豬源丁酸梭菌DSY-1產(chǎn)芽孢高密度發(fā)酵條件優(yōu)化

杜全能 區(qū)毅恒 余杰豪 劉子恒 史寶軍

摘要：為獲取丁酸梭菌芽孢高密度發(fā)酵工藝，以丁酸梭菌DSY-1為試驗材料，以芽孢數(shù)為指標，通過單因素試驗，探究碳源、氮源、接種量、初始pH值、培養(yǎng)溫度和正交試驗，并通過5 L發(fā)酵罐進行中和劑選擇。結(jié)果表明，菌株DSY-1以C6H12O6 30 g/L、酵母提取粉10 g/L、NaCl 5 g/L、乙酸鈉 5 g/L、K2HPO4 3 g/L、MgSO4·7H2O 0.3 g/L、L-半胱氨酸酸鹽 0.5 g/L為發(fā)酵培養(yǎng)基，初始pH值為6.5，培養(yǎng)溫度為35 ℃，接種量為2.5%，5 L發(fā)酵灌發(fā)酵使用12.5%氨水作中和劑時，菌株 DSY-1 芽孢數(shù)最大，達9.3億CFU/mL。

關(guān)鍵詞：丁酸梭菌;正交試驗;芽孢生物量;發(fā)酵工藝

中圖分類號：S182 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2021）16-0148-05

隨著我國養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，養(yǎng)殖模式已經(jīng)轉(zhuǎn)向集約化、規(guī)?；l(fā)展。為了減少病害，人們在飼料中添加抗生素，雖起到了促進動物生長的作用，但也造成了抗生素的濫用。我國每年約8 000 t的抗生素被用于動物疾病預(yù)防和治療[1]。在禁抗大背景下，禁抗替抗已成為養(yǎng)殖行業(yè)持續(xù)健康發(fā)展和食品安全的重點話題。近年來，益生菌作為替抗產(chǎn)品，乳酸菌、枯草芽孢桿菌、酵母菌等已被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)中[2-3]。

丁酸梭菌（Clostridium butyricum）屬于梭菌科梭菌屬，為革蘭氏陽性厭氧桿菌，具有耐胃酸、耐膽鹽特性。自1933年，日本Miyairy博士首次從糞便中分離出丁酸梭菌便引起了科學家廣泛關(guān)注。目前，丁酸梭菌被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖行業(yè)中。研究發(fā)現(xiàn)，在基礎(chǔ)日糧中添加丁酸梭菌能夠增強機體的免疫力、提高抗氧化性能[3-4]、改善肉品質(zhì)[5-6]和腸道組織形態(tài)[7-11]、抑制腸道中有害菌群、提高有益菌群豐度[11-12]。

目前，制約丁酸梭菌微生態(tài)制劑大規(guī)模生產(chǎn)的主要因素是制備過程中菌體量和芽孢量過低。本試驗采用單因素試驗和正交試驗優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基和5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)優(yōu)化，探究對丁酸梭菌芽孢產(chǎn)量的影響，為丁酸梭菌芽孢的高密度發(fā)酵提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 丁酸梭菌DSY-1由筆者所在實驗室篩選獲得。

1.1.2 培養(yǎng)基 種子液：蛋白胨10 g/L、牛肉膏 10 g/L、葡萄糖5 g/L、氯化鈉 5 g/L、可溶性淀粉 1 g/L、乙酸鈉3 g/L、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L。pH值7.0±0.1，121 ℃滅菌20 min。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取粉 5 g/L、NaCl 10 g/L。固體培養(yǎng)基加20 g/L瓊脂。121 ℃滅菌20 min。

LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取粉5 g/L、NaCl 10 g/L、20 g/L瓊脂。121 ℃滅菌20 min。

活化培養(yǎng)基：同種子液，加20 g/L瓊脂。pH值 7.0±0.1，121 ℃滅菌20 min。

芽孢計數(shù)培養(yǎng)基：下層為TSC培養(yǎng)基+5 g/L瓊脂，上層：18 g/L海藻酸鈉+30 g/L TSC培養(yǎng)基。121 ℃滅菌20 min。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：C6H12O6 30 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 5 g/L、乙酸鈉 5 g/L、K2HPO4 3 g/L、MgSO4·7H2O 0.3 g/L、L-半胱氨酸酸鹽 0.5 g/L，pH值6.4±0.1，115 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試驗藥品 蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、可溶性淀粉、瓊脂（BR），廣東環(huán)凱生物科技有限公司生產(chǎn);K2HPO4、MgSO4·7H2O、C6H12O6、NaCl、乙酸鈉、L-半胱氨酸鹽酸鹽、海藻酸鈉（AR），國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn);TSC培養(yǎng)基，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.1.4 試驗儀器 雷磁pH計（pH-3C），上海儀電科學儀器股份有限公司生產(chǎn);厭氧袋（C-11），日本三菱公司生產(chǎn);鼓風干燥箱（DHG-9246A），上海精宏實驗設(shè)備有限公司生產(chǎn);恒溫培養(yǎng)箱（DNP-9052），上海精宏實驗設(shè)備有限公司生產(chǎn);高壓滅菌鍋（YXQ-LS-100S），上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn);顯微鏡（CX-23），日本奧林巴斯;電子天平（ME204E），梅特勒-托利多儀器有限公司生產(chǎn);超凈工作臺（SW-CJ-ID），蘇州凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化及種子液制備 吸取于-80 ℃甘油管保藏的菌種DSY-1 1 mL，接種于液體種子液中，并置于厭氧培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng) 將培養(yǎng)24 h的種子液按3 ∶ 100（體積比）接種于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，置于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

1.2.3 芽孢計數(shù) 芽孢計數(shù)方法與李雯靜等的方法[13]相同。

1.2.4 不同因素對菌株DS-1芽孢產(chǎn)量的影響 為了探究菌株DSY-1最佳碳源，選取淀粉、乳糖、蔗糖、麥芽糖來替換基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖，添加量均為1%;在最佳氮源選擇試驗中，選取牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸銨來替換基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源，添加量均為3%;為了研究接種量對菌株 DSY-1 芽孢產(chǎn)量的影響，分別以體積分數(shù)為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3%的接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中;為了探究初始pH值對菌株芽孢產(chǎn)量的影響，利用3 mol/L HCl或3 mol/L NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的pH值至5.5、6.0、6.5、7.0、7.5;上述試驗接種量均為2.5%，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。在上述試驗的基礎(chǔ)上，探究不同培養(yǎng)溫度對菌株DSY-1生長的影響，將發(fā)酵培養(yǎng)基置于25、30、35、40、45 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以上所有試驗均進行3次重復(fù)。

1.2.5 正交試驗 在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用正交試驗優(yōu)化菌株DSY-1產(chǎn)芽孢最佳條件。本試驗選取初始pH值（A）、培養(yǎng)溫度（B）、接種量（C）3個對菌株產(chǎn)芽孢影響較大的因素，對其進行3因素3水平試驗，以確定上述3因素對菌株DSY-1產(chǎn)芽孢最佳組合，其正交試驗設(shè)計見表1。

1.2.6 5 L發(fā)酵罐發(fā)酵試驗 在“1.2.5”節(jié)試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上配制培養(yǎng)基，裝液量70%，接種量3%，轉(zhuǎn)速50 r/min，培養(yǎng)溫度為35 ℃，培養(yǎng)時間為48 h。發(fā)酵過程不控制pH值自然發(fā)酵;發(fā)酵過程中前 24 h，用12.5%氨水將pH值維持在6.5±0.2。

1.2.7 不同中和劑對菌株DSY-1芽孢產(chǎn)量的影響 在上述單因素試驗和正交試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以12.5%、25.0%、50.0%氨水，3 mol/L NaOH、3 mol/L Ca（OH）2、3 mol/L KOH調(diào)節(jié)pH值。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 使用Excel統(tǒng)計數(shù)據(jù)，采用統(tǒng)計軟件SPSS 25中的One-Way ANOVA進行單因素方差分析，用Turkey多重比較法對處理間的差異性進行比較分析，結(jié)果以“平均值±標準差”表示，P<0.05為差異顯著。采用GraphPad Prism 8.0.1作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株DSY-1菌落形態(tài)與菌體形態(tài)

菌株DSY-1在計數(shù)平板上的菌落形態(tài)見圖1，菌落表面光滑、不透明，呈黑色。菌體形態(tài)見圖2，為革蘭氏陽性菌，有芽孢產(chǎn)生，菌體成桿狀。

2.2 不同碳源對菌株DSY-1產(chǎn)芽孢的影響

碳源作為細胞合成的骨架和能量來源，在細胞生長過程中起著重要的作用。從圖3中可以看出，麥芽糖和乳糖對菌株產(chǎn)芽孢不存在顯著性差異（P>0.05），其余碳源對菌株DSY-1產(chǎn)芽孢存在顯著性差異（P<0.05）。其中，淀粉、乳糖、蔗糖和麥芽糖4種碳源屬于多糖和雙糖，菌株 DSY-1 對其利用均低于葡萄糖。在以葡萄糖為唯一碳源時，菌株 DSY-1 芽孢產(chǎn)量最大，可達（2.40±0.10）億CFU/mL，因此采用葡萄糖作為唯一碳源進行后續(xù)試驗。

2.3 不同氮源對菌株DSY-1芽孢產(chǎn)量的影響

氮是構(gòu)成微生物細胞的蛋白質(zhì)及核酸的主要物質(zhì)。從圖4可以看出，5種氮源對菌株DSY-1芽孢產(chǎn)量存在顯著影響（P<0.05）。5種氮源中芽孢產(chǎn)量從大到小表現(xiàn)為酵母提取粉>蛋白胨>牛肉膏>尿素>硫酸銨，可能是由于丁酸梭菌生長需要的營養(yǎng)比較復(fù)雜，而無機氮無法提供。酵母提取粉為唯一氮源時，菌株芽孢數(shù)最大，達（3.47±0.25）億CFU/mL。

2.4 接種量對菌株DSY-1芽孢產(chǎn)量的影響

接種量可以影響菌體增殖的速度，適當?shù)慕臃N量能夠縮短菌體的延滯期。從圖5可以看出，隨著接種量的增加，菌株DSY-1芽孢產(chǎn)量呈先上升后下降的趨勢，在接種量為3%時，芽孢產(chǎn)量達到最大。接種量低，引起菌株延滯期過長;而當接種量超過3%時，或許由于菌體生長過快，培養(yǎng)基中pH值下降，造成酸脅迫效應(yīng);在接種量為3%時，菌株DSY-1獲得的芽孢最多，為（4.47±0.04）億CFU/mL。

2.5 不同初始pH值對菌株DSY-1芽孢產(chǎn)量的影響

由圖6可知，在初始pH值5.5～7.5之間，菌株芽孢產(chǎn)量存在顯著差異（P<0.05）;而在初始pH值6.0～6.5之間，菌株DSY-1芽孢產(chǎn)量不存在顯著差異（P>0.05）?？梢姡闐SY-1適合在弱酸性條件下生長，且菌株DSY-1在初始pH值6.5時具有最大芽孢產(chǎn)量，為（4.47±0.18）億CFU/mL。

2.6 不同培養(yǎng)溫度對菌株DSY-1芽孢產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)溫度對菌株DSY-1芽孢產(chǎn)量存在顯著性影響（P<0.05），從圖7可以看出，隨著培養(yǎng)溫度升高 菌株芽孢產(chǎn)量呈先上升后下降的趨勢。培養(yǎng)溫度過低或過高可能影響菌株DSY-1代謝活動，進而影響菌體的生長;在溫度為35 ℃時，菌株芽孢產(chǎn)量達到最大，為（5.82±0.10）億CFU/mL。

2.7 正交試驗結(jié)果

從表2可以看出，以芽孢產(chǎn)量為指標，通過正交試驗發(fā)現(xiàn)，影響菌株DSY-1芽孢產(chǎn)量因素表現(xiàn)為培養(yǎng)溫度>初始pH值>接種量，最優(yōu)組合為A2B2C3，即發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值為6.5，培養(yǎng)溫度為35 ℃，接種量為2.5%時，菌株DSY-1具有最大芽孢產(chǎn)量。

2.8 自然發(fā)酵與控pH值發(fā)酵

從表3可以看出，用50%氨水控制pH值6.5發(fā)酵芽孢數(shù)是自然發(fā)酵的1.7倍，可見酸脅迫嚴重抑制菌株DSY-1的生長，而通過控制發(fā)酵pH值可大幅度提高芽孢產(chǎn)量。

2.9 不同中和劑對菌株DSY-1芽孢產(chǎn)量的影響

從圖8可以看出，不同中和劑對菌株DSY-1產(chǎn)芽孢存在顯著性影響（P<0 .05）。以12.5%氨水為中和劑時，菌株DSY-1具有最大的芽孢產(chǎn)量。而當氨水為25%和50%時，芽孢產(chǎn)量均低于12.5%氨水，可能是由于氨濃度過高不能及時中和，導致發(fā)酵液中游離氨濃度升高，進而抑制菌體生長。當以NaOH和Ca（OH）2、KOH作為中和劑時，效果均低于氨水。可能是由于鹽離子影響細胞內(nèi)外滲透壓，不利于菌體的生長。因此，選用12.5%氨水作為中和劑進行控pH值。

3 討論與結(jié)論

本次碳源試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以葡萄糖作為唯一碳源時，菌株DSY-1具有最佳芽孢產(chǎn)量，這與徐瑩等研究結(jié)果[14-16]一致。也有研究者發(fā)現(xiàn)，可溶性淀粉[17]、麥芽糖[18]作為唯一碳源時，丁酸梭菌具有最大的芽孢產(chǎn)量。李雯靜等認為，面粉和米粉作為混合碳源時，可獲得最大的芽孢產(chǎn)量。可見，不同菌株對于碳源的利用情況有所差異[13]。

菌株DSY-1在以酵母提取粉為唯一氮源時，具有最大的芽孢產(chǎn)量，這與邢宏觀等的研究結(jié)果[17]一致。而徐瑩等認為，以胰蛋白胨為唯一氮源時具有最大的芽孢產(chǎn)量[14]。而菌株HDRyYB1[13]以魚粉、酵母粉作為混合氮源時，具有最大的芽孢產(chǎn)量。史禎暉研究發(fā)現(xiàn)，菌株SHYY088以酵母自溶粉和酵母浸膏作為混合氮源時，具有最大的芽孢產(chǎn)量[18]。接種量過高或過低均影響菌株的生長，接種量過大使得代謝產(chǎn)物積累過快，造成酸脅迫;而過小則引起延滯期過長，本試驗結(jié)果與胡曉龍等結(jié)論[19]相似。

初始pH值和培養(yǎng)溫度是制約丁酸梭菌高密度生長的重要因素，過低或過高的初始pH值會改變細胞膜的通透性，進而影響菌體的生長和代謝;而培養(yǎng)溫度則影響生物體重酶的活性，從而造成菌體代謝緩慢。有研究認為，初始pH值在7.2～7.4[13]、7.3[16]時，菌株具有最大的芽孢產(chǎn)量。趙旭冬研究發(fā)現(xiàn)，通過補堿使pH值維持在6.8，所得芽孢數(shù)高于自然發(fā)酵[15]。史禎暉認為，pH值6.5更適合菌株生長[18]。而Li等發(fā)現(xiàn)，在初始pH值 6.0～7.5對丁酸梭菌NN-2活菌數(shù)和產(chǎn)芽孢數(shù)均無顯著性影響（P>0.05）[20]。本試驗結(jié)果與趙旭冬研究結(jié)論[15]相一致，在pH值為6.8時能夠獲得最多芽孢。本試驗發(fā)現(xiàn)，菌株DSY-1在35 ℃下，產(chǎn)芽孢量達到最大。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，丁酸梭菌在 32 ℃[18]、37 ℃[16]具有最大芽孢產(chǎn)量。

在發(fā)酵過程中調(diào)控pH值有利于緩解酸脅迫，利于菌體的生長。眾多研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵過程中通過調(diào)控pH值有利于菌體的生長[14-15，21]，這與本試驗結(jié)果相一致。

通過單因素試驗和正交試驗確定碳源、氮源、培養(yǎng)條件對丁酸梭菌DSY-1產(chǎn)芽孢的影響。在以葡萄糖和酵母提取粉分別作為唯一碳源和氮源，培養(yǎng)溫度為35 ℃、初始pH值為6.5，接種量為2.5%時，菌株DSY-1具有最大的芽孢產(chǎn)量。在5 L發(fā)酵試驗中，通過使用12.5%氨水在發(fā)酵前 24 h使pH值維持在6.5，使得芽孢數(shù)是自然發(fā)酵的1.7倍，最終芽孢產(chǎn)量為（9.30±0.09）億CFU/mL。

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