MUS81基因多態(tài)性與EBV相關(guān)腫瘤的相關(guān)性

趙帥,張勇,劉雯,張巖

(1 青島大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病原生物學系,山東 青島 266071； 2 山東大學齊魯醫(yī)院(青島)醫(yī)學影像中心； 3 淄博市中心醫(yī)院檢驗科)

EB病毒(EBV)屬人類皰疹病毒4型，感染全球超過95%的成年人[1]。EBV感染與多種人類腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，如伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、鼻咽癌、胃癌等[2-3]。EBV相關(guān)腫瘤組織中，幾乎所有的腫瘤細胞均可檢測到EBV基因組，且其末端重復序列的數(shù)目均相同，提示EBV感染發(fā)生在腫瘤形成的早期[4]，但EBV誘導腫瘤形成的細胞及分子機制尚不明了。誘導宿主細胞基因組的不穩(wěn)定是EBV相關(guān)腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，EBV潛伏感染往往伴隨著DNA損傷修復失調(diào)引起的非克隆性染色體異常[5-6]。MUS81基因是新近發(fā)現(xiàn)的重要的DNA損傷修復基因，在乙烷磺酸鹽和紫外線引起的DNA損傷的識別、修復以及維持DNA復制穩(wěn)定中發(fā)揮著重要的作用[7]。多項研究證實，MUS81基因異常表達與多種人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8-10]?；蚨鄳B(tài)性，如單核苷酸多態(tài)性(SNP)，可能通過對DNA損傷修復基因的調(diào)控影響不同個體對腫瘤的易感性而導致相關(guān)腫瘤的發(fā)生[11]，已被廣泛用作診斷和評估某些疾病和腫瘤風險及預后的生物標記物。但目前尚未見MUS81基因多態(tài)性與胃癌、鼻咽癌、淋巴瘤及病毒感染相關(guān)性報道。因此，本研究選取3個MUS81基因高突變多態(tài)性位點進行檢測分析，探討其與EBV相關(guān)腫瘤的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 組織標本

本研究所用胃癌、鼻咽癌、淋巴瘤腫瘤標本共計403例，均來自青島大學附屬醫(yī)院和青島市市立醫(yī)院病理科，包括胃癌組織標本158例，病人男136例，女22例，平均年齡(56.39±11.33)歲；鼻咽癌組織標本104例，病人男76例，女28例，平均年齡(46.24±15.01)歲；淋巴瘤組織標本141例，病人男83例，女58例，平均年齡(46.71±18.89)歲。所有標本均經(jīng)病理學檢查確診。隨機選取113例健康成人乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝外周血5 mL作為正常對照(NC)，經(jīng)離心分離取單核細胞并提取DNA備用。

1.2 EBV陽性腫瘤的鑒定

采用原位雜交技術(shù)檢測石蠟包埋組織標本中EBV編碼小RNA1(EBER1)，EBER1特異性寡核苷酸反義探針(AGACACCGTCCTCACCACCCG-GGACTTGTA)參考文獻方法設(shè)計并由Roche公司合成[12]。采用Roche公司Dig Oligonucleotide 3′-end Labeling kit標記，陽性者為EBV陽性標本。

1.3 DNA提取

采用蛋白酶K消化和酚-氯仿法提取外周血與新鮮組織標本DNA，石蠟包埋組織DNA抽提試劑盒(QIAGEN，德國)提取石蠟包埋組織的DNA。采用NanoPhotometer P360(IMPLEN,德國)檢測各樣本DNA濃度和純度，所有樣本DNA濃度需介于0.05～0.50 g/L之間，以滿足飛行時間質(zhì)譜技術(shù)檢測要求。

1.4 基因多態(tài)性檢測

所有DNA樣本均送華大基因公司，采用飛行時間質(zhì)譜技術(shù)檢測MUS81基因rs13817、rs648732和rs659857位點的基因型，引物序列和延長探針序列見表1。

表1 飛行時間質(zhì)譜技術(shù)檢測所用引物和探針序列

1.5 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 24.0(IBM)軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)間比較采用卡方檢驗和Fisher精確概率檢驗(雙側(cè))，以P<0.05為差異有顯著性。用比值比(OR)和95%置信區(qū)間(CI)表示等位基因的風險系數(shù)。

2 結(jié) 果

本研究EBER1原位雜交篩選出EBV陽性胃癌(EBVaGC)48例、EBV陽性鼻咽癌(EBVaNPC)49例和EBV陽性淋巴瘤(EBVaL)93例。本研究對照組中MUS81基因3個SNP位點的基因頻率均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

2.1 rs13817位點與胃癌、鼻咽癌和淋巴瘤相關(guān)性

EBVaGC rs13817位點基因型分布與NC相比差異有顯著性(χ2=7.183，P<0.05)，EBVaGC基因型AA的頻率(16.67%)較NC明顯升高(OR=4.320，95%CI=1.334～13.986，P=0.009)，而其他組間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，提示基因型AA可能是EBVaGC的危險因素。EBVaGC rs13817位點等位基因A的頻率顯著高于NC(χ2=4.917，P<0.05)，而EBV陰性胃癌(EBVnGC)與NC比較以及EBVaGC與EBVnGC比較差異均無顯著意義(P>0.05)，結(jié)果提示等位基因A可能是EBVaGC危險因素。EBVaNPC、EBV陰性鼻咽癌(EBVnNPC)、EBVaL和NC各組比較，rs13817位點基因型和等位基因頻率差異均無顯著性(P>0.05)。見表2。

表2 各組rs13817位點基因型和等位基因頻率的比較

2.2 rs648732位點與胃癌、鼻咽癌和淋巴瘤相關(guān)性

EBVaGC、EBVnGC、EBVaNPC、EBVnNPC、EBVaL、EBV陰性淋巴瘤(EBVnL)與NC相比較，rs648732位點基因型分布差異均無顯著性(P>0.05)。EBVaGC T等位基因的頻率顯著高于NC(OR=1.818，95%CI=1.093～3.025，P=0.021)，提示rs648732位點等位基因T可能是EBVaGC的危險因素。見表3。

表3 各組rs648732位點基因型和等位基因頻率的比較

2.3 rs659857位點與胃癌、鼻咽癌和淋巴瘤相關(guān)性

本研究EBVaGC rs659857位點基因型分布與EBVnGC、NC比較差異均有顯著意義(χ2=25.077、28.741，P<0.01)，其雜合基因型TC明顯缺失。EBVaNPC TC基因型頻率低于NC(χ2=14.759，P<0.01)，與EBVnNPC比較差異無顯著性(P>0.05)。EBVaL和EBVnL TC基因型頻率與NC比較差異均有顯著性(χ2=14.124、16.455，P<0.01)，而EBVaL與EBVnL比較則差異無顯著意義(P>0.05)。上述結(jié)果提示，雜合基因型TC減少可能為上述腫瘤的危險因素。EBVaNPC、EBVaL、EBVnL的T等位基因頻率均明顯高于NC(χ2=7.141～9.416，P<0.01)，提示等位基因T可能為上述腫瘤的危險因素。見表4。

表4 各組rs659857位點基因型和等位基因頻率的比較

3 討 論

腫瘤的形成受多種因素的影響，例如微生物因素、個體的易感性、毒物、生活習慣等，基因不穩(wěn)定也是其中一個重要的因素。誘導宿主細胞基因組的不穩(wěn)定是EBV相關(guān)腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，EBV潛伏感染過程中往往伴隨著DNA損傷修復失調(diào)引起的染色體異常[5-6]。研究證實，重要的DNA損傷修復基因SNP對個體腫瘤的易感性有重要的影響[11,13]。LOIZIDOU等[14]研究表明，MUS81基因rs545500位點的SNP可使該位點的氨基酸從精氨酸變成脯氨酸殘基，能夠提示乳癌發(fā)生的高風險。有文獻報道，部分位點的SNP能夠增加病毒感染的風險，是某些病毒相關(guān)疾病的危險因素[15-16]。

本研究結(jié)果顯示，EBVaGC rs13817位點基因型AA和等位基因A頻率明顯高于正常對照，提示兩者可能是EBVaGC的危險因素。同樣，EBVaGC rs648732位點等位基因T頻率明顯高于正常對照，提示該位點等位基因T可能為EBVaGC的危險因素。胃癌發(fā)生與基因多態(tài)性的關(guān)系已有文獻報道[17-18]，而近年來，亦有胃癌基因多態(tài)性與EBV感染相關(guān)性的研究報道[19-20]。EBVaGC的發(fā)病機制和臨床病理特征均異于EBVnGC，EBV潛伏感染是其重要致病機制。本文結(jié)果表明，MUS81基因多態(tài)性與EBV相關(guān)胃癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。本研究未顯示MUS81基因rs13817、rs648732位點多態(tài)性與鼻咽癌、淋巴瘤及其EBV潛伏感染有明顯相關(guān)性。

本文結(jié)果還顯示，在EBVaGC及EBVaNPC中，MUS81基因rs659857位點雜合基因型TC明顯減少，而在EBV陽性和陰性淋巴瘤中均存在此現(xiàn)象，提示在EBV相關(guān)上皮細胞性腫瘤中，rs659857位點與EBV潛伏感染密切相關(guān)，而在淋巴細胞性腫瘤中則與EBV感染無關(guān)。推測這種現(xiàn)象可能與腫瘤的發(fā)病機制不同相關(guān)，鼻咽癌和胃癌為上皮細胞性腫瘤，而淋巴瘤為淋巴細胞性腫瘤，且其分型較多，發(fā)病機制復雜[21-23]。目前已有多項研究結(jié)果表明，SNP可能參與淋巴瘤的形成且與EBV潛伏感染密切相關(guān)[24]。HLA-DPB1基因附近rs6457715位點的多態(tài)性與霍奇金淋巴瘤及EBV潛伏感染相關(guān)，該區(qū)域可能是一個新的霍奇金淋巴瘤易感位點[25]。特殊位點的雜合型缺失能夠引起某些抑癌基因的失活從而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[26]。盡管這種雜合型缺失在多種實體腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，但具體的分子機制仍不清楚。依據(jù)本研究結(jié)果，推測在上皮細胞性腫瘤鼻咽癌和胃癌中，rs659857位點的雜合型缺失與EBV的潛伏感染可能共同作用參與腫瘤的發(fā)生。

綜上所述，本研究首次探討了MUS81基因多個位點的多態(tài)性與EBV相關(guān)腫瘤的相關(guān)性，結(jié)果表明，rs13817、rs648732和rs659857位點多態(tài)性與EBV相關(guān)腫瘤存在相關(guān)性，MUS81基因的多態(tài)性可作為EBV相關(guān)腫瘤的標志物。