糖化血紅蛋白檢測技術(shù)的研究進(jìn)展

凌蘭芳

摘要：近年來，糖化血紅蛋白的檢測已成為糖尿病診斷及監(jiān)測的有效指標(biāo)，現(xiàn)就目前糖化血紅蛋白檢測方法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

關(guān)鍵詞：糖化血紅蛋白，檢測技術(shù)，綜述

【中圖分類號】R331.1+41 ? ? ? ? ? ? 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A ? ? ? ? ? ? 【文章編號】2107-2306（2021）05-112-01

1 ?概述

近年來，我國糖尿病患者的人數(shù)逐年攀升，據(jù)中國官方統(tǒng)計數(shù)據(jù)，2020版的指南更新的流調(diào)數(shù)據(jù)顯示，糖尿病患病率已達(dá)11.2%。糖尿病的治療是一個漫長的過程，因而對糖尿病的健康管理顯得尤為重要，手段主要以飲食管理和降糖藥物控制為主，聯(lián)合空腹血糖與糖化血紅蛋白（glycated hemoglobin A1c，HbA1c）定期監(jiān)測血糖水平，有效控糖。HbA1c是在長時間、高濃度血糖存在的條件下，血紅蛋白與葡萄糖進(jìn)行非酶促反應(yīng)結(jié)合形成的一種產(chǎn)物，其生成過程緩慢且不可逆，并且貫穿存在于紅細(xì)胞的整個生命周期中（120天），濃度相對穩(wěn)定，反映的是患者過去2～3個月的平均血液中葡萄糖水平，可以聯(lián)合空腹血糖等其他指標(biāo)診斷及監(jiān)測糖尿病?，F(xiàn)就目前檢測糖化血紅蛋白的檢測方法研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

2 ?HbA1c的檢測方法

HbA1c為屬于血紅蛋白p鏈的一個或兩個n端纈草上的d-葡萄糖，是一種生物標(biāo)記物，用于診斷和識別患糖尿?。―M）的高?；颊摺８鶕?jù)糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)， HbA1c 水平>6.5%（>48mmol/mol）可導(dǎo)致糖尿病;而把HbA1c水平介于5.7-6.4%（39-46mmol/mol）歸為糖尿病前期。近年來，糖化血紅蛋白的檢測技術(shù)也越來越標(biāo)準(zhǔn)化，目前可分為以下幾大類。

2.1 免疫反應(yīng)法 ?利用抗原抗體特異性反應(yīng)檢測糖化血紅蛋白，以血紅蛋白β鏈糖化N末端的4～8個氨基酸殘基作為識別位點，生產(chǎn)單克隆抗體，按照反應(yīng)結(jié)合物質(zhì)的不同，可形成不同的檢測方法。

2.1.1膠乳凝集抑制法 ? 檢測試劑中以數(shù)個HbA1c抗原決定簇形成的聚集物作為凝集素，抗-HbA1c抗體抗原與之結(jié)合形成不溶性的抗原抗體復(fù)合物，加入全血樣本后，血液中的HbA1c將與聚集物產(chǎn)生競爭關(guān)系，爭奪乳膠顆粒上的抗-HbA1c抗體，抑制凝集物生成，根據(jù)測定的吸光度值可計算出HbA1c在總血紅蛋白（Hb）中的百分含量。該方法成本低、快速、基本能保證檢測準(zhǔn)確性，可在全自動生化儀上完成，適用于大批量樣本檢測，但易受高濃度的葡萄糖、三酰甘油及膽紅素等物質(zhì)干擾[2]。

2.1.2膠乳凝集免疫比濁法  HbA1c與抗-HbA1c抗體復(fù)合物是可溶性的，再加入多聚半抗原緩沖液抗原與剩余的抗-HbA1c抗體結(jié)合成不可溶性物質(zhì)，雙通道分別測定溶液中Hb和HbA1c的含量，即可求得HbA1c在總Hb中的百分含量，該方法精密度高，線性良好，雖然影響因素較多，但鑒于成本低，可進(jìn)行自動化的臨床優(yōu)勢，還是具有一定的替代價值。

2.1.3離子捕獲法 ?即化學(xué)發(fā)光法，將熒光標(biāo)記物結(jié)合到HbA1c抗原抗體復(fù)合物上，再聯(lián)結(jié)帶負(fù)電荷的多聚陰離子形成復(fù)合物，該復(fù)合物會吸附于試劑中的帶正電荷的纖維表面，經(jīng)反復(fù)清洗后可測定其熒光強(qiáng)度，從而得到HbA1c的濃度。該方法與上述兩種方法具有相似的檢測優(yōu)越性，且回收率高，交叉污染率低[3]。

2.1.4熒光免疫法與放射免疫法 ?熒光法為離子捕獲法的衍生方法，原理相同，但可計算HbA1c的濃度。熒光法和放射法的檢測優(yōu)略勢幾乎相同，可批量、重復(fù)檢測，且準(zhǔn)確度、精密度、特異性都較為良好，干擾因素也極少，但前者儀器及試劑成本高昂，后者制備試劑困難，故兩種方法在臨床上難以作為常規(guī)檢測方法[4]。

2.2電荷間差異檢測

2.2.1離子交換層析法 ?原理為血紅蛋白糖化后所帶電荷改變，在不同pH的磷酸鹽緩沖液中，可以將樹脂上不同吸附力的GHb組分（包括HbA及HbA1的各組分）分批依次洗脫出來，繪制相應(yīng)Hb的層析譜，即可求得HbA1c在GHb的百分率。常見的離子交換層析法主要有樹脂微柱法、低效液相色譜法（LPLC）及高效液相色譜法（HPLC），其中HPLC 是目前為國際公認(rèn)的檢驗HbA1c的金標(biāo)準(zhǔn)，但此法相關(guān)儀器、試劑及耗材昂貴，在基層醫(yī)院難以推廣普及;LPLC 測定原理與HPLC一致，但LPLC難以分辨變異血紅蛋白，往往將其歸為HbA1c，使假陽性率偏高，樹脂微柱法適合檢測大量標(biāo)本，但干擾因素極多，且重復(fù)性較差。

2.2.2電泳法 ?常用的有瓊脂糖凝膠電泳法、等電聚焦電泳法和毛細(xì)管電泳法等，基于GHb各組分泳動速度不同從而將其分離再測量含量，該方法的干擾因素較少，且分辨率高，可提示變異Hb的存在，毛細(xì)管電泳法對血紅蛋白變異體的抗干擾能力優(yōu)于HPLC，但自動化程度低，且儀器昂貴[5，6]。

2.3 ?基于結(jié)構(gòu)差異進(jìn)行檢測

2.3.1親和層析法 ?原理為硼酸根離子可逆性地與GHb中葡萄糖分子的順位二醇基聯(lián)結(jié)，加入血液樣本后，非糖化血紅蛋白會直接流出層析柱進(jìn)入洗脫液，再加入高濃度的含順位二醇基的山梨醇替換GHb，GHb也進(jìn)入洗脫液，此時通過測定洗脫液吸光度可計算出GHb所占百分比。該方法僅能用于檢測總GHb，不能分離組分，檢測結(jié)果與平均血糖值、HPLC 等法所測HbA1c百分率呈高度相關(guān)性，所以使用該方法時可以允許經(jīng)驗算法計算HbA1c。

2. 4 ?基于化學(xué)反應(yīng)性質(zhì)差異檢測

利用特異性內(nèi)切酶切斷GHb的糖化甘氨酰谷氨酰胺，減少了血漿中其他蛋白對檢測結(jié)果的干擾，測出Hb濃度;在果糖氨基酸氧化酶和過氧化物酶的催化下，生成的過氧化氫與顯色劑發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生顏色改變，在通過相關(guān)的測量后即可求得HbA1c的百分率。該反應(yīng)系統(tǒng)快速、單一，適用于全自動生化分析儀測試，精密度高。

2.5 ?免疫傳感器

Lee[7]利用金納米顆粒開發(fā)了兩種傳感器盒檢測HbA1c水平，一個是基于光學(xué)原理的聚合物基薄膜傳感器盒，另外一個是石英晶體微天平傳感器盒。王瀟[8]等人構(gòu)建了16通道無標(biāo)記型特異檢測HbA1c的電化學(xué)免疫傳感器，經(jīng)HbA1c抗體修飾的優(yōu)化型16-SPCE電化學(xué)免疫傳感器具有較好的電化學(xué)響應(yīng)性能、選擇性、穩(wěn)定性，能穩(wěn)定、有效地檢測復(fù)雜體系中的HbA1c，提高準(zhǔn)確度，對于糖尿病患者來說，易于小型化、即時檢測和操作簡單的優(yōu)勢極大地方便了他們的生活，減少頻繁奔于醫(yī)院的疲憊[8]。

3 ?結(jié)語

目前市面上檢測HbA1c的試劑很多，應(yīng)用的方法原理也各不相同，精密度和準(zhǔn)確度以及抗干擾能力也千差萬別。有的適合于輔助診斷，則要求有較高的精密度和準(zhǔn)確度比如高效液相色譜法（HPLC），是目前為國際公認(rèn)的檢測HbA1c的金標(biāo)準(zhǔn)，但其缺點是易受異常血紅蛋白的影響，且價格較高;有的適合于床邊檢測（POCT），目前主要方法有兩種，第一種是顯色親和層析法，在親和層析法的基礎(chǔ)上將硼酸根陰離子改成水溶性藍(lán)色苯硼酸染料，第二種是熒光免疫法[9]，其是糖代謝控制情況和糖尿病性昏迷等并發(fā)癥風(fēng)險評判的最好的方法[10];現(xiàn)有一種HbA1c檢測試劑剛上市，它不須要投入任何設(shè)備，檢測卡上有個云實驗室的識別碼，在卡上加血樣反應(yīng)后用安裝有相應(yīng)APP的手機(jī)同時掃描檢測區(qū)和識別碼，信號傳輸?shù)皆茖嶒炇覚z測，幾秒后檢測結(jié)果便傳到手機(jī)上，這很適合于基層社區(qū)醫(yī)院推廣使用。

參考文獻(xiàn)：

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[2]王少婷，劉倩，于洋，王艷，曹永彤.糖化血紅蛋白的檢測方法及標(biāo)準(zhǔn)化研究進(jìn)展[J].中日友好醫(yī)院學(xué)報，2019，33（01）：38-40+44.

[3]楊日東.糖化血紅蛋白臨床檢測方法的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)理論與實踐，2017，30（11）：1594-1596.

[4]趙瑩.糖化血紅蛋白實驗室檢測技術(shù)及方法學(xué)進(jìn)展[J].中國醫(yī)療器械信息，2020，26（10）：25-26

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[6]肖翔，鐘陽青，陳艷清，賈建，張偉龍，潘理想.毛細(xì)管電泳法檢測糖化血紅蛋白的方法學(xué)性能評價[J].中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新，2018，15（11）：126-130.

[7]Lee Soo Suk. Novel Detection Technology for Glycated Hemoglobin using Gold Nanoparticles[J].Journal of Sensor Science and Technology，2016，25（6） ： 435-439.

[8]王瀟，宓現(xiàn)強(qiáng).16通道無標(biāo)記型糖化血紅蛋白檢測免疫傳感器的構(gòu)建[J].檢驗醫(yī)學(xué)，2019，34（09）：835-840.

[9]李新華，趙珂，魏芳，丁文宇，張勇，黃亞麗.顯色型親和層析法檢測糖化血紅蛋白的建立及性能評估[J].中國糖尿病雜志，2016，24（10）：892-896.

[10]Girlescu Nona et al.Thanatochemical Study of Glycated Hemoglobin in Diabetic Status Assessment[J]. Medicina， 2021， 57（4）：342-342.