光譜校正在遺傳測序儀操作中的應用

趙世鵬 張雪萍 王相輝

(濰坊眾誠司法鑒定所，山東 濰坊 261000)

1 法醫(yī)物證鑒定

1.1 法醫(yī)物證鑒定技術(shù)

法醫(yī)物證鑒定是指鑒定人運用法醫(yī)物證學的科學技術(shù)或者專門知識，對各類生物檢材進行鑒別和判斷并提供鑒定意見的活動。法醫(yī)物證鑒定技術(shù)發(fā)展迅速，不僅能夠在偵查中提供偵查線索，而且能在法院審判過程中作為判決依據(jù),在司法領(lǐng)域被廣泛應用，在司法實踐中發(fā)揮著前所未有的重要作用。

基因測序是法醫(yī)物證鑒定的核心技術(shù)。從1977 年的第一代Sanger 測序技術(shù)發(fā)展至今，基因測序已經(jīng)有40 年的發(fā)展歷史。1987 年，基于Sanger 測序原理Applied Biosciences 公司發(fā)布第一臺自動測序儀，第一代測序讀長長，準確率高，后來成為人類基因組計劃的主力機型，現(xiàn)在依然是測序的金標準。第一代測序雖然準確度高，但是存在成本大、通量低等缺點，制約其廣泛應用。經(jīng)過改進，以羅氏454、illumina、Life 的Solid 系統(tǒng)為主的第二代測序技術(shù)出現(xiàn)，促使測序成本以超摩爾定律下降，測序速度大幅提高。第三代測序技術(shù)是單分子測序，由于不需要對樣本進行擴增等前期準備工作，測序時間大幅縮小，理論準確性將提高，成本進一步下降，相比于二代測序技術(shù)優(yōu)勢明顯，但是由于準確性低、測序信號易丟失等問題，目前尚在科研階段。

二代基因測序儀是目前法醫(yī)物證鑒定中使用的主要設(shè)備，其應用的主要技術(shù)為毛細管凝膠電泳與熒光檢測[1]。

電泳的定義：利用帶電粒子在電場中移動速度不同而達到分離的技術(shù)稱為電泳技術(shù)。傳統(tǒng)電泳(瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等)通常需要制膠、上樣、分離、染色/脫色等操作，過程冗長，不適合定量分析，而且在電泳分離過程中，焦耳熱的產(chǎn)生使電解質(zhì)溶液的密度發(fā)生變化，導致分離度下降。1983，Hjerten將聚丙烯酰胺凝膠電泳移植，制成了毛細管凝膠電泳(CGE)，使得DNA 片段分離在毛細管電泳中成為可能。隨后高效毛細管電泳技術(shù)應運而生，高效毛細管電泳是以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅(qū)動力，以樣品的電荷、大小、形狀等多種特性為根據(jù)的分離技術(shù)。

熒光檢測原理：熒光是染料分子并檢測染料被激發(fā)后產(chǎn)生的光，能夠發(fā)射熒光的分子叫熒光基團，是具有不同形狀、大小和發(fā)光能力的分子。用于DNA 標記的熒光基團發(fā)射光的波長一般在400－600nm 的范圍內(nèi)。熒光的發(fā)光過程分三步，首先激發(fā)光源發(fā)出一個光子將熒光基團從基態(tài)激發(fā)到激發(fā)態(tài)，然后該熒光基團構(gòu)象變化及與環(huán)境作用后進入單一激發(fā)態(tài)，最后激發(fā)態(tài)的電子發(fā)出一個能量較低的光子并回到基態(tài)。吸收光譜與發(fā)射光譜峰的頂點之間產(chǎn)生一個差值稱為司多克斯遷移。使用光譜過濾將激發(fā)光和發(fā)射光區(qū)別開，并且通過發(fā)射光譜的區(qū)別可以選擇不同的熒光基團，這種特性的存在使利用多種熒光基團同時檢測不同的DNA 分子稱為可能。熒光基團發(fā)光效率會受到摩爾消光系數(shù)、量子產(chǎn)率、光穩(wěn)定性、染料環(huán)境的綜合作用影響。激光轟擊熒光基團，熒光基團吸收激光能量，然后發(fā)出較低能量(較大波長)的光，用濾光片僅收集特定波長或波長范圍的發(fā)射光，用電偶合裝置收集和放大來自熒光基團的信號，并把它轉(zhuǎn)換成電信號。用相對熒光強度單位計量信號，生成毛細管電泳圖。不同熒光染料發(fā)射光譜的不同，不同位點的引物用不同的熒光基團標記，使不同位點的擴增產(chǎn)物帶有不同的熒光標記，檢測儀器發(fā)射特定波長激光，激發(fā)熒光分子使其發(fā)射特定波長范圍的光，儀器收集該發(fā)射熒光，并將光信號轉(zhuǎn)化為電信號，再轉(zhuǎn)化為數(shù)字信號，收集軟件將信號以掃描峰的形式顯現(xiàn)出來。[2]

1.2 光譜校正的原理(圖1-2)

圖1

在ABI310 上最初稱謂是Matrix 校正，在多毛細管系統(tǒng)上稱為光譜校正。光譜校正主要是解決光譜空間到染料空間的映射問題。不同的熒光染料其發(fā)射光譜一般會部分重疊，也可以說光譜校正就是修正不同染料發(fā)射光譜之間疊加的一個數(shù)學矩陣。多色熒光檢測需要檢測四到五種熒光分子在其中心發(fā)射波長處的信號。由于每種熒光分子的發(fā)射光譜不是銳線光譜，而是有一定寬度分布的光譜帶，所以一種純熒光分子除在它自己的中心波長處能采集到信號外，在其他熒光分子的中心波長處也能檢測到信號，導致信號重疊。為了消除這些重疊的信號，需要知道每種熒光信號在其他熒光信號處的重疊系數(shù)。所以，用分別標記有不同熒光分子的四(或五)條不同長度的DNA 片斷(即光譜校正標準品)來測定這些系數(shù)，得到一個4×4(或5×5)的矩陣。進行樣品檢測時，軟件會自動將收集到的樣品數(shù)據(jù)與光譜進行比較；通過比較，每個色道其他染料產(chǎn)生的信號將被扣除，因此補償了光譜間的疊加。[3]通過分析光譜校正的標準品，數(shù)據(jù)收集軟件利用數(shù)學矩陣進行計算，使每一種被校準的染料在多通道毛細管測序儀上呈現(xiàn)單一峰形。

圖2

2 光譜校正的實際應用

2.1 測序儀何時需進行光譜校正(圖3)

圖3 基線不平，需進行光譜校正

建立與熒光染料相適應的光譜校正，能夠防止發(fā)生相鄰染料通路之間的滲透，STR 試劑盒生產(chǎn)商都會提供與試劑盒標記引物熒光染料相同的特定DNA 樣本作為標準品。不同的STR 試劑盒有不同的染料組合，在測序時，相應的STR 試劑盒必須用與之相匹配的染料組合進行光譜校正，否則將不能正常的收集數(shù)據(jù)。染料標記的DNA 分子數(shù)量過多時，飽和的CCD 檢測信號也會產(chǎn)生拔起現(xiàn)象。在實際操作中，遇到以下幾種情況時，通常需要對儀器進行光譜校正：(1)使用新的熒光染料組合；(2)激光或CCD 被調(diào)節(jié)或更換后；(3)參數(shù)改變、更換毛細管或者調(diào)整光路后；(4)不同顏色的熒光間出現(xiàn)干擾(有拔起或下壓峰)，檢測圖譜基線不平，峰形明顯異常。

2.2 如何進行光譜校正操作及評價(圖4)

圖4 光譜校正通過

2.2.1 光譜校正步驟

2.2.1.1 按所用STR 試劑盒的說明書，準備光譜校準的標準品試劑，并創(chuàng)建光譜校準操作流程(Spectral Protocol)和運行模式(Spectral Run Module)。

2.2.1.2 按STR 試劑盒說明書，創(chuàng)建光譜校準板并運行。

2.2.1.3 評價選定毛細管的光譜圖譜和原始數(shù)據(jù)。

2.2.1.4 對符合要求的光譜校準文件進行重命名并保存。

2.2.2 光譜校正的評價參數(shù)及標準

2.2.2.1 Q 值：Q 值表示得到的matrix 與理論值間一致性的參數(shù)。Q 值為1.0 表示實際matrix 與理論值完全相符，無任何pulldown 或pull－up 峰。minQ 表示對pull-up 或pull-down 峰的容忍度。默認值為0.95。進行光譜校正后，軟件會自動計算得到每根毛細管的Q 值，Q 值小于minQ(0.95)時，校正失敗。

2.2.2.2 C 值：表示染料組合中各染料發(fā)射光譜的染料峰的重疊程度。若染料峰間無重疊，則C 值為1.0,為最低可能值。隨重疊程度增加，C 值相應增大。

2.2.2.3 確認光譜中峰的順序從左至右為橙- 紅- 黃- 綠-藍。

2.2.2.4 查看光譜圖譜中，反應板圖形中通過的毛細管數(shù)量(不通過，即黃褐色的反應孔≤3 個)。確認光譜中的峰不含大范圍交迭、傾斜或其它不規(guī)則現(xiàn)象。

3 結(jié)論

測序儀在完成初始的空間校準和光譜校正后，便可以收集數(shù)據(jù)并計算生成DNA 圖譜。伴隨時間遷移，光譜校正的效果也會發(fā)生變化，因此需要定期對測序儀進行光譜校正。法醫(yī)物證鑒定應用越來越廣泛，作為法醫(yī)物證鑒定人員，應該深入了解測序儀工作原理，這樣才能有針對性的解決實際工作中遇到的各種問題。光譜校正作為測序儀穩(wěn)定性的重要指標之一，作為鑒定人員應該熟悉常出現(xiàn)的問題，以及掌握光譜校正的操作，確保能夠穩(wěn)定的收集到準確的實驗數(shù)據(jù)。