基于Nafion-聚莧菜紅-石墨烯納米復合膜修飾玻碳電極的一氧化氮生物醫(yī)學傳感

吳 穎， 楊 寧， 金 劍， 朱春楠， 鄭冬云*

(1.武漢市第一醫(yī)院，湖北武漢 430074；2.中南民族大學生物醫(yī)學工程學院，湖北武漢 430074；3.中南民族大學腦認知國家民委重點實驗室，湖北武漢 430074；4.醫(yī)學信息分析及腫瘤診療湖北省重點實驗室，湖北武漢 430074)

作為一種神經遞質和血管舒張因子，一氧化氮(Nitric Oxide,NO)廣泛存在于人體各組織器官中，在神經信息傳遞、心肺功能維持、臟器血流調節(jié)、內分泌調節(jié)、機體防御免疫功能發(fā)揮以及細胞凋亡調節(jié)等諸多方面都起著舉足輕重的作用。一些疾病的發(fā)生，通常都與體內NO的濃度異常有關，如動脈粥樣硬化[1]、哮喘[2]、腸炎[3]、腫瘤[4]等。因此，實現對生物樣品中NO含量的準確檢測，具有重要的生物醫(yī)學意義和臨床價值?，F已提出的NO檢測方法有很多種，包括電子自旋共振光譜法[5]、化學發(fā)光法[6]、熒光法[7]及生物醫(yī)學傳感法[8]等。其中，生物醫(yī)學傳感法因具有靈敏度高、操作簡便、檢測快速等優(yōu)點而備受關注。近年來，NO生物醫(yī)學傳感器的研究主要集中于新型NO敏感功能材料的制備及其應用[9]。

石墨烯(Graphene,GR)，是一種擁有二維原子共軛結構的新型碳納米材料，具有大比表面積、高機械強度、優(yōu)良的導電和導熱性能，在生物醫(yī)學傳感領域應用廣泛，已有報道將其應用于多巴胺[10]、同型半胱氨酸[11]、抗壞血酸[12]、5-羥色胺[13]等的電化學生物傳感。將石墨烯應用于NO生物醫(yī)學傳感方面的研究也已見報道，如Yoon等于近年研發(fā)了一種基于氨基功能化MoS2納米顆粒-氧化石墨烯-肌紅蛋白修飾金電極的NO電流型生物傳感器[14]，該傳感器具有較低的檢出限，但操作較復雜。因此，繼續(xù)探索石墨烯在NO生物醫(yī)學傳感方面的應用依然非常必要。

莧菜紅(Amaranth Red,AR)是一種水溶性偶氮合成染料，作為食品著色劑在飲料和食品工業(yè)中應用廣泛，在增加產品外觀和吸引力方面表現突出[15]。但過量食用莧菜紅會嚴重影響機體健康[16 - 18]，因此，目前關于莧菜紅的研究，大多集中于其在食品中含量的簡單高效測定[19]，而將其制備成聚合物薄膜并用作電極修飾材料的工作卻鮮見報道。Chandra等最早提出了聚莧菜紅薄膜在電化學傳感領域的應用[20]，該課題組首次制得了聚莧菜紅薄膜，并基于該薄膜修飾鉛筆芯電極，研發(fā)出了一種性能良好的多巴胺電化學傳感器，該傳感器可在尿酸共存的條件下，實現對多巴胺的選擇性檢測。聚莧菜紅薄膜在該工作中所展現的顯著電催化性能預示了其在生物醫(yī)學傳感領域的良好應用前景。

本文中制備了一種新型NO敏感功能薄膜，薄膜由Nafion-聚莧菜紅(PAR)-氧化石墨烯(GO)共同組成，并借助于簡單可控的滴涂成膜法和電化學聚合法將其固定于玻碳電極表面，構建了一種性能良好的NO電化學傳感器。對NO在傳感界面上的電化學反應機理進行了探討，并對傳感器的各項性能進行了考察。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

電化學實驗在CHI660D電化學工作站(上海辰華儀器公司)上完成，采用三電極系統(tǒng)：以玻碳電極(GCE)或修飾的GCE作為工作電極，飽和甘汞電極(SCE)作為參比電極，鉑絲電極作為對電極。電極及CHI120電極拋光材料購自上海辰華儀器有限公司。掃描電子顯微鏡表征借助于場發(fā)射電鏡-SU8010完成。

莧菜紅用pH=7.0的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)配制成濃度為5.0×10-6mol/L的儲備液，置于4 ℃的冰箱內備用。氧化石墨烯(GO)水分散液購自江蘇先豐納米材料科技有限公司，質量濃度為2 mg/mL。尿酸、多巴胺、抗壞血酸和L-精氨酸(L-Arg)均購自上海如吉生物科技發(fā)展有限公司。1%Nafion溶液由5%Nafion溶液(武漢集思儀器設備有限公司)用超純水稀釋而得。超純NO氣體以及N2購自武漢紐瑞德特種氣體有限公司。Na2HPO4、NaH2PO4、KCl均購自國藥集團化學試劑有限公司。所有的化學試劑都為分析純，未經任何純化而直接使用。實驗用水均為超純水。

小鼠神經母瘤細胞由中南民族大學生物醫(yī)學工程學院生物實驗室提供。

1.2 NO飽和溶液的制備

NO飽和溶液的配制：首先采用排水集氣法將超純NO氣體收集于250 mL的棕色試劑瓶中，收集滿后，用橡膠塞塞緊瓶口并蠟封，然后用注射器注入10 mL已通N2除O2的超純水并充分搖勻，于室溫下靜置過夜，即得NO飽和溶液，濃度為1.8 mmol/L[21]。超純NO氣體的收集在通風櫥中進行。

NO標準溶液的制備：采用微量注射器吸取一定體積的NO飽和溶液，然后用通N2除O2的超純水稀釋得到一系列不同濃度的標準溶液。NO標準溶液需現配現用，且避光保存于密閉容器中。

1.3 電極的制備

氧化石墨烯修飾玻碳電極(GO/GCE)的制備：(1)首先將直徑為3.0 mm的GCE在粒徑為50 nm的Al2O3漿液中拋光，然后依次用體積比為1∶1的HNO3、無水乙醇及超純水各超聲清洗2 min，使電極表面呈鏡面并待其自然晾干；(2)滴涂5 μL 1 mg/mL的GO分散液于GCE表面，自然晾干制得GO/GCE。

聚莧菜紅修飾玻碳電極(PAR/GCE)的制備：GCE的拋光清洗步驟如前所述，將拋光清洗好的GCE置于5.0×10-6mol/L的莧菜紅溶液(pH=7.0)中，在-0.2～1.6 V的電位范圍內，以100 mV/s的掃描速率環(huán)掃15圈，超純水沖洗后晾干，即制得PAR/GCE。

納米復合膜(Nafion/PAR/GO/GCE)修飾電極的制備：(1)將GO/GCE置于5.0×10-6mol/L的莧菜紅溶液(pH=7.0)中，在-0.2～1.6 V的電位范圍內，以100 mV/s的掃描速率環(huán)掃15圈，超純水沖洗后晾干，制得PAR/GO/GCE；(2)將PAR/GO/GCE置于0.05%Nafion水溶液中，在-1.6～1.6 V的電位范圍內，以50 mV/s的掃描速率環(huán)掃10圈，超純水沖洗后自然晾干，制得Nafion/PAR/GO/GCE，即NO電化學傳感器。

2 結果與討論

2.1 NO在不同電極上的電化學響應

為檢驗聚莧菜紅-石墨烯納米復合膜對NO的電催化性能，采用差分脈沖伏安法，以pH值為7.0的0.1 mol/L PBS為底液，研究了2.25×10-5mol/L的NO分別在裸GCE、GO/GCE、PAR/GCE、PAR/GO/GCE 4種電極上的電化學響應，結果如圖1所示。從圖1可以看出，NO在裸GCE上僅產生了一個峰形較鈍的氧化峰，其峰電位為0.84 V，峰電流為1.1 μA(圖1曲線a);在GO/GCE上，NO的電化學響應有所改善，具體表現為氧化峰電位負移至0.83 V，氧化峰電流增加至5.7 μA，但峰形依舊較鈍(圖1曲線b)；在PAR/GCE上，NO的電化學響應改善更加明顯，可觀察到一個尖銳的氧化峰，峰電位負移至0.75 V，峰電流增加至6.4 μA(圖1曲線c);相較于上述電極，NO在PAR/GO/CGE上的電化學響應最為明顯，氧化峰電位最低(Ep=0.74 V)，氧化峰電流最大(Ip=8.4 μA)，如圖1曲線d所示；而當底液中沒有NO存在時，在PAR/GO/CGE上觀察不到明顯的電化學響應(圖1曲線e)。這說明在圖1中觀察到的電化學響應是由NO的電化學氧化所產生，且聚莧菜紅-石墨烯納米復合膜對NO的電化學氧化具有明顯的催化性能。

圖1 裸GCE(a)、GO/GCE(b)、PAR/GCE(c)及PAR/GO/GCE(d和e)在含有(a,b,c和d)及不含有(e)2.25×10-5 mol/L NO的0.1 mol/L無氧PBS(pH=7.0)中的差分脈沖伏安圖Fig.1 Differential pulse voltammogramms of bare GCE(a),GO/GCE(b),PAR/GCE(c),PAR/GO/GCE(d and e) in the presence(a,b,c and d) and absence(e) of 2.25×10-5 mol/L NO in 0.1 mol/L PBS(pH 7.0)

2.2 NO傳感機理探討

為進一步探討Nafion/PAR/GO/GCE對NO的電催化氧化機理，對裸GCE、GO/GCE、PAR/GCE和PAR/GO/GCE進行了掃描電子顯微鏡(SEM)表征，結果如圖2所示。裸GCE表面比較平滑(圖2A)；GO/GCE表面呈褶皺狀薄膜結構(圖2B)；在PAR/GCE表面，可觀察到一層有晶體顆粒構成的網格狀薄膜(圖2C)；而PAR/GO/GCE的表面呈溝壑狀，褶皺更加明顯(圖2D)，這種結構有利于增加修飾電極的比表面積，從而提高NO在納米復合膜表面的富集量，為傳感器具有較高的靈敏度提供保障。

圖2 裸GCE(A)、GO/GCE(B)、PAR/GCE(C)及PAR/GO/GCE(D)的掃描電鏡(SEM)圖Fig.2 SEM images of bare GCE(A),GO/GCE(B),PAR/GCE(C) and PAR/GO/GCE(D)

考察了裸GCE、GO/GCE、PAR/GO/GCE 3種不同修飾電極的交流阻抗譜，結果如圖3所示?？梢钥闯觯鉍CE(a)的交流阻抗半徑最大，其次是GO/GCE(b)，而PAR/GO/GCE(c)交流阻抗半徑最小。這說明PAR/GO/GCE的導電性能最好。良好的導電性能加快電子傳遞速率，從而縮短NO電化學傳感器的響應時間。

圖3 裸GCE(a)、GO/GCE(b)及PAR/GO/GCE(c)的電化學交流阻抗譜圖Fig.3 Electrochemical impedance spectroscopy of bare GCE(a),GO/GCE(b) and PAR/GO/GCE(c)

通過考察掃描速率對NO在Nafion/PAR/GO/GCE上的氧化峰電流的影響，研究了NO的電化學氧化機理。在60～250 mV/s掃描范圍內，隨著掃描速率的增加，NO的氧化峰電流也隨之增加(圖4A)。掃描速率與氧化峰電流呈良好線性關系，其回歸方程為：Ip=23.05+0.08v，R=0.99(圖4B)。這說明NO在Nafion/PAR/GO/GCE上的電化學氧化反應是一個受吸附控制過程，并且為不可逆反應。NO氧化峰電位與掃描速率的自然對數呈線性相關：Ep=0.71+0.031lnv，R=0.98(圖4C)。根據Laviron理論公式可以得出，NO在此傳感器上的電化學氧化反應中的電子轉移數為1.4≈1，即有一個電子參與了反應。

圖4 (A)在不同掃速(由內向外：60～250 mV/s)下，于0.1 mol/L無氧PBS(pH=7.0)中，2.25×10-5 mol/L NO在Nafion/PAR/GO/GCE上的線性掃描伏安曲線；(B)NO的氧化峰電流與掃速之間的線性關系圖；(C)NO氧化峰電位與掃速率的自然對數之間的線性關系圖Fig.4 (A)Linear sweep voltammograms of Nafion/PAR/GO/GCE in 0.1 mol/L PBS(pH=7.0) containing 2.25×10-5 mol/L NO at different scan rates(from inner to outer:60 mV/s to 250 mV/s);(B)Relationship between the oxidation peak current of NO and the scan rate;(C)Relationship of the oxidation peak potential of NO with the natural logarithm of scan rate

2.3 復合膜修飾電極的性能及應用

2.3.1 線性范圍的考察通過安培響應法，對Nafion/PAR/GO/GCE用于NO生物醫(yī)學傳感的線性范圍進行了考察。將制備好的Nafion/PAR/GO/GCE置于pH=7.0的0.1 mol/L PBS中，采用安培響應法，設置工作電位為0.8 V，在200 s時，向底液中加入8 μL 1.0×10-5mol/L的NO標準溶液，隨后每隔50 s加入不同濃度的NO溶液。不同濃度NO的安培響應情況如圖5所示。當實驗進行到500 s的時候，開始出現明顯的電流階梯，此時底液中NO的濃度為1.0×10-7mol/L；當實驗進行到2 000 s時，電流階梯基本結束，此時底液中NO的濃度為5.1×10-5mol/L。通過對圖5中的實驗數據進行處理可得，NO在傳感器上的氧化峰電流與其濃度之間在1.0×10-7～5.1×10-4mol/L范圍內呈現良好的線性關系。傳感器的檢出限(S/N=3)為1.8×10-8mol/L。

圖6 在0.8 V的工作電位下以0.1 mol/L無氧PBS(pH=7.0)為底液,2.25×10-5 mol/L NO及同濃度的在傳感器上的安培響應圖Fig.6 Amperometric response of the sensor with successive injection of 2.25×10-5 mol/L NO,DA,UA,AA and in 0.1 mol/L deoxidized PBS solution(pH=7.0) under the work potential of 0.8 V

2.3.3 實際樣品中NO的分析為探究Nafion/PAR/GO/GCE的實際應用能力，以小鼠神經母瘤細胞作為生物樣品進行評價實驗。將Nafion/PAR/GO/GCE置于pH=7.0的0.1 mol/L的無氧PBS中，并向其中加入一定量的小鼠神經母瘤細胞溶液。在200 s時，借助于微量注射器向底液中加入1 mL 0.1 mol/L的L-精氨酸(L-Arg)。另外做一組空白對照實驗：將Nafion/PAR/GO/GCE置于沒有添加小鼠神經母瘤細胞的pH=7.0的0.1 mol/L的無氧PBS中。在200 s時，借助于微量注射器向底液中加入1 mL 0.1 mol/L的L-Arg，監(jiān)測信號，結果如圖7所示。從圖7中可以看出，向底液中加入L-Arg溶液時，兩組實驗均可觀察到明顯的電化學響應，該電化學響應對應于L-Arg 在傳感器上的電化學氧化(圖7a和圖7b);加入L-Arg 大約125 s后，在圖7a中觀察到了一個明顯的電流變化臺階信號，歸屬于L-Arg刺激小鼠神經母瘤細胞所釋放的NO在傳感器上發(fā)生了電化學氧化；而當底液中沒有小鼠神經母瘤細胞時，觀察不到該電流變化臺階信號(圖7b)，這是因為此溶液中沒有NO的釋放。實驗結果表明，我們所研發(fā)的NO電化學傳感器可成功應用于小鼠神經母瘤細胞所釋放NO的實時監(jiān)測，展現了其在生物醫(yī)學領域可能具有良好的應用前景。

圖7 以pH值為7.0，濃度為0.1 mol/L的PBS為底液，傳感器分別在含小鼠神經母瘤細胞(a)和不含有小鼠神經母瘤細胞(b)的溶液中的安培響應Fig.7 Amperometric response of the sensor in 0.1 mol/L deoxidized PBS(pH=7.0) containing murine neuroblastoma cells(a) and without mouse neuroblastoma cells(b)

3 結論

本文通過簡單可控的滴涂成膜法和電化學聚合法，將石墨烯和聚莧菜紅納米復合膜修飾到玻碳電極表面，制得一種新型的NO電化學傳感器。借助于電子掃描顯微鏡和電化學交流阻抗技術對納米復合膜進行了形貌和導電性表征，并結合電化學技術手段對傳感器的性能進行了評價。結果表明我們所研發(fā)的NO電化學傳感器具有靈敏度高，線性范圍寬，響應靈敏等優(yōu)點。此外，該傳感器還可用于小鼠神經母瘤細胞釋放NO的實時監(jiān)測，展示了其在生物醫(yī)學領域具有良好應用前景。