)算miR-34c-5p相對U6的表達(dá)量.

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測XBP1蛋白表達(dá):將HGC-27細(xì)胞及轉(zhuǎn)miR-34c-5p mimics、miR-NC、anti-miR-34c-5p和anti-miR-NC的HGC-27細(xì)胞均接種至6孔板中(1.0×105個(gè)/孔),培養(yǎng)4 h后,棄培養(yǎng)液,按1.2.2分組處理.培養(yǎng)24 h后,用RIPA試劑提取細(xì)胞中總蛋白,并用BCA試劑盒對蛋白樣品定量.然后電泳、轉(zhuǎn)膜及封閉后,分別于XBP1(1:500)和GAPDH(1:1000)一抗孵育液4 ℃孵育過夜,洗膜后,再于山羊抗兔二抗(1:2000)孵育液中37 ℃孵育1 h.加顯影液避光顯影,拍照,Image J軟件進(jìn)行灰度分析,以XBP1與GAPDH灰度值的比值表示XBP1表達(dá)量.

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn):將HGC-27細(xì)胞接種至6孔板中(2.5×105個(gè)/孔),培養(yǎng)12 h后,棄培養(yǎng)液.用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法,分別共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-XBP1與miR-34c-5p mimics、WT-XBP1與miR-NC、MUT-XBP1與miR-34c-5p mimics、或MUT-XBP1與miR-NC至HGC-27細(xì)胞.轉(zhuǎn)染6 h后,更換為含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液,再培養(yǎng)24 h,收集細(xì)胞,加裂解液進(jìn)行裂解.離心(3500 r/min、10 min)后,取上清,檢測熒光素酶活性.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理SPSS 22.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù).計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,兩組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);多組間比較用單因素方差分析,進(jìn)一步兩組間比較用LSD-t檢驗(yàn).以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 龍膽苦苷對胃癌細(xì)胞HGC-27增殖的影響 與對照組比較,胃癌細(xì)胞HGC-27經(jīng)不同劑量(6、30、150 μg/mL)龍膽苦苷干預(yù)后,細(xì)胞活性明顯降低(P＜0.05),且呈劑量依賴性(圖1).

圖1 龍膽苦苷對胃癌細(xì)胞HGC-27增殖的影響.

2.2 龍膽苦苷對胃癌細(xì)胞HGC-27遷移和侵襲的影響與對照組比較,胃癌細(xì)胞HGC-27經(jīng)不同劑量(6、30、150 μg/mL)龍膽苦苷干預(yù)后,細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)均明顯降低(P＜0.05),且呈劑量依賴性(圖2).

2.3 龍膽苦苷對胃癌細(xì)胞HGC-27中miR-34c-5p和XBP1蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較,胃癌細(xì)胞HGC-27經(jīng)不同劑量(6、30、150 μg/mL)龍膽苦苷干預(yù)后,細(xì)胞中miR-34c-5p表達(dá)升高(P＜0.05),XBP1蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.05),且呈劑量依賴性(圖3).

圖3 龍膽苦苷對胃癌細(xì)胞HGC-27中miR-34c-5p和XBP1蛋白表達(dá)的影響.

2.4 過表達(dá)miR-34c-5p對胃癌細(xì)胞HGC-27增殖、遷移和侵襲的影響 與對照組或miR-NC組比較,miR-34c-5p組HGC-27細(xì)胞中miR-34c-5p表達(dá)明顯升高(P＜0.05),表明過表達(dá)miR-34c-5p的HGC-27細(xì)胞構(gòu)建成功.miR-34c-5p組胃癌細(xì)胞HGC-27活性、遷移數(shù)和侵襲數(shù)均明顯低于對照組或miR-NC組(P＜0.05)(圖4).

圖4 過表達(dá)miR-34c-5p對胃癌細(xì)胞HGC-27增殖、遷移和侵襲的影響.

2.5 miR-34c-5p靶向負(fù)調(diào)控XBP1 Starbase靶基因在線軟件預(yù)測顯示的miR-34c-5p與XBP1的結(jié)合位點(diǎn)見圖5A.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示,miR-34c-5p與WTXBP1共轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞HGC-27熒光素酶活性顯著降低(P＜0.05),而與MUT-XBP1共轉(zhuǎn)染后的胃癌細(xì)胞HGC-27熒光素酶活性無明顯變化(P＞0.05),提示miR-34c-5p可與XBP1靶向結(jié)合(圖5B).與對照組或miR-NC組比較,miR-34c-5p組胃癌細(xì)胞HGC-27中XBP1蛋白表達(dá)降低(P＜0.05)(圖5C).

圖5 miR-34c-5p靶向負(fù)調(diào)控XBP1.

2.6 敲減miR-34c-5p降低龍膽苦苷對胃癌細(xì)胞HGC-27增殖、遷移和侵襲的影響 與轉(zhuǎn)染anti-miR-NC的胃癌細(xì)胞HGC-27比較,轉(zhuǎn)染anti-miR-34c-5p的胃癌細(xì)胞HGC-27中miR-34c-5p表達(dá)明顯降低(P＜0.05),表明敲減miR-34c-5p的HGC-27細(xì)胞構(gòu)建成功;與150 μg/mL GPS組或150 μg/mL GPS+anti-miR-NC組比較,150 μg/mL GPS+anti-miR-34c-5p組胃癌細(xì)胞HGC-27活性、遷移數(shù)和侵襲數(shù)及細(xì)胞中XBP1蛋白表達(dá)均明顯升高(P＜0.05),表明敲減miR-34c-5p可降低龍膽苦苷對胃癌細(xì)胞HGC-27增殖、遷移和侵襲及XBP1蛋白表達(dá)的抑制作用(圖6).

圖6 敲減miR-34c-5p降低龍膽苦苷對HGC-27細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及XBP1蛋白表達(dá)的影響.

3 討論

近年來,中草藥或天然植物及其活性成分在腫瘤治療中的作用備受關(guān)注.龍膽苦苷是龍膽草、秦艽等龍膽科龍膽屬植物的主要活性成分,具有多種藥理活性.研究顯示,龍膽苦苷可抑制肝癌細(xì)胞增殖,并阻滯肝癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程[12];龍膽苦苷可阻礙人上皮性卵巢癌HO8910細(xì)胞增殖和遷移,并促進(jìn)HO8910細(xì)胞凋亡,其可能通過激活P38絲裂原活化蛋白激酶M信號通路發(fā)揮作用[13].本研究將不同劑量(6、30、150 μg/mL)的龍膽苦苷作用于胃癌細(xì)胞HGC-27,首次探究了龍膽苦苷對胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響,結(jié)果顯示,龍膽苦苷可呈劑量依賴性降低胃癌細(xì)胞HGC-27的增殖、遷移和侵襲能力,提示其具有治療胃癌的潛在價(jià)值.

miRNA是一類小分子非編碼RNA,其可靶向靶基因的表達(dá)參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等惡性表型,為腫瘤的治療提供了分子靶點(diǎn)[14].研究顯示,miR-34c-5p在骨肉瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)降低,過表達(dá)miR-34c-5p可通過靶向抑制脂筏標(biāo)記蛋白-2(flotillin-2,FLOT2)削弱骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,是骨肉瘤治療的潛在分子靶點(diǎn)[15].本研究通過將miR-34c-5p模擬物轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞HGC-27中,觀察了過表達(dá)miR-34c-5p對HGC-27細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響,結(jié)果顯示,過表達(dá)miR-34c-5p可顯著降低HGC-27細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力,提示miR-34c-5p也可能成為胃癌治療的分子靶點(diǎn).本研究結(jié)果還顯示,龍膽苦苷可呈劑量依賴性促進(jìn)胃癌細(xì)胞中miR-34c-5p的表達(dá),而敲減miR-34c-5p降低了龍膽苦苷對胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用,提示龍膽苦苷可能通過上調(diào)細(xì)胞中miR-34c-5p表達(dá)來抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲.

為了進(jìn)一步探究龍膽苦苷可能通過上調(diào)細(xì)胞中miR-34c-5p表達(dá)來抑制胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的分子機(jī)制,本研究證實(shí)了XBP1是miR-34c-5p的靶基因,且過表達(dá)miR-34c-5p抑制胃癌細(xì)胞中XBP1蛋白表達(dá).XBP1參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移及耐藥,其過度表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生及促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[16].本研究結(jié)果還顯示,龍膽苦苷可抑制胃癌細(xì)胞中XBP1蛋白表達(dá),而敲減miR-34c-5p降低龍膽苦苷對胃癌細(xì)胞中XBP1蛋白表達(dá)的抑制作用,進(jìn)一步提示龍膽苦苷可能通過調(diào)控miR-34c-5p/XBP1軸來影響胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲.

4 結(jié)論

綜上,龍膽苦苷對胃癌細(xì)胞HGC-27的增殖、遷移和侵襲具有一定的抑制作用,其作用機(jī)制可能與上調(diào)細(xì)胞中miR-34c-5p表達(dá)進(jìn)而抑制XBP1蛋白表達(dá)有關(guān),具有治療胃癌的潛在價(jià)值.但本研究僅通過體外單細(xì)胞進(jìn)行了探究,還需要增加細(xì)胞種類及進(jìn)一步通過裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)驗(yàn)證龍膽苦苷對胃癌發(fā)生發(fā)展的影響和機(jī)制.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

胃癌發(fā)病隱匿,治療療效不佳,尋找用于胃癌治療的藥物尤為重要.龍膽苦苷(gentiopicroside,GPS)具有抗肝癌、肺癌和卵巢癌功效,但其能否發(fā)揮抗胃癌作用還未知.本研究探究GPS對胃癌細(xì)胞HGC-27增殖、遷移和侵襲的影響及可能機(jī)制,為其用于胃癌的治療提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù).

實(shí)驗(yàn)動機(jī)

觀察GPS對胃癌細(xì)胞HGC-27增殖、遷移和侵襲的影響及其能否通過調(diào)控微小RNA-34c-5p(microRNA-34c-5p,miR-34c-5p)/X盒結(jié)合蛋白1(X-box binding protein-1,XBP1)軸發(fā)揮作用,以探究GPS是否具有抗胃癌作用及其可能的機(jī)制.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

本研究主要是為了明確GPS能否通過調(diào)控miR-34c-5p/XBP1軸影響胃癌細(xì)胞HGC-27的增殖、遷移和侵襲能力,并進(jìn)一步通過裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)在體內(nèi)驗(yàn)證GPS對胃癌發(fā)生發(fā)展的影響,以期為胃癌治療藥物的研發(fā)提供新途徑.

實(shí)驗(yàn)方法

本研究采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)法、Transwell、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)、蛋白質(zhì)印跡法依次檢測了細(xì)胞增殖、遷移和侵襲、細(xì)胞中miR-34c-5p表達(dá)、XBP1蛋白表達(dá).此外,用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證了miR-34c-5p和XBP1靶向調(diào)控關(guān)系.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,一定濃度的GPS可降低胃癌細(xì)胞HGC-27的增殖、遷移和侵襲能力,其作用機(jī)制可能與上調(diào)細(xì)胞中miR-34c-5p表達(dá)進(jìn)而抑制XBP1表達(dá)有關(guān).

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

本研究首次發(fā)現(xiàn),GPS可在一定程度上抑制胃癌細(xì)胞HGC-27增殖、遷移和侵襲,且作用機(jī)制與調(diào)控miR-34c-5p/XBP1軸有關(guān),具有治療胃癌的潛在價(jià)值.

展望前景

本研究僅通體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了初步探究,尚需進(jìn)一步在體內(nèi)驗(yàn)證GPS對胃癌發(fā)生發(fā)展的影響和機(jī)制.通過探究GPS對胃癌發(fā)生發(fā)展的影響可能為胃癌治療藥物的研發(fā)提供新途徑.