克氏原螯蝦“五月瘟”致病菌的分離鑒定與藥敏試驗

李旭東，艾曉輝，劉永濤，童桂香，韋信賢*，楊移斌*

(1.中國水產(chǎn)科學研究院長江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430223；2.河南省水產(chǎn)技術(shù)推廣站，河南 鄭州 450008；3.廣西水產(chǎn)科學研究院，廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點實驗室，廣西 南寧 530021)

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)，俗稱小龍蝦，隸屬于節(jié)肢動物門、甲殼綱、十足目、螯蝦科、原螯蝦屬(Procambarus)，原產(chǎn)于北美洲[1]。1930年經(jīng)日本引進到中國進行養(yǎng)殖，因其食性雜、生長速度快、環(huán)境適應能力強，并且肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)成分豐富等因素，使得克氏原螯蝦消費量呈現(xiàn)暴發(fā)式增長[2]。

據(jù)《中國小龍蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展報告(2019)》[3]顯示，2007—2018年，小龍蝦產(chǎn)量由26.55萬t激增至163.87萬t，增長率達517.21%，僅2018年與2017年相比，小龍蝦總產(chǎn)量增長45.07%。2018 年中國小龍蝦全社會經(jīng)濟總產(chǎn)值3 690億元，同比增長37.50%。以上數(shù)據(jù)表明小龍蝦正成為養(yǎng)殖戶重要經(jīng)濟收入來源。

隨著人們對小龍蝦消費需求的日益增長，其養(yǎng)殖面積及規(guī)模不斷擴大，致使小龍蝦養(yǎng)殖環(huán)境不斷惡化小龍蝦病害頻發(fā)。目前國內(nèi)報道引起小龍蝦死亡的病原有很多，包括細菌、病毒和寄生蟲等，這些疾病的暴發(fā)給快速發(fā)展的小龍蝦產(chǎn)業(yè)蒙上了一層陰影[4-6]。

近年來，在5月份的小龍蝦疾病多發(fā)，且死亡率高，養(yǎng)殖戶稱此階段為小龍蝦“五月瘟”。為了解決實際生產(chǎn)問題，本研究深入湖北的多個小龍蝦養(yǎng)殖主產(chǎn)區(qū)，對養(yǎng)殖戶口中的“五月瘟”疾病進行流行病學調(diào)查，并取樣進行分析，為小龍蝦“五月瘟”的防控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

患病克氏原螯蝦采自湖北荊州、孝感、咸寧、荊門及黃岡等地養(yǎng)殖場。健康克氏原螯蝦購自武漢白沙洲水產(chǎn)批發(fā)市場，體重(20±2)g，健康無傷病，活力強，暫養(yǎng)7 d無異常后用于試驗。

1.1.2 試劑

普通營養(yǎng)瓊脂及肉湯、MH瓊脂、藥敏紙片及細菌生化微量鑒定管均購自杭州微生物試劑有限公司；PCR 所用試劑、特異性引物及細菌基因組DNA 提取試劑盒均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 流行病學調(diào)查及臨床診斷

對患“五月瘟”的克氏原螯蝦主要癥狀、發(fā)病時養(yǎng)殖及周邊環(huán)境以及危害對象、程度及規(guī)模進行調(diào)查，了解用藥史及采取的防控措施等情況，并進行現(xiàn)場解剖診斷觀察。

1.2.2 細菌分離純化

取每批瀕死并具有典型癥狀的克氏原螯蝦10只，體表經(jīng)75%酒精擦拭后于無菌操作臺內(nèi)解剖，取其肝胰腺，利用無菌接種環(huán)取肝胰腺少許組織劃線于營養(yǎng)瓊脂平板上，置于恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)24 h，挑取形態(tài)大小相近、顏色一致的菌落平板進一步純化培養(yǎng)。將分離純化得到的菌株與30%甘油混合均勻，保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 回歸感染

根據(jù)Koch法則及鑒定結(jié)果[7]，選擇2株(分別編號為：XX01和XX02)細菌進行回歸感染試驗以檢測其致病性。將分離株在28 ℃的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h，在4 ℃下4 000 r/min離心5 min收集菌體，然后用無菌PBS緩沖液重新懸浮，將細菌懸液濃度調(diào)整至試驗所需濃度4 ℃放置備用。

將600只健康克氏原螯蝦隨機分為6組，即實驗組A、B、C、D和E組，對照組F組，每組100只克氏原螯蝦。其中A組和B組，每只克氏原螯蝦注射0.1 mL的XX01菌液，每只劑量分別為103、106CFU；C組和D組，每只克氏原螯蝦注射0.1 mL的XX02菌液，每只劑量分別為103、106CFU；E組每只克氏原螯蝦注射0.1 mL的XX01與XX02 1∶1(V∶V)混合菌液，每只注射混合菌液總劑量為106CFU；對照組F，每只克氏原螯蝦注射相同劑量的無菌PBS。

在實驗過程中，溶解氧保持在7.5～8.5 mg/mL，水溫為24～26 ℃，用完全曝氣的自來水進行養(yǎng)殖，感染實驗周期為7 d。每天記錄臨床癥狀和死亡率。同時對死亡的克氏原螯蝦進行解剖，并進行細菌分離純化及鑒定。

1.2.4 分子鑒定

將分離菌株接種于腦心浸出液，置于搖床恒溫28 ℃培養(yǎng)24 h，菌液經(jīng)高速離心后收集菌體，提取DNA作為PCR擴增模板。細菌16S rRNA序列擴增通用引物為27F：5'-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。參照王小亮等[8]方法進行PCR反應擴增目的基因。擴增產(chǎn)物確定為目的片段后送上海生工進行純化及序列測定。

將分離株16S rDNA基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行比對，根據(jù)比對結(jié)果下載同源性較高的序列，采用Clustal X軟件進行多序列匹配分析，通過MEGA5.1 軟件Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，1 000次Bootstrap檢驗置信度。

1.2.5 生化鑒定

將分離菌株劃線于營養(yǎng)瓊脂平板上于28 ℃培養(yǎng)24 h后，挑菌落進行革蘭氏染色，參照文獻[9]測定，使用微量生化反應管測定分離菌株主要的理化指標。

1.2.6 藥敏特性分析

分離株XX01及XX02的藥敏特性分析參照NC-CLS抗微生物藥物敏感性實驗執(zhí)行標準采用K-B法進行[10]。將分離株XX01及XX02接種于營養(yǎng)肉湯中，28 ℃恒溫震蕩(200 r/min)培養(yǎng)24 h，用PBS稀釋成濃度為107CFU/mL的菌懸液，取100 μL菌液涂布于MH瓊脂上，在平板表面貼上選擇好的藥敏紙片，將平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈大小。參照杭州微生物公司藥敏紙片說明書進行敏感度判定。

1.2.7 治療研究

根據(jù)分離株藥敏特性研究結(jié)果，選擇對二者高度敏感且允許使用的藥物進行臨床治療實驗。選擇自然發(fā)病的克氏原螯蝦養(yǎng)殖池A、B、C和D，使用所選定的藥物進行治療研究。A池使用選定藥物加黃芪多糖(質(zhì)量比為1∶1，20 mg/kg蝦體重)、B池僅使用選定藥物(20 mg/kg蝦體重)、C池僅使用黃芪多糖(20 mg/kg蝦體重)及D組對照組。在實驗過程中保證水質(zhì)指標均符合漁業(yè)用水標準(GB 11607— 1989)，并將死亡克氏原螯蝦及時撈出。每天記錄克氏原螯蝦臨床表現(xiàn)、癥狀及死亡率。

2 結(jié)果

2.1 病原確定

調(diào)查發(fā)現(xiàn)克氏原螯蝦“五月瘟”發(fā)病周期較長，一般為每年3～7月，發(fā)病高峰期主要集中在5月，發(fā)病水溫一般為25～30 ℃，發(fā)病死亡率高，治療難度大，而此時也正好是克氏原螯蝦大規(guī)模上市及二次投苗的時間，給養(yǎng)殖戶造成的經(jīng)濟損失很大。發(fā)病克氏原螯蝦主要癥狀表現(xiàn)為活力低下、有肌無力癥、反應遲鈍，解剖后發(fā)現(xiàn)腸道及肝胰腺有出血點、鰓部發(fā)黑等癥狀。湖北各地克氏原螯蝦主養(yǎng)區(qū)均有暴發(fā)。

實驗共取樣137份帶回實驗室進行病原檢測，未發(fā)現(xiàn)寄生蟲等感染。細菌分離純化到的菌株2種，編號為XX01及XX02，其中僅檢出XX01的樣本占25.54%，僅檢出XX02占12.42%，二者均檢出的占62.04%。

經(jīng)回歸感染試驗，結(jié)果顯示XX01株在106CFU/只克氏原螯蝦劑量下，克氏原螯蝦全部死亡，而103CFU/只克氏原螯蝦劑量下，克氏原螯蝦發(fā)病率、死亡率均不高；而XX02分離株在106CFU/只克氏原螯蝦劑量時7 d內(nèi)死亡率僅31%，在103CFU/只克氏原螯蝦劑量下幾乎無死亡；XX01與XX02分離株1∶1混合后以106CFU/只劑量感染克氏原螯蝦，引起的死亡率與XX01單獨106CFU/只劑量感染克氏原螯蝦一致，但死亡速率更快；對照組F組未出現(xiàn)異常。分別從試驗組死亡的克氏原螯蝦體內(nèi)分離到與注射菌株形態(tài)特征及理化特性一致的菌株。

2.2 細菌鑒定

對分離株的16S rDNA基因序列與NCBI中已有序列比對，顯示分離株XX01與氣單胞菌屬種類同源性最高，而分離株XX02與檸檬酸桿菌屬種類同源性最高，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，菌株XX01與嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)聚為一支，菌株XX02與弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)聚為一支。分離株的主要理化特性見表1～2，顯示菌株XX01理化特性與嗜水氣單胞菌一致，菌株XX02理化特性與弗氏檸檬酸桿菌一致。結(jié)合分離株主要理化特性測定結(jié)果，綜合判定XX01為嗜水氣單胞菌，XX02為弗氏檸檬酸桿菌。

圖1 回歸感染實驗結(jié)果Fig.1 Regression infection test results

圖2 基于16S rRNA構(gòu)建的關(guān)于XX01 和 XX02的進化樹Fig.2 Phylogenetic tree for 16S rRNA sequence of XX01 and XX02

表1 菌株XX01的生化特性Tab.1 Physiologic and biochemical characteristics of XX01 bacterial strain

2.3 藥敏特性

研究測定了分離株XX01及XX02對8類19種抗生素的敏感性。結(jié)果表明兩種分離株對新霉素、阿奇霉素、四環(huán)素、強力霉素、依諾沙星、諾氟沙星、氯霉素及氟苯尼考等8種抗生素高度敏感，其中氟苯尼考、強力霉素及新霉素在水產(chǎn)上允許使用，具體見表3。

表2 菌株XX02的生化特性Table 2 Physiologic and biochemical characteristics of XX02 bacterial strain

表3 菌株XX01及XX02的藥敏特性Table 3 Susceptibility of XX01 and XX02 to antibiotics

根據(jù)分離株藥敏特性結(jié)果，選擇氟苯尼考搭配黃芪多糖作為治療藥物。研究發(fā)現(xiàn)A組治愈率最高，一個療程內(nèi)死亡率明顯下降；B組與對照組死亡率接近；C組死亡率首先急劇下降，克氏原螯蝦活力增強，第5天左右死亡率出現(xiàn)反彈，治療效果一般。

3 討論

本研究經(jīng)廣泛調(diào)查取樣，基本確定了克氏原螯蝦“五月瘟”典型癥狀。從所取137份樣品中分離到2株優(yōu)勢菌，二者混合感染率在62.04%。之所以會出現(xiàn)僅分離到單株優(yōu)勢菌的情況，本研究認為可能是取樣劃線的誤差以及感染菌量等導致的，實際很可能是所有樣品中都存在兩種菌株感染。經(jīng)回歸感染發(fā)現(xiàn)，分離株均可導致克氏原螯蝦發(fā)病死亡，與以往研究結(jié)果一致[11-12]，并能從發(fā)病死亡個體上再分離到感染菌株。研究結(jié)果在一定程度可證實此次分離株對克氏原螯蝦存在毒性，是克氏原螯蝦“五月瘟”的重要病原，而嗜水氣單胞菌是主要致死菌株。本研究也證明了“五月瘟”可能是多病原多重感染導致的，這與唐慶權(quán)[13]等研究結(jié)果一致。從回歸感染結(jié)果看，單獨的分離株XX02致病能力并不強，而低濃度XX01致病能力也不強，但二者1∶1混合后，毒力明顯增強，推測二者之間可能存在協(xié)同作用。

目前水產(chǎn)動物疾病防控仍然以化藥為主，抗生素是其中重要代表[14]。但是因抗生素大量無序、盲目使用，常導致水產(chǎn)動物病原菌耐藥株出現(xiàn)，給水產(chǎn)動物病害治療帶來了極大的麻煩。因此為達到精準用藥的目的，必須準確診斷，確定病原病因，并根據(jù)病原的藥物敏感特性有針對性地選擇藥物。

本研究結(jié)果表明兩種分離株均對氟苯尼考、新霉素、阿奇霉素及四環(huán)素等8種抗生素高度敏感。因此本研究使用分離株共同敏感的藥物氟苯尼考進行治療研究，配合黃芪多糖共同使用取得了很好的療效。治療方案的制定做到了疾病準確診斷，根據(jù)病原藥敏特性選擇相應藥物可以達到高效治療疾病的目的。在研究治療效果時，配合黃芪多糖使用，則是因為黃芪多糖具有一定的排毒增強免疫的效果[15]。在實際水產(chǎn)動物細菌性疾病治療過程中，通常會在治療中后期出現(xiàn)一個死亡高峰，主要原因是水產(chǎn)動物細菌性疾病多為革蘭氏陰性菌，其死亡后會釋放大量的內(nèi)毒素，導致病魚加速死亡，此次治療研究添加黃芪多糖就是解決此關(guān)鍵問題，這項成果已經(jīng)得到廣大一線魚病技術(shù)人員的認可。細菌的耐藥性不同，其可能原因在于養(yǎng)殖環(huán)境、地域及用藥差異等造成的[16]。為此在水生動物病害防控時，有必要每次都測定其藥物敏感特性，選擇高度敏感而且允許使用的藥物，按照商品藥物說明書并在獸醫(yī)師指導下使用。