花生肽對小鼠的抗疲勞作用研究

于曉晨 李臻 胡佳妮 劉欣然 劉睿 郝云濤 康家偉 珠娜 李勇

摘 要：目的：探討花生肽對ICR小鼠的抗疲勞作用。方法：采用SPF級雄性ICR小鼠80只按體重隨機分為4組，分別為空白對照組、3個花生肽干預組（250、500、1 000 mg/kg BW]。每日經(jīng)口灌胃給予受試樣品水溶液，干預周期為30 d，干預結(jié)束后進行負重游泳試驗，并對各組小鼠負重游泳力竭時間進行記錄，同時對其血糖水平、血清尿素氮含量及乳酸脫氫酶活力進行測定，并檢測各組小鼠血乳酸水平，檢測各組小鼠肝、肌糖原含量，并測定小鼠血清生化指標，同時測定小鼠心肌、肝臟及腓腸肌氧化應激和脂質(zhì)過氧化指標水平。結(jié)果：與空白對照組相比，花生肽可顯著延長小鼠負重游泳力竭時間，并提高其乳酸脫氫酶活性，降低運動后小鼠血乳酸含量，加強肌糖原儲備，提高心肌SOD活力。結(jié)論：花生肽具備一定的抗疲勞作用。

關(guān)鍵詞：花生肽;抗疲勞;小鼠負重游泳

疲勞可根據(jù)其狀態(tài)分為繼發(fā)性疲勞、生理性疲勞及慢性疲勞三種，而慢性疲勞是指持續(xù)時間超過6個月的主觀疲勞狀態(tài)，通常伴有持續(xù)的肌肉疼痛、認知障礙及睡眠障礙[1-2]，目前病因尚不清楚。伴隨著現(xiàn)代社會的進步，廣泛存在的社會競爭及快節(jié)奏的生活使得疲勞相關(guān)綜合征成為了嚴重的全球性健康問題，在美國飽受持續(xù)性疲勞困擾的男性達到2.3%，女性則為1.9%[3]。一項針對蘇州市中學生的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，受到長期疲勞癥狀困擾的則達到了0.9%[4]。除此以外，疲勞還是多種疾病的相關(guān)并發(fā)癥。疲勞相關(guān)的病理生理及病因尚未被完全解析，目前針對疲勞相關(guān)癥狀的緩解藥物種類有限，且存在副作用[5]，因此尋求具有抗疲勞作用的功能性食品來代替藥品進行緩解疲勞相關(guān)干預具有重要意義。

花生是世界范圍內(nèi)普遍使用的油料作物，在中國已有數(shù)百年的種植史，產(chǎn)量居世界首位，是重要的經(jīng)濟作物。近年來，花生因其富含人類生長發(fā)育所需要的營養(yǎng)物質(zhì)而越來越被推崇為營養(yǎng)膳食，研究稱其含有蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物、維生素E、維生素B族、大量礦物質(zhì)及植物營養(yǎng)素（白藜蘆醇、異黃酮類、酚酸、植物甾醇等），對促進機體健康有良好的應用前景[6]。其中，花生蛋白成為了近些年的研究熱點，其蛋白質(zhì)含量可高達25%～30%，其中含有18種氨基酸，包括機體不能自身合成的8種必需氨基酸，其中苯丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、色氨酸含量相對較高[7]。目前，花生蛋白已作為食品的主要成分及輔料應用于日常食品之中，如花生蛋白乳制飲品、花生蛋白粉等。

生物活性肽是指通過生物酶解技術(shù)從蛋白質(zhì)中獲取的不完全分解產(chǎn)物，其分子結(jié)構(gòu)介于氨基酸和蛋白質(zhì)之間，較蛋白質(zhì)吸收率高，且具備代謝效率高、安全性高、不易過敏等特點[8]?；ㄉ氖侵笍幕ㄉ鞍字忻附馓崛〉男》肿与?，作為天然的活性肽，具有多種生物活性，如降血壓[9]、抗氧化[10]、抑菌[11]等。但目前關(guān)于花生肽抗疲勞及相關(guān)的機制研究文獻報道較少，本研究應用不同劑量的花生肽對小鼠進行灌胃干預，通過負重力竭游泳實驗評價其干預運動繼發(fā)性疲勞的作用并探討花生肽緩解疲勞的可能機制，為研發(fā)花生肽作為臨床輔助改善疲勞的功能性食品提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花生肽，淡黃色固體粉末，購自武漢天天好生物制品有限公司，主要成分為分子量小于2 000的低聚肽，高達80%;健康SPF級雄性ICR小鼠80只，18～22 g，由北京大學醫(yī)學部實驗動物中心提供（實驗動物許可證號：SYXK（京）2011-0039;實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2011-0012）。

紫外分光光度計，UV-2000（UNIC）;全自動生化儀，AU480貝克曼（美國）;肝糖原/肌糖原檢測試劑盒，南京建成生物科技;超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒，南京建成生物科技。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與處理 小鼠飼養(yǎng)在北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部，實驗期間自由飲食、飲水。適應性喂養(yǎng)1 w后，根據(jù)體重將小鼠隨機分為4組，每組20只：1個空白對照組、3個花生肽干預組（250、510、1 000 mg/kg·BW）。每日以0.1 mL/10 g BW灌胃量經(jīng)口干預，花生肽干預組給予相應濃度受試物，花生肽使用蒸餾水配置，空白對照組給予等體積滅菌蒸餾水。實驗期間小鼠每周稱重1次，依體重調(diào)整受試樣品的劑量，并每日觀察小鼠的一般情況。干預持續(xù)30 d后，將每組小鼠隨機分為A和B 2個亞組。A亞組小鼠進行不負重游泳相關(guān)血乳酸水平檢測，7 d后進行血糖及血清尿素氮水平、乳酸脫氫酶活力及肝臟、心肌、腓腸肌氧化應激指標的測定;B亞組小鼠為負重游泳實驗，并檢測肝糖原及肌糖原含量。

1.2.2 血乳酸測定 A亞組小鼠鼠尾取血20 μL，后再置于30 ℃的水中，進行不負重游泳10 min，并于游泳結(jié)束第0 min及游泳后20 min分別采血20 μL。將游泳前、游泳后0 min、游泳后20 min采得的血樣分別加入0.48 mL質(zhì)量分數(shù)為1%的NaF溶液中，充分混勻至透明后加入1.5 mL蛋白沉淀劑，再次振蕩混勻，在4 ℃ 3 000? r/min離心10 min吸取上清，采用對羥基聯(lián)苯比色法測定各組小鼠血乳酸含量。

1.2.3 血清尿素氮和乳酸脫氫酶、血糖水平及氧化應激指標的測定 A亞組小鼠，置于30 ℃的水中進行持續(xù)90 min的不負重游泳，游泳結(jié)束后休息60 min進行眼球采血，并使用頸椎脫臼法處死小鼠，分離肝臟、心臟及左腿腓腸肌備用。血液于4 ℃冰箱放置3 h待凝固，2 000 r/min離心15 min，分離血清，采用全自動生化儀測定血糖、血清乳酸脫氫酶及血清尿素氮水平，并根據(jù)試劑盒說明書進行氧化應激指標（肝臟、左腿腓腸肌及心肌的SOD、GSH-PX、MDA水平）的測定。

1.2.4 負重游泳試驗 B亞組小鼠，在水溫為（25±1.0）℃、水深為30 cm的游泳箱 （長寬高約為50 cm* 50 cm*40 cm）中進行負重游泳，鼠尾根部負荷5%體重的鉛皮。記錄小鼠自游泳開始至力竭死亡的時間，即小鼠負重游泳時間。

1.2.5 肝糖原和肌糖原測定 B亞組負重游泳結(jié)束后頸椎脫臼法處死小鼠，分離新鮮肝臟及左腿腓腸肌組織，用生理鹽水漂洗組織至無血色，濾紙吸干，按試劑盒說明書進行肝糖原及肌糖原水平的檢測。

1.3 統(tǒng)計方法

正態(tài)及非正態(tài)分布的連續(xù)變量分別以平均數(shù)±標準差表示;分類變量以個數(shù)（百分數(shù)）表示。采用SPSS 24.0軟件進行單因素方差分析，采用LSD法進行兩組間比較;方差不齊時采用Tamhane和Dunnett法進行post-hoc分析。P<0.05表示有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生肽對小鼠血乳酸含量的影響

取A亞組40只小鼠，分別測定小鼠不負重游泳前、游泳后0 min及游泳后20 min血乳酸水平。如表1所示，游泳前，各組小鼠血乳酸含量水平無顯著性差異;游泳后20 min，與空白對照組相比，花生肽低、中、高劑量組血乳酸含量均顯著降低（P<0.01、P<0.01、P<0.01）;與空白對照組相比，花生肽低、中、高劑量組小鼠血乳酸曲線下面積顯著降低（P<0.01、P<0.01、P<0.01）。

2.2 花生肽對小鼠血清尿素氮、乳酸脫氫酶活性和血糖的影響

如表2所示，與空白對照組相比，花生肽低、中、高劑量組小鼠血糖含量均顯著提高（P<0.01、P<0.01、P<0.01）;花生肽低劑量組小鼠乳酸脫氫酶活性高于空白對照組（P<0.01）;各組小鼠血清尿素氮水平相比較無顯著性差異（P>0.05）。

2.3 花生肽對小鼠負重游泳時間的影響

如附圖所示，花生肽低、高劑量組小鼠負重游泳時間比空白對照組顯著延長（P<0.05、P<0.05）。

2.4 花生肽對小鼠肝糖原、肌糖原含量的影響

如表3所示，與空白對照組相比，花生肽高劑量組小鼠肌糖原含量顯著升高（P<0.05），各組肝糖原水平無顯著性差異（P>0.05）。

2.5 花生肽對小鼠抗氧化相關(guān)指標的影響

如表4所示，與空白對照組相比，花生肽中、高劑量組小鼠心肌組織中SOD活力明顯升高（P<0.01、P<0.01）;其余抗氧化相關(guān)指標各組間無顯著性差異（P>0.05）。

3 討論

運動繼發(fā)性疲勞是指在長時間運動后機體出現(xiàn)的主觀不適感，是機體內(nèi)生理機能水平下降及組織器官維持機體運轉(zhuǎn)能力降低的體現(xiàn)，這個過程與能量代謝、代謝產(chǎn)物累積、內(nèi)分泌及代謝功能的紊亂密切相關(guān)[12]。運動耐力是評價抗疲勞作用的重要指標，而負重游泳實驗是常用的抗疲勞耐力運動模型，研究發(fā)現(xiàn)其實驗中動物的力竭游泳時間可以反映動物的疲勞狀況，并對其耐力進行評價[13]。本研究結(jié)果顯示，花生肽干預可以顯著延長小鼠負重力竭游泳時間，說明其具有抗疲勞作用。

高強度的運動伴隨著能量的大量消耗，這使得糖酵解成為其必需能量來源。血乳酸是碳水化合物在無氧條件下糖酵解的主要產(chǎn)物，在機體內(nèi)過量時會誘發(fā)肌肉局部疼痛及酸脹感，并影響體內(nèi)生長激素水平產(chǎn)生疲勞[14]，因此血乳酸是判斷機體運動強度及疲勞程度的重要指標，其代表了機體運動前后的疲勞程度及恢復情況[15]。乳酸脫氫酶在丙酮酸及乳酸之間的氧化還原反應中發(fā)揮了重要作用，是糖酵解中的關(guān)鍵酶，當過量運動機體乳酸水平過高時，機體可以利用乳酸脫氫酶將乳酸氧化為丙酮酸進行去除，從而緩解乳酸累積對機體造成的損害[16]。另外，高強度運動可引起機體蛋白質(zhì)降解，誘發(fā)尿素氮生成的增加，這使得尿素氮水平成為反應機能、疲勞程度及負荷量的重要指標[17]。本研究顯示，花生肽干預能夠顯著改善小鼠游泳后乳酸脫氫酶水平，并一定程度上減少血乳酸產(chǎn)生，降低血乳酸曲線下面積，具有改善疲勞程度效果。本研究中未見花生肽對小鼠游泳后血清尿素氮水平的顯著改變，關(guān)于其能否通過干預蛋白質(zhì)代謝來降低機體疲勞程度有待進一步探討。

糖是機體重要的能源物質(zhì)，運動伴隨著糖分解代謝的增強。運動的能量最初來自糖原的分解，在肌糖原被消耗殆盡后，肝糖原被動員用于補充能量代謝。因此增強糖原儲備，并減緩力竭運動時糖原的利用，有助于加強機體緩解疲勞的能力并提升運動耐力[18]。本研究中，與空白對照組相比，花生肽低、中、高劑量組小鼠游泳后血糖水平均顯著提升，且花生肽高劑量組肌糖原水平顯著高于空白對照組，這說明花生肽可通過提高肌糖原儲備，減緩游泳時小鼠糖原消耗，并維持機體血糖水平，達到抗疲勞作用。

過量的運動過程伴隨著超氧陰離子自由基的生成及積累，這會導致機體氧化應激，而自由基堆積后會與大分子DNA、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)成分間發(fā)生生物反應，致使過氧化物生成，破壞細胞分子結(jié)構(gòu)，進而與多種疾病的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生聯(lián)系。近期研究表明，機體內(nèi)源性抗氧化水平及脂質(zhì)過氧化物MDA的累積水平，也可說明機體的抗運動疲勞能力[19]。SOD和GSH-Px是機體內(nèi)重要的抗氧化酶，本研究測定了小鼠游泳后心肌、肝臟及腓腸肌中SOD、GSH-Px活力及MDA的水平，結(jié)果顯示，與空白對照組相比，僅有心肌組織中表現(xiàn)出了花生肽中、高劑量組小鼠SOD活力的升高，關(guān)于肝臟、腓腸肌及其GSH-Px活力及MDA水平并無顯著性變化，關(guān)于花生肽的抗氧化防御能力仍需根據(jù)進一步研究進行探討。

4 結(jié)論

綜上所述，花生肽能夠延長小鼠負重游泳時間，具有顯著的抗疲勞效用，其作用機制可能與提高小鼠肌糖原儲備，改善運動中血糖水平，提高乳酸脫氫酶活性，降低血乳酸水平，并一定程度上改善機體抗氧化活性相關(guān)。本研究為花生肽的開發(fā)利用提供科學依據(jù)。◇

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Anti-fatigue Effect of Peanut Peptide on Mice

YU Xiao-chen，LI Zhen，HU Jia-ni，LIU Xin-ran，LIU Rui，HAO Yun-tao，KANG Jia-wei，ZHU Na，LI Yong

（Department of Nutrition and Food Hygiene，School of Public Health，Peking University，Beijing 100191，China）

Abstract：Objective To investigate the anti-fatigue effect of peanut peptide on ICR mice.Method A total of 80 specific pathogen free （SPF）male ICR mice were randomly divided into 4 groups according to body weight，which were blank control group and 3 peanut peptide intervention groups（250，500，1 000 mg/kg BW）.The test samples and lipid peroxidation index were given by oral gavage every day，and the intervention period was 30 days.After the intervention，the weight-bearing swimming test was carried out and the exhaustion time of each group was recorded.The blood glucose level，serum urea nitrogen content and lactate dehydrogenase activity of mice were detected.Blood lactic acid level，liver and muscle glycogen content of mice in each group were also determined，and the serum biochemical indexes were determined.Oxidative stress level of myocardium，liver and gastrocnemius and lipid peroxidation index were also measured.Result Compared with the blank control group，peanut peptide could significantly prolong the weight-bearing swimming time，increase lactate dehydrogenase activity，reduce blood lactic acid content，increase muscle glycogen reserves，increase myocardial SOD activity.Conclusion Peanut peptide has certain effect of anti-fatigue.

Keywords：peanut peptide;anti-fatigue;weight-bearing swimming test