高效液相色譜技術(shù)中常見問題分析及解決方法

張曉

摘要：高效液相色譜（HPLC）是以液體作為流動(dòng)相，利用樣品各組分在流動(dòng)相和固定相中分配系數(shù)或吸附系數(shù)的差異來實(shí)現(xiàn)不同組分分離的色譜分析技術(shù)。該技術(shù)具有實(shí)用、快速、靈敏、效率高等特點(diǎn)，在醫(yī)藥、環(huán)保、石化、生命科學(xué)、食品工業(yè)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。高效液相色譜儀在使用過程中常會(huì)出現(xiàn)一些影響分析結(jié)果的問題，包括鬼峰、保留時(shí)間漂移、峰前延、峰拖尾、峰變寬、負(fù)峰以及無色譜峰出現(xiàn)等，本文結(jié)合筆者多年HPLC操作經(jīng)驗(yàn)，談?wù)勆鲜龈鞣N問題產(chǎn)生的原因及其相應(yīng)的解決方法。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜技術(shù);常見問題;解決方法

1 常見問題及解決方法

1.1 鬼峰

在液相色譜的洗脫過程中有時(shí)會(huì)出現(xiàn)實(shí)際測(cè)試樣品中不存在的色譜峰，此類色譜峰稱之為鬼峰。鬼峰時(shí)有時(shí)無，不具備規(guī)律性，但它們對(duì)目標(biāo)峰的準(zhǔn)確判斷產(chǎn)生極大干擾。一般來說，鬼峰產(chǎn)生的原因可能有3個(gè)，即樣品前處理不當(dāng)、流動(dòng)相污染以及測(cè)試過程中的樣品殘留，分述如下。

1.1.1 樣品前處理不當(dāng)

樣品前處理不當(dāng)可能會(huì)產(chǎn)生鬼峰，一般源于兩個(gè)途徑：一是所用試劑被污染;二是測(cè)試容器不干凈。鑒別起來比較簡(jiǎn)單：使用試劑稀釋樣品，如果待測(cè)樣品出峰明顯減小而鬼峰變化不大，則鬼峰源自試劑污染。如果潔凈容器后重新檢測(cè)鬼峰消失，則鬼峰源自容器的污染。

1.1.2 流動(dòng)相污染

鬼峰的產(chǎn)生更多是由流動(dòng)相污染所致，包括水相、有機(jī)相以及添加劑的污染。水相長(zhǎng)時(shí)間放置或是多次使用沒有更換，易滋生細(xì)菌等微生物而污染，甚至?xí)芙饪諝庵袘腋〉念w粒和有機(jī)物，引入新的污染物。有機(jī)相和添加劑如果純度不夠含有雜質(zhì)，每次補(bǔ)充流動(dòng)相時(shí)以直接補(bǔ)給的方式，沒有對(duì)貯液瓶進(jìn)行清洗更換，富集的污染物就會(huì)進(jìn)入到儀器流路中產(chǎn)生鬼峰。

1.1.3 測(cè)試樣品的殘留影響

測(cè)試樣品的殘留也會(huì)產(chǎn)生鬼峰。殘留物通常來源于三個(gè)方面：進(jìn)樣口端污染、測(cè)試樣品濃度過載殘留以及色譜柱和儀器管路中污染物的富集。

在不改變測(cè)試條件情況下，如果鬼峰每次有規(guī)律地出現(xiàn)在色譜圖的相同位置，則污染很可能來自于自動(dòng)進(jìn)樣器端。這時(shí)可將自動(dòng)進(jìn)樣針和針座拆下，分別用甲醇、丙酮和環(huán)己烷進(jìn)行超聲清洗。

1.2 保留時(shí)間漂移

保留時(shí)間是HPLC分析的重要依據(jù)。同一種物質(zhì)在相同色譜條件下，如果前后兩次的保留時(shí)間之差超過30s，就可認(rèn)為保留時(shí)間發(fā)生了漂移，此時(shí)就無法對(duì)該物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確的定性定量分析。導(dǎo)致保留時(shí)間漂移的因素包括流動(dòng)相混入空氣、系統(tǒng)壓力不穩(wěn)定、色譜柱的性質(zhì)變化以及環(huán)境溫度不穩(wěn)定等。

1.2.1 流動(dòng)相混入空氣

儀器流路中連續(xù)混入氣泡，樣品的保留時(shí)間會(huì)發(fā)生無規(guī)律的變化。混入氣泡的原因可能有2個(gè)，一是在線脫氣機(jī)脫氣不完全，流動(dòng)相中仍存有大量的空氣。這種情況可預(yù)先將流動(dòng)相進(jìn)行超聲脫氣處理，然后再裝入儲(chǔ)液瓶中待用。二是由于水相和有機(jī)相的物理化學(xué)性質(zhì)存在差異，兩者在相互混合時(shí)，增加了空氣在兩種流動(dòng)相中的溶解度。對(duì)于這種情況的等度洗脫實(shí)驗(yàn)，可提前將流動(dòng)相按所需比例配置好，然后超聲脫氣待用。

1.2.2 系統(tǒng)壓力不穩(wěn)定

系統(tǒng)壓力不穩(wěn)定直接影響了物質(zhì)的出峰時(shí)間。其中，樣品與流動(dòng)相相容性差、流動(dòng)相混合器故障、單向閥故障、泵密封墊損壞、儀器管路接口松動(dòng)及損壞是造成系統(tǒng)壓力不穩(wěn)定的常見因素。

在選擇待測(cè)組分的溶劑時(shí)首先要考慮流動(dòng)相與樣品的相溶性，如沒有特殊原因，一般選擇流動(dòng)相作為待測(cè)組分的溶劑，以降低由于待測(cè)樣品在流動(dòng)相中溶解性差引入的空氣量。

液相色譜儀采用動(dòng)態(tài)混合器和靜態(tài)混合器將不同通道出來的流動(dòng)相混合均勻。一旦混合器發(fā)生故障，待測(cè)樣品的洗脫效果不一，系統(tǒng)就無法達(dá)到平衡，導(dǎo)致壓力不穩(wěn)基線不平。此時(shí)應(yīng)立即停止實(shí)驗(yàn)，查明原因，確認(rèn)是否需要更換部件。

單向閥工作時(shí)液體呈單向流動(dòng)，如果長(zhǎng)時(shí)間使用緩沖鹽作為流動(dòng)相，少量沒被洗脫的緩沖鹽結(jié)晶會(huì)阻塞單向閥的閥門，降低閥的流通性，導(dǎo)致流路流速改變，甚至還會(huì)發(fā)生單向閥漏液，進(jìn)而造成系統(tǒng)壓力不穩(wěn)。遇到這種情況，處理辦法是取出入口和出口單向閥的閥芯，依次在水、甲醇中超聲清洗15min以上。如果單向閥的白色濾頭顏色加深變黑，就要直接更換。假如以上方法還不能解決問題，則要檢查密封墊圈或者單向閥有否磨損，一旦磨損要及時(shí)更換。

1.3 峰變寬

峰變寬會(huì)導(dǎo)致相近的兩個(gè)色譜峰相互重疊，僅以一個(gè)峰出現(xiàn)在譜圖中，不利于樣品的分離檢測(cè)。出現(xiàn)此類情況，可采取以下措施：（1）改變流速。適當(dāng)加大流速，可明顯改善由流速過低引起的峰變寬現(xiàn)象。（2）重新進(jìn)樣。系統(tǒng)未達(dá)到平衡就開始做測(cè)試，峰形會(huì)發(fā)生無規(guī)則的變化，可待系統(tǒng)平衡穩(wěn)定后重新進(jìn)樣。（3）更換柱子。移除色譜柱前端的保護(hù)柱，根據(jù)峰形變化來判斷是保護(hù)柱還是色譜柱受到污染。如峰形有明顯改善，則需更換保護(hù)柱的濾芯。反之，則需清洗或更換色譜柱。（4）調(diào)節(jié)流動(dòng)相的比例或者重新選用合適的流動(dòng)相。

1.4 負(fù)峰

負(fù)峰在液相色譜圖中出現(xiàn)十分頻繁，分為以下兩種情況：所有峰均為負(fù)峰和出現(xiàn)個(gè)別負(fù)峰。

當(dāng)色譜圖上所有的峰都為負(fù)峰時(shí)，十之八九是儀器的線路出了問題。這時(shí)應(yīng)檢查連接線路，看數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)信號(hào)的線是否接反，或記錄儀、檢測(cè)信號(hào)極性接反。

液相色譜圖中出現(xiàn)一個(gè)或多個(gè)負(fù)峰，原因可能有3個(gè)：（1）樣品中的溶劑與流動(dòng)相不一致。如果溶劑的紫外吸收弱于流動(dòng)相，就會(huì)減弱色譜圖中某一位移處的信號(hào)，溶劑峰呈負(fù)峰形式。解決方法是使用流動(dòng)相作為樣品的溶劑。（2）樣品前處理中混入了其他雜質(zhì)。假如雜質(zhì)的紫外吸收弱于溶劑和流動(dòng)相，當(dāng)一定濃度的該類物質(zhì)流出時(shí)，就可能出現(xiàn)負(fù)峰。但如果負(fù)峰不影響待測(cè)組分出峰，就不必對(duì)樣品作進(jìn)一步純化處理。（3）流路中存在氣泡。當(dāng)流路中殘留的氣泡經(jīng)過流通池時(shí)，色譜圖上某一位移處的紫外吸收特別弱，就會(huì)出現(xiàn)負(fù)峰。碰到這種情況，只有將流路中的氣泡排盡才能消除負(fù)峰對(duì)測(cè)試的影響。

2 結(jié)語：

高效液相色譜儀是一種操作要求嚴(yán)、技術(shù)含量高、實(shí)踐領(lǐng)會(huì)強(qiáng)的大型精密分析儀器，我們只有加強(qiáng)日常維護(hù)，在使用中認(rèn)真應(yīng)對(duì)，及時(shí)發(fā)現(xiàn)異常，找出原因并予以解決，才能延長(zhǎng)儀器的使用壽命，保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性，讓儀器的功能和特點(diǎn)得到最大限度的發(fā)揮和利用。