綠茶和紅茶多酚類化合物的抗病毒活性在新型冠狀病毒肺炎預防和治療中的應用

印度孟買化學技術(shù)研究所藥物科學與技術(shù)系

新冠肺炎疫情的流行發(fā)生已對世界政治、經(jīng)濟和人類健康產(chǎn)生嚴重影響。近期一篇由印度專家Susmit Mhatre等撰寫的介紹綠茶中兒茶素和紅茶中茶黃素對新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的抗病毒活性的論文《Antiviral activity of green tea and black tea polyphenols in prophylaxis and treatment of COVID-19：

A review》在Phytomedicine上發(fā)表，這是世界上最詳細報道茶葉中活性成分對COVID-19病毒活性研究的綜述。為了提供給我國更多茶業(yè)界人士參考，特摘譯如后。 ——陳宗懋

摘要：新型冠狀病毒SARS-CoV-2或nCoV的迅速傳播，已引起世界各國的高度重視并采取嚴格的預防和隔離措施。這個新的單鏈RNA冠狀病毒通過唾液和鼻腔分泌物傳播。鑒于新型冠狀病毒感染病例數(shù)日益增多，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）已授權(quán)緊急使用瑞德西韋（Remdesivir）治療，但至今仍然沒有任何一種藥物獲批準用于治療COVID-19。另一種替代的方法是用一些已知具有抗病毒特性的天然物質(zhì)分子進行治療。有報道證實，綠茶中的表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）和紅茶中的茶黃素對各種病毒，特別是對單鏈RNA病毒具有抗病毒活性。最近的研究揭示了在SARS-CoV-2病毒上存在可能的結(jié)合位點，并研究了它們與茶葉多酚類化合物之間的相互作用。這篇綜述中也關(guān)注到EGCG和茶黃素，特別是茶黃素-3，3'-雙沒食子酸酯（TF3）和病毒上的受體有非常明顯的相互作用。有些對接實驗研究重點關(guān)注了這些多酚類化合物在抗COVID-19病毒方面的活性。文章對現(xiàn)有報道和支持使用茶多酚化合物作為預防和治療COVID-19可能的候選藥物的證據(jù)進行了綜述。

關(guān)鍵詞：COVID-19;SARS-CoV-2;茶多酚;EGCG;茶黃素

Antiviral Activity of Green Tea and Black Tea

Polyphenols in Prophylaxis and

Treatment of COVID-19： A Review

SUSMIT Mhatre， TISHYA Srivastava， SHIVRAJ Naik， VANDANA Patravale*

Department of Pharmaceutical Sciences and Technology， Institute of Chemical Technology， Mumbai， India

Abstract： The rapid spread of novel coronavirus called SARS-CoV-2 or nCoV has caused countries all over the worldto impose lockdowns and undertake stringent preventive measures. This new positive-sense single-stranded RNAstrain of coronavirus spreads through droplets of saliva and nasal discharge. Us FDA has authorized the emergencyuse of Remdesivir looking at the increasing number of cases of COVID-19， however there is still no drug approvedto treat COVID-19. An alternative way of treatment could bethe use of naturally derived molecules with knownantiviral properties. We reviewed the antiviral activities of two polyphenols derived from tea， epigallocatechin-3-gallate?（EGCG） from green tea and thea ?avins from black tea. Both green tea and black tea polyphenols have been reportedto exhibit antiviral activities against various viruses， especially positive-sense single-stranded RNA viruses. Recentstudies have revealed the possible binding sites present on SARS-CoV-2 and studied their interactions with teapolyphenols. EGCG and thea?avins， especially thea?avin-3，3'-digallate （TF3） have shown a signi?cant interaction?with the receptors under consideration in this review. Some docking studies further emphasize on the activity of?these polyphenols against COVID-19. This review summarizes the available reports and evidences which support theuse of tea polyphenols as potential candidates in prophylaxis and treatment of COVID-19.

Keywords： COVID-19， SARS-CoV-2， tea polyphenols， EGCG， thea?avin

COVID-19是一種病毒性疾病，它影響呼吸系統(tǒng)上皮細胞，引起黏膜炎癥，導致肺泡損傷并最終導致肺炎。它的病原體是SARS-CoV-2病毒，是一種正義單鏈RNA冠狀病毒，俗稱新型冠狀病毒。此前，有報道冠狀病毒可引起非典型肺炎（SARS）和中東呼吸系統(tǒng)綜合征（MERS）[1]。正在進行的一些臨床試驗藥物中，羥氯喹（Hydroxychloroquine）、法維拉韋（Favipiravir）、瑞德西韋（Remdesivir）和洛匹那韋（Lopinavir）/利托那韋（Ritonavir）已引起較多的關(guān)注[2]。其他幾種抗病毒藥物和新的化學分子也正用于抗冠狀病毒治療的研究。還有一些以前證實有抗病毒效果的食用營養(yǎng)分子作為候選方劑用于評價治療COVID-19。

本文綜述了綠茶和紅茶中一些多酚類化合物的活性，特別是EGCG。EGCG和茶黃素曾用于對一些病毒的活性研究，發(fā)現(xiàn)它們的治療效果可能優(yōu)于一些化學合成藥物。

一、SARS-CoV-2病毒的結(jié)構(gòu)

SARS-CoV-2病毒與SARS-CoV、MERS-CoV兩種病毒的基因組相似度達79%和50%[3]。也有研究顯示SARS-CoV-2病毒和SARS-CoV病毒核苷酸相似度達89.1%，同源性達80%[4-5]。

病毒有4種主要的結(jié)構(gòu)蛋白：棘突蛋白（S）、被膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核殼體蛋白（N），以及其他非結(jié)構(gòu)性蛋白（Nsps）[6]。SARS-CoV-2病毒感染宿主細胞主要是其借助S蛋白結(jié)合宿主細胞的血管緊張肽轉(zhuǎn)換酶（ACE2）受體得以實現(xiàn)[7]。

二、SARS-CoV-2病毒的活性結(jié)合

位點和其他靶標

在SARS-CoV-2病毒上有許多結(jié)合位點可以作為藥物的作用靶標，新冠肺炎研究中的主要靶標有如下幾個。

1. 糜蛋白樣蛋白酶（3CLpro，PDB ID：6LU7）

3CLpro是SARS-CoV病毒的主要酶類，主要在病毒的成熟階段發(fā)揮蛋白水解的功能。因此，3CLpro是藥物抗冠狀病毒最主要的靶標。預測小分子物質(zhì)和肽抑制劑可以抑制3CLpro酶的活性。

2. RNA依賴的RNA多聚酶（RdRp，RDB ID：6NUR）

RdRp（Nsp12）是關(guān)鍵酶，它在病毒的復制和轉(zhuǎn)錄中具有重要的作用。借助其他輔助因子Nsp7和Nsp8，Nsp12和RNA之間的相互作用得到加強，由此也增強了RdRp的活性。因此Nsp12-RdRp是治療COVID-19病毒的重要藥物靶標。

3. 血凝集素酯酶（HE，PDB ID：3CL5）

HE是存在于β-冠狀病毒中的一種結(jié)構(gòu)蛋白，并被認為是β-冠狀病毒的標記物之一。HE起著受體破壞酶和作為凝集素依附在O-乙?；?唾液酸上的雙重作用。因此，HE-唾液酸復合體（PDB ID： 3CL5）是COVID-19病毒的又一個藥物靶標。

4. 木瓜蛋白酶樣蛋白酶（PLpro，PDB ID：40WO）

PLpro可裂解多聚蛋白的N終端形成Nsps、Nsp1、Nsp2和Nsp3。PLpro在躲避宿主細胞的先天免疫方面起著關(guān)鍵作用。由于PLpro酶在病毒復制中的重要功能，所以它也成為另一個重要的藥物靶標。

5. 2'-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（2'-O-MTase，PDB ID：3R24）

2'-O-甲基轉(zhuǎn)移酶（Nsp16）與Nsp10相結(jié)合得到了活化。鑒于Nsp10-Nsp16復合體（PDB：3R24）在病毒復制中的不可或缺性，估計它也是未來一種藥物治療的靶標。

6. 解旋酶（PDB ID：6JYT）

解旋酶（NSP 13） 在N端上有1個金屬結(jié)合域和1個解旋酶結(jié)構(gòu)域，具有對雙鏈的寡核苷酸在5'-3'位置上解旋的功能。因此NSP 13是抗冠狀病毒的又一個重要靶標。

7. 棘突RBD（PDB ID：6LKT）

RBD 是位于S1亞單位的S蛋白的主要結(jié)合域，它與宿主細胞ACE2受體形成復合體。ACE2的18個殘基和RBD上的14個氨基酸相接合，其中最重要的是ACE2中的K341和RBD中的R453黏合。任何對這種復合體抑制都能成為一種有前景的靶標藥物。

8. 結(jié)構(gòu)蛋白（S-PBD ID：3SCI，E-PDB ID：5X29，N-PDB ID：1SSK，2CJR）

除了RBD，在S2亞單位中的S蛋白上還有另一個藥物靶標。病毒融合后的狀態(tài)可發(fā)現(xiàn)HR1/HR2域，它呈典型的6個螺旋形復合體（PDB ID：1WYY）。這個復合物可以作為預防靶標。

9. ACE2受體（PDB ID：6ACK）

ACE2受體是病毒S蛋白的主要結(jié)合位點，二者接合便于病毒進入宿主細胞。SARS-CoV-2病毒S蛋白對ACE2受體的親和力高于SARS-CoV病毒。因此ACE2受體和ACE2-RBD（PDB ID：6VW1）的復合物是預防新型冠狀病毒的兩個重要位點。

10. 葡萄糖調(diào)控蛋白（GRP78，PDB ID：3LDL）

GRP78俗稱結(jié)合免疫球蛋白（BIP）或熱休克蛋白，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔（ER）中的一種伴侶蛋白。它的功能是阻止蛋白質(zhì)折疊轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，使該蛋白可以積累到閾值以上。SARS-CoV-2病毒的S蛋白和GRP78能相互作用，這種S蛋白相對應的GRP78的結(jié)合位點是針對新型冠狀病毒的一個良好的藥物靶標。

三、EGCG的抗病毒特性

已有多項研究發(fā)現(xiàn)了茶多酚尤其是EGCG的抗病毒活性。表1是EGCG抗病毒活性的一些研究文獻。EGCG被發(fā)現(xiàn)可抑制豬繁殖和呼吸綜合征病毒（PRRSV）感染，無論在病毒侵染前或侵染后都是有效的，125 μmol/L濃度足夠完全抑制病毒的感染[8]。對于丙型肝炎病毒（HCV），EGCG通過黏附靶細胞能阻止HCV感染并傳播到其他細胞[9]。有研究表明EGCG可透過胎盤屏障并到達胎兒的腦部、眼睛和心臟部位，因此在孕婦和胎兒中EGCG可能都會發(fā)揮作用。EGCG不僅可抑制細胞內(nèi)基孔肯雅病（Chikungunya）的病毒復制，還可以在對病毒感染前期和后期抑制細胞外感染[10]。

預期EGCG除了已知的可通過抑制紅細胞凝聚來影響病毒的黏附外，還可以抑制流感病毒循環(huán)的中間環(huán)節(jié)。EGCG還對人類免疫缺陷病毒1型（HIV-1）有效，并在不同階段抑制病毒的復制。它主要是通過干擾逆轉(zhuǎn)錄酶來阻斷gp120和CD4之間的相互作用。有一份報告顯示EGCG可抑制p24抗原在分離的CD4受體細胞上產(chǎn)生[11]。另一項研究顯示即使飲用不同濃度的綠茶，EGCG對抑制gp120-CD4的黏附也是有效的[12]。

四、茶黃素的抗病毒特性

茶黃素及其衍生物的抗病毒特性已經(jīng)在為數(shù)不多的病毒性疾病中開展研究報道（表2）。在一項對HSV-1的研究中，分別檢測所有的茶黃素化合物，發(fā)現(xiàn)TF1、TF2和TF3在病毒的溶解過程中顯示出很強抑制作用，其中TF3的抑制作用最強。當用50 μmol/L濃度的TF3處理1 h時，對病毒分子感染抑制作用高達99%以上 [21]。在另一研究中發(fā)現(xiàn)TF2在體內(nèi)可抑制COX-2、TNF-A、1CAM-1和NFkB mRNA表達水平，顯示其有抗炎效果。在一項對流感病毒的研究中也證明了茶黃素類化合物通過對神經(jīng)氨酸酶的抑制作用而顯示抗病毒活性。TF3的活性超過其他衍生物，效果與奧司他韋的功效相似[22]。TF3還可阻止病毒進入到馬丁達比狗腎（MDCK）細胞，從而抑制病毒的血凝素[23]。在所有茶多酚類化合物中，TF2b是活性最強的，它在1μmol/L濃度下可抑制HIV，選擇性系數(shù)遠大于200。茶黃素上的沒食酯?；臄?shù)量與其活性具有直接相關(guān)性。據(jù)估計，這些分子和gp41六螺旋相互作用以阻止病毒進入宿主細胞。在較高的濃度下，茶黃素可抑制HIV逆轉(zhuǎn)錄酶[24]。茶黃素在2 080種小分子中對諾沃克類病毒具有最強的生物信息學的抗病毒活性。研究發(fā)現(xiàn)茶黃素結(jié)構(gòu)上的羥基在活性上比沒食子?；鼮橹匾?。研究報道茶黃素可以通過抑制丙型肝炎病毒顆粒黏附細胞受體表面來發(fā)揮活性。在抗丙型肝炎病毒方面，TF3的突出特點是抗病毒活性優(yōu)于TF1和TF2[25]。

五、在抗新冠病毒肺炎中的應用

1. 對3CLpro的抑制作用

在一項對植物化學抑制SARS-CoV 3CLpro的研究中，EGCG分子對接得分值為-11.7時，顯示出其在所有篩選化合物中具備最佳活性。體外檢測顯示EGCG在200 μmol/L濃度下對3CLpro的抑制率達85%，半抑制濃度為（73±2）μmol/L[32]。最近，在SARS-CoV 3CLpro的研究中發(fā)現(xiàn)用更高生物利用率的EGCG類似物還可以進一步改善其病毒抑制活性。在另一項分子對接研究中發(fā)現(xiàn)，植物化學物中EGCG本質(zhì)上是諸多化合物中對3CLpro最有潛力的抑制物之一[33]。在這些研究的基礎(chǔ)上，可以期待EGCG可能成為COVID-19治療中一種有潛力的3CLpro的抑制物，這可能與EGCG和其他兒茶素的性質(zhì)不穩(wěn)定特性有關(guān)。在一項關(guān)于SARS-CoV的研究中發(fā)現(xiàn)，TF1、TF2a、TF2b和TF3比其他包括EGCG在內(nèi)的IC50小于10 μmol/L濃度的兒茶素，對3CLpro的抑制作用更具有潛在的應用價值。在茶黃素中，TF2b和TF3由于具有沒食子酸酯因而顯示較好的3CLpro的抑制活性[34]。與Lopinavir、Darunavir和Atazanavir等藥物相比，TF2b與3CLpro受體結(jié)合形成較多的氫鍵，因此顯示維持相互作用抑制病毒的活性。其他類似研究也表明TF3（-10.574）比其他抗病毒藥物如Lopinavir（-9.918）、Darunavir（-8.843）、Amprenavir（-8.655），以及橙皮素、Biorobin和迷迭香酸等植物化合物具有更高的對接得分值[35]。有文獻報道了用TF預防SARS-CoV-2感染的分子對接實驗，TF2在3CLpro受體上的對接分值為-9.8，TF3的對接分值為-10[36]。

2. 對RDRP的抑制作用

Lung等[37]的研究發(fā)現(xiàn)，除中國傳統(tǒng)中藥中已知的83個分子外，TF具有最強的黏結(jié)能力，為-38.12 kJ/mol。

3. 對棘突RBD抑制作用

研究發(fā)現(xiàn)，茶黃素與SARS-CoV-2中的RBD具有高的結(jié)合力，同時具有很高的對接分值。故與SARS-CoV-2中的RBD具有高效的相互作用，其黏結(jié)能力約為-35.69 kJ/mol[38]。

4. 對結(jié)構(gòu)蛋白的抑制作用

Khan等[39]的一項對接研究實驗發(fā)現(xiàn)，有18種植物成分與新型冠狀病毒的7種不同蛋白作用而發(fā)揮抗病毒活性，這項對接實驗結(jié)果與2種對COVID-19可能最有效的藥物Remdesivir和氯喹（Chloroquine）進行了比較。SARS-CoV-2病毒上具有治療作用的分子位點如圖1所示。EGCG顯示出了非常高黏結(jié)親和能力和低抑制常數(shù)，尤其是對6vw1，這是SARS-CoV-2的一個重要靶標。表3和表4為EGCG和Remdesivir、Chloroquine的黏結(jié)能力和抑制常數(shù)可比性的評價結(jié)果，這項研究的亮點在于顯示了EGCG與病毒蛋白具有較好的黏結(jié)能力，與對照藥物（Remdesivir和Chloroquine）相比，具有值得期待的更好的抗病毒活性[40]。

驗證茶黃素對SARS-CoV-2病毒的抗病毒活性研究中，Zhang等[41]用169種經(jīng)典調(diào)味作用的植物化學物進行對比研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)茶黃素和M蛋白酶有相當高的親和力，同時具有抗氧化活性。

5. 對ACE2受體黏結(jié)能力的抑制作用

因為ACE2受體是病毒S蛋白的RBD結(jié)合位點，因此直接和ACE2相互作用可以預防病毒對細胞的侵染。TF3可直接結(jié)合到ACE2受體上，因此可用以預防病毒侵染[41]。Malti和Banerjee證明了TF3可阻止棘突RBD結(jié)合到ACE2受體上。

6. 對葡萄糖調(diào)控蛋白78（GRP78）的抑制作用

Bhattacharjee等[42]發(fā)現(xiàn)EGCG通過形成許多氫鍵和非鍵與這個藥物靶標相互作用，可以預期EGCG是一個有潛力的COVID-9 S蛋白GRP78結(jié)合位點的抑制劑。圖2展示茶多酚在不同活性位點上的可能作用機制。表5總結(jié)了茶多酚類化合物針對新型冠狀病毒的一些研究結(jié)果。

六、挑戰(zhàn)與未來前景

COVID-19傳播速度驚人，缺乏批準的治療方法正給醫(yī)療系統(tǒng)帶來沉重的負擔。一些抗病毒藥物正在臨床試驗中，卻因在較高劑量時可能出現(xiàn)副作用不能在臨床中得到應用。已有報道EGCG和茶黃素對各種病毒感染具有抗病毒活性，深度分析這兩種物質(zhì)的抗病毒活性揭示了它們存在著廣譜的抗病毒分子，并且沒有明確的相互作用位點，在病毒復制的不同階段發(fā)揮作用。許多研究提示EGCG和茶黃素具有預防性抗病毒活性。3CLpro是一種在SARS-CoV病毒和SARS-CoV-2病毒上發(fā)現(xiàn)的至關(guān)重要的酶類?？紤]到這兩種病毒基因組的相似性，由他們合成3CLpro酶的性質(zhì)也相似。由于在病毒細胞復制中的重要作用，3CLpro也可能是一種藥物作用的靶標。研究發(fā)現(xiàn)EGCG 和茶黃素在很低的濃度下可抑制3CLpro，并與靶標有良好的黏結(jié)作用。茶黃素與SARS-CoV-2病毒的RBD有很好的黏結(jié)作用，通過疏水鍵及氫鍵與病毒S蛋白上的某些位點發(fā)生相互作用。此外，茶黃素已知具有RdRp抑制作用和ACE2的黏結(jié)活性。因此，EGCG和茶黃素都是具備潛力的抗病毒劑，可以探索應用于COVID-19的治療和預防中。GRP78是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）中發(fā)現(xiàn)的一種蛋白，它在阻止合成蛋白的展開中發(fā)揮作用。EGCG已知可與COVID-19 S蛋白GRP78連接位點相互作用，這是一個可能的藥物靶標，通過氫鍵和非鍵的相互作用發(fā)揮抗病毒活性。已有研究證明茶多酚具有廣譜抗病毒活性，茶多酚或多或少顯示出對COVID-19潛在的抑制活性。只有進一步研究才可以詳細地分析它們之間的相互作用。

EGCG口服利用率低，在到達靶點前極易被氧化。因此，一些研究建議用其結(jié)構(gòu)衍生物來提高利用率。EGCG酯衍生物具有較高的抗氧化活性，還有研究顯示用鈉米顆粒封裝EGCG以獲得更好的功效。此外，EGCG和其他抗病毒藥物聯(lián)用可以改善其生物利用率。在一項涉及HCV的研究項目中，EGCG和一些單克隆抗體聯(lián)用可以改善EGCG在體內(nèi)的遞送。通過對水溶性的EGCG，如棕櫚酸酯EGCG和硬脂酸酯EGCG等的親脂衍生物的抗微生物性能的研究發(fā)現(xiàn)，EGCG棕櫚酸酯抗HSV侵染的效果比EGCG高8.7倍[45]。用丁?；⑿刘；?、月桂醇、棕櫚酸酯和二十烷基修飾來合成EGCG單酯衍生物，驗證其烷基長度對抗流感活性的影響，此研究觀察到長?；梢燥@著增加EGCG的抗流感活性。在所有的EGCG酯型衍生物中，以EGCG棕櫚酸酯最為有效，效果比EGCG單酯高24倍[46]。硬脂酸酯 EGCG可抑制HSV侵染。在對EGCG的不同位點上進行甲基化、乙酰化、酯化或糖基化等的替換，可以改善EGCG的藥效藥代動力學[12]。EGCG及其衍生物在抑制多種病毒感染中有很好的應用前景，因此借助分子對接研究方法，今后在抗新冠肺炎病毒上值得對這些分子進行應用研究。

綜合而言，對EGCG和茶黃素這兩種多酚類化合物需要進一步詳細評估去證實其抗新冠肺炎病毒的應用效果。在多種茶黃素中，特別是TF2b和TF3，與RBD有良好的結(jié)合能力，可以用作良好的預防劑。鑒于EGCG 及其穩(wěn)定的親酯性衍生物具有與SARS-CoV-2的不同活性位點的對接特性，未來可能成為極具潛力的預防和治療藥物。

茶是當今世界上消費最廣泛的飲品，F(xiàn)DA已經(jīng)將這些多酚類化合物列為比較安全可用狀態(tài)（GRAS），這將進一步鼓勵使用高劑量來合成中毒劑量的抗病毒藥物。但現(xiàn)在談論EGCG和茶黃素作為藥物替代品還為時尚早。由于這些多酚類化合物具有非特異活性，還不能確定其對新型冠狀病毒受體的靶標活性，它們也可能和體內(nèi)的其他蛋白黏附并產(chǎn)生副作用。因此，這些分子可能暫時不會用于新型冠狀病毒的治療，而是作為膳食輔助劑或功能食品。在對這些多酚的特異性、活性、生物利用率和安全性進行廣泛研究后，可以考慮將其用于治療包括COVID-19在內(nèi)的病毒感染。

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（陳宗懋 譯）