尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)基因調(diào)控不同地源靈芝孢子粉次生代謝產(chǎn)物的差異

李明成，李亞晗，劉佳琳，蘭春陽，孫曉紅，趙萬濤，王立霞

(1.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.吉林省中藥 DNA 指紋檢測(cè)技術(shù)科技創(chuàng)新中心，吉林 吉林 132013；3.北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132011)

靈芝(Ganodermalucidum)是我國(guó)傳統(tǒng)健康食藥用菌，《中國(guó)藥典》記載，靈芝有赤芝和紫芝，其具有極高的藥用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值.市場(chǎng)上常見的有靈芝子實(shí)體和靈芝孢子粉.靈芝包含多種生物活性物質(zhì)，其中靈芝多糖(Ganodermalucidumpolysacc- haride，GLP)是靈芝的次生代謝產(chǎn)物，存在于靈芝的菌絲體和子實(shí)體中，具有降血脂、降血糖、抗腫瘤等功效[1-3].我國(guó)靈芝是以栽培為主，靈芝的菌種及地理環(huán)境對(duì)靈芝的營(yíng)養(yǎng)成分和GLP等活性物質(zhì)影響很大[4-6].尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-glucose pyrophosphorylase，UGPase)已在植物的很多組織細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)儲(chǔ)存在胞液里，它是植物活化糖的主要存在形式，能夠催化反應(yīng)Glc-1-P+UTP轉(zhuǎn)化為UDPG+PPi，為纖維素、蔗糖以及果膠質(zhì)等的合成提供葡萄糖基[7].UGPase被認(rèn)為是調(diào)節(jié)靈芝多糖合成的關(guān)鍵限速酶，可能與靈芝多糖合成密切相關(guān)[8-9].

目前，市售的靈芝加工品多為切制加工過的靈芝片、靈芝孢子粉或靈芝孢子粉膠囊，還有少數(shù)口服液等保健品.由于靈芝被切成片或打成粉后很難鑒別真?zhèn)?，用樹舌或其他菌類冒充靈芝加工品的情況時(shí)有發(fā)生.不同地源靈芝的生長(zhǎng)環(huán)境和加工過程不同，也導(dǎo)致了靈芝產(chǎn)品質(zhì)量千差萬別[10].

本研究從生物分子學(xué)的角度出發(fā)，利用合成生物學(xué)的思路和方法，探究GLP的合成關(guān)鍵酶UGPase基因?qū)LP合成調(diào)控相關(guān)的關(guān)鍵元件特征，最終實(shí)現(xiàn)GLP活性天然產(chǎn)物代謝途徑的高效異源表達(dá)，從而解決不同地域種植差異、活性天然產(chǎn)物來源不足、不易實(shí)現(xiàn)化學(xué)合成等問題[5].

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

靈芝孢子粉(批號(hào)：121701-201401，規(guī)格：0.5 g)及D-無水葡萄糖(批號(hào)：110833-201908，規(guī)格：0.5 g)為中國(guó)食品藥品檢定研究院提供標(biāo)準(zhǔn)品.篩選不同地源干燥靈芝孢子粉共7批18份，分別購自云南、吉林、××堂(市售膠囊)，每份質(zhì)量100～250 g，由吉林市藥檢所金英蘭主任藥劑師鑒定真?zhèn)?

1.2 方 法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品與供試品溶液的制備

精密稱量無水葡萄糖對(duì)照品0.5 g，置于500 mL容量瓶中，加水溶解，定容至刻度線，最終配制成質(zhì)量濃度1 mg/mL的無水葡萄糖，為對(duì)照品貯存溶液.精密稱量實(shí)驗(yàn)樣本靈芝孢子粉2 g，放入三角燒瓶中，加水50 mL，靜置30 min后沸水浴2 h，趁熱真空抽濾，用雙蒸水洗滌濾渣和濾器3次.將得到的洗滌液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器旋蒸20 min左右，將濾液濃縮到20 mL.取20 mL的濃縮液于離心管中，加入30 mL的無水乙醇，靜置過夜.然后10 000 r/min離心10 min，棄掉上清液，于室溫晾干，沉淀用熱的雙蒸水溶解，洗滌離心3次，冷卻后，定容在500 mL容量瓶中，即可得供試品溶液.每份樣品重復(fù)3次.

1.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密量取標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分別放入帶塞子試管中，加雙蒸水至1.0 mL，再加入5%苯酚溶液1.0 mL搖勻，然后沿試管壁緩慢注入5 mL濃硫酸溶液，搖動(dòng)6 min，注意打開蓋子釋放出氣體，室溫放置5 min后，于沸水浴中加熱10 min，取出并冷卻至室溫.使用1 cm的比色杯在490 nm處測(cè)得吸光度值，并將苯酚與硫酸作為溶劑用作空白對(duì)照.以無水葡萄糖的質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)、以吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.2.3 供試品靈芝孢子粉多糖含量的測(cè)定

1.2.4 靈芝UGPase基因的克隆

從NCBI數(shù)據(jù)庫獲取靈芝UGPase基因(Seq- uence：KM260167.10)及內(nèi)參基因16SrRNA mRNA(AF493073.1)的序列基因，采用DNAStar等相關(guān)軟件進(jìn)行生物信息學(xué)分析及序列比較，選擇同源性較高的區(qū)域，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(見表1)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.

表1 基因及引物序列Tab.1 Gene and primers’ sequences

孢子粉細(xì)胞總RNA及進(jìn)行cDNA合成：分別采用TaKaRa MinBEST Plant RNA Extraction Kit 和PrimeScriptTMRT reagent Kit with g DNA Eraser(TaK- aRa，Japan)試劑盒，按照說明書方法提取靈芝孢子粉細(xì)胞總RNA及進(jìn)行cDNA合成，每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù).應(yīng)用1.0%瓊脂糖電泳檢測(cè)RNA完整性，應(yīng)用Q6000核酸蛋白分析儀測(cè)定260、280 nm波長(zhǎng)下總RNA濃度和純度.制備的cDNA儲(chǔ)存在-20 ℃的冰箱中.

PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min.2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下進(jìn)行瓊脂糖凝膠中的目的條帶切取，選用pGM-T連接試劑盒，T-A連接、轉(zhuǎn)化及藍(lán)白斑篩選與鑒定、重組質(zhì)粒提取參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行.將鑒定正確的克隆質(zhì)粒送至上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序，結(jié)果應(yīng)用BioEdit 軟件比對(duì)，并登錄NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blast分析.

1.2.5 熒光定量PCR檢測(cè)UGPase-mRNA及繪制熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

將初始濃度為1 ng/μL的靈芝標(biāo)準(zhǔn)品cDNA設(shè)為模板，梯度稀釋至10-5ng/μL，每個(gè)稀釋度各取0.4 μL，熒光定量PCR反應(yīng)系統(tǒng)和反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)[12]進(jìn)行.使用Ct值作為縱坐標(biāo)，使用模板的對(duì)數(shù)濃度作為橫坐標(biāo)繪制定量標(biāo)準(zhǔn)曲線.線性關(guān)系用來衡量重復(fù)樣品數(shù)據(jù)和不同拷貝數(shù)的初始cDNA模板擴(kuò)增效率是否相同，R2值表示實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)滿足衰減的線性程度.每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行組，采用Excel軟件統(tǒng)計(jì)內(nèi)參基因與目的基因Ct值，2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)mRNA水平.

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

通過紫外分光光度計(jì)法以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，得到回歸方程為Y=0.11X+0.11，R2=0.983 7.

2.2 靈芝孢子粉樣品GLP含量測(cè)定

精密吸取靈芝孢子粉供試品溶液1 mL，測(cè)其吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到待測(cè)溶液中多糖的含量.經(jīng)計(jì)算，云南孢子粉多糖含量為(2.887 0±0.005 9)%，吉林孢子粉多糖含量為(3.361 0±0.004 6)%，××堂孢子粉多糖含量為(2.399 0±0.005 3)%，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).

2.3 UGPase基因克隆與鑒定

利用TIANSeq HiFi Amplification Mix高保真聚合酶克隆pUGPase-216 bp片段，目的基因均出現(xiàn)與目的條帶大小相符的清晰明亮條帶，說明UGPase基因克隆成功(見圖2).克隆的質(zhì)粒被送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與生物信息學(xué)軟件BLAST工具和BioEdit進(jìn)行比較，結(jié)果表明：每個(gè)克隆片段的核苷酸序列與GeneBank中的注冊(cè)序列(Sequence：KM260167.1)相同，均為100% (見圖3)，證明克隆的DNA片段是目標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)片段.克隆的片段存儲(chǔ)在-20 ℃下，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的對(duì)照.

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1Standard cure for glucose

M.100 bp Ladder marKer；1～2.不同來源靈芝孢子粉pUGPase-216 bp；3.標(biāo)準(zhǔn)品pUGPase-216 bp.圖2 PCR擴(kuò)增靈芝孢子粉UGPase基因質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳圖譜 Fig.2Agrose gell electrophoresis of UGPase gene inserted into the plasmid amplified by PCR

圖3 質(zhì)粒pUGPase-216 bp測(cè)序blast結(jié)果Fig.3Sequences and blast results of pUGPase-216 bp

2.4 UGPase基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增曲線及熔解曲線

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率計(jì)算目的基因UGPase和內(nèi)參基因16SrRNA的擴(kuò)增效率，分別為100.207%、100.109%，均接近100%，符合相對(duì)定量2-ΔΔCt法的計(jì)算要求.計(jì)算結(jié)果顯示：樣品反應(yīng)指數(shù)明顯擴(kuò)增，梯度樣品分布均勻，表明樣品重復(fù)性好、擴(kuò)增效率高、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確.熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖4.每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，以靈芝孢子粉cDNA作為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，得到目的基因UGPase和內(nèi)參基因16SrRNA的熔解曲線和擴(kuò)增曲線.雖然不同地源靈芝孢子粉有差異，但條帶重復(fù)性及擴(kuò)增效率較好，說明Ct值可信度高，可用于定量檢測(cè)和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(見圖5).熔解曲線出現(xiàn)單峰，無非特異性擴(kuò)增和引物二聚體，表示擴(kuò)增產(chǎn)物單一，引物特異性高，結(jié)果可靠(見圖6).

圖4 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4Fluorescence quantitative PCR standard cure

A.孢子粉UGPase基因擴(kuò)增曲線；C.孢子粉內(nèi)參基因擴(kuò)增曲線.圖5 目的基因UGPase與內(nèi)參基因16SrRNA熒光定量PCR擴(kuò)增曲線Fig.5Fluorescence quantitative PCR amplification curve for UGPase and 16SrRNA

A.孢子粉UGPase基因熔解曲線；C.孢子粉內(nèi)參基因熔解曲線.圖6 目的基因UGPase與內(nèi)參基因16SrRNA熒光定量PCR熔解曲線Fig.6Fluorescence quantitative PCR melting curve for UGPase and 16SrRNA

2.5 熒光定量PCR檢測(cè)UGPase-mRNA相對(duì)定量結(jié)果

選取堂孢子粉為對(duì)照，其他地源孢子粉作為實(shí)驗(yàn)組，計(jì)算其他地源孢子粉UGPase基因的相對(duì)表達(dá)量.本實(shí)驗(yàn)選用 2-ΔΔCt法以××堂孢子粉為對(duì)照組，計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)公式：2-ΔΔCt=2-[(Ct(測(cè)試組目的基因)-Ct(測(cè)試組內(nèi)參基因))-(Ct(對(duì)照組目的基因)-Ct(對(duì)照組內(nèi)參基因))].不同地源靈芝孢子粉UGPase基因相對(duì)定量結(jié)果顯示，吉林產(chǎn)相對(duì)表達(dá)量含量為最高(見表2、圖7).

表2 不同地源靈芝孢子粉UGPase-mRNA相對(duì)表達(dá)含量Tab.2 Relative expression contents of UGPase-mRNA among G.lucidum spore powder from different land sources

***.P<0.005.圖7 不同地源靈芝孢子粉UGPase目的基因相對(duì)表達(dá)Fig.7Relative expression of UGPase-mRNA among G.lucidum spore powder from different land sources

3 討 論

GLP被認(rèn)為是靈芝主要生物活性成分，《中國(guó)藥典》中記錄GLP含量是評(píng)價(jià)靈芝品質(zhì)優(yōu)劣的關(guān)鍵因素.由于各地的氣候和地理環(huán)境不同，靈芝加工品制作工藝不同，靈芝生物活性物質(zhì)分離純化技術(shù)不成熟等原因[13]，導(dǎo)致靈芝品種之間存在差異，GLP的含量也千差萬別.因此，針對(duì)其有效活性物質(zhì)的合成途徑、關(guān)鍵酶的功能鑒定、代謝機(jī)制及高表達(dá)的研究成為近幾年的熱門課題[14-16].

紫外-可見分光光度法和高效液相色譜法是目前使用較多的檢測(cè)GLP含量的方法.本實(shí)驗(yàn)采用紫外-可見分光光度法定量檢測(cè)GLP含量，相比高效液相色譜法具有快速、簡(jiǎn)單、性價(jià)比高等優(yōu)點(diǎn)[17].苯酚-硫酸與糖類可生成黃橙色化合物，在490 nm處可以檢測(cè)到吸光度，根據(jù)這個(gè)原理檢測(cè)GLP，最后根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出不同地源GLP含量[18].

本研究采集來自我國(guó)靈芝主產(chǎn)區(qū)樣本，包括吉林長(zhǎng)白山、云南文山.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：不同來源的GLP含量差異較大，其中以吉林靈芝孢子粉GLP平均含量最高(3.361%).長(zhǎng)白山地區(qū)夏季晝夜溫差大，冬季嚴(yán)寒漫長(zhǎng)，獨(dú)特的森林資源，充足的地下水和肥沃的有機(jī)黑色土壤都為孕育高品質(zhì)的靈芝提供了優(yōu)良的自然環(huán)境，該地區(qū)靈芝孢子粉多糖含量相對(duì)較高[5，19].

靈芝孢子是靈芝成熟期從靈芝菌褶中彈射出來的極其微小的卵形生殖細(xì)胞，即靈芝的種子.靈芝孢子粉具有靈芝的全部遺傳物質(zhì)和保健作用，其藥用價(jià)值日益受到重視，研究[20-22]發(fā)現(xiàn)：靈芝孢子具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抑制腫瘤、保護(hù)肝損傷、輻射防護(hù)等作用.目前，市面上靈芝孢子粉價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于子實(shí)體，市場(chǎng)上的靈芝孢子粉主要為普通靈芝孢子粉和靈芝孢子粉(破壁).而靈芝孢子粉(破壁)的市場(chǎng)價(jià)值明顯高于靈芝子實(shí)體和未破壁靈芝孢子粉，現(xiàn)已成為市場(chǎng)上的主流產(chǎn)品[23].《國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委辦公廳關(guān)于破壁靈芝孢子粉有關(guān)問題的復(fù)函》(國(guó)衛(wèi)辦食品函〔2014〕390號(hào))已明確，破壁靈芝孢子粉不宜作為普通食品原料，食品生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)企業(yè)不得使用破壁靈芝孢子粉作為原料生產(chǎn)加工普通食品，不得經(jīng)營(yíng)含破壁靈芝孢子粉的普通食品.《2020年中國(guó)靈芝行業(yè)市場(chǎng)研究報(bào)告》顯示：目前，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)數(shù)量及靈芝產(chǎn)品種類繁多.根據(jù)國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局網(wǎng)站披露信息，截至2018年12月底，有藥品批文或保健食品批文的靈芝及靈芝孢子粉產(chǎn)品分別有187個(gè)和1 157個(gè)，僅靈芝孢子粉每年產(chǎn)值近上百億元.由于利益驅(qū)動(dòng)，市場(chǎng)上靈芝孢子粉產(chǎn)品質(zhì)量參差不一.我國(guó)2012年公布的《靈芝孢子粉采收集加工技術(shù)規(guī)范》(國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 29344-2012)要求以顯微鏡形態(tài)觀察計(jì)算靈芝孢子數(shù)量為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).隨著孢子粉采收及深加工技術(shù)的不斷升級(jí)，以及人們對(duì)孢子粉品質(zhì)的要求越來越高，以GLP為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)會(huì)很快納入孢子粉新的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn).

GLP的合成是涉及多個(gè)基因表達(dá)調(diào)控的過程，其中與UGPase的催化密不可分[24-26].由于本實(shí)驗(yàn)只涉及了UGPase基因轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)，不同靈芝菌株間UGPase基因mRNA表達(dá)量存在顯著差異，差異原因及具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入探究.