甘薯全基因組WRKY轉(zhuǎn)錄因子的基因鑒定與逆境脅迫表達(dá)分析

畢楚韻，黃小芳，王和壽，陳其俊，胡韻卓，黃碧芳，許 明，楊志堅，林世強(qiáng),，陳選陽,1d

(1福建農(nóng)林大學(xué)a作物生物技術(shù)福建省高校重點實驗室,b農(nóng)學(xué)院,c生命科學(xué)學(xué)院,d教育部作物遺傳育種與綜合利用重點實驗室,福建 福州 350002;2 寧德市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局,福建 寧德 352100;3 福建省種子總站,福建 福州 350003)

在植物生長發(fā)育過程中，植物免疫系統(tǒng)通過轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控基因表達(dá)來抵御病蟲害和非生物脅迫[1]。轉(zhuǎn)錄因子通常以家族的形式存在，植物的重要轉(zhuǎn)錄因子家族有WRKY、MYB、HLH、NAC等，其中WRKY轉(zhuǎn)錄因子是高等植物中最為常見的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中有72個[2]、水稻(Oryzasativa)中有102個[3]、棗樹(ZiziphusjujubaMill.)中有54個[4]。在結(jié)構(gòu)方面，WRKY轉(zhuǎn)錄因子具有高度保守的序列，其蛋白N端一般包含WRKYGQK七肽序列構(gòu)成的WRKY結(jié)構(gòu)域，隨后是C2H2(CX4-5CX22-23HXH)或C2HC(CX7CX23HXC)組成的鋅指結(jié)構(gòu)[5]。在功能方面，WRKY轉(zhuǎn)錄因子參與植物響應(yīng)生物脅迫和非生物脅迫，例如擬南芥AtWRKY33調(diào)控植物對抗葡萄孢菌(Botrytiscinerea)的激素合成[6]，過表達(dá)水稻OsWRKY6能使水稻(Oryzasativa)對病原物產(chǎn)生更強(qiáng)的抗性[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)WRKY轉(zhuǎn)錄因子增強(qiáng)植物對生物脅迫的耐受性時，同時會一定程度上降低對另一種脅迫的抗性[8]。在擬南芥中過量表達(dá)楊樹(Populustrichocarpa)PtrWRKY73可增強(qiáng)植株對丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)的抗性，但對葡萄孢菌(Botrytiscinerea)的抗性則降低[9]。在非生物脅迫下，WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過參與復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程調(diào)控植物的抗性，如在高溫高濕條件下，甜椒(Capsicumannuum)CaWRKY6可通過激活CaWRKY40以增強(qiáng)其耐受性[10]。此外，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物生長發(fā)育，例如種子萌發(fā)和休眠[11]、開花期[12]、葉片衰老[13]等過程中也發(fā)揮著重要作用。

甘薯是重要的糧食作物，也是淀粉加工原料和能源作物，最早被克隆研究的WRKY轉(zhuǎn)錄因子來自甘薯的SPF1[14]。研究表明,SPF1有調(diào)控蔗糖生成的潛在功能，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其N端具有葉綠體定位功能，可能參與細(xì)胞核和葉綠體基因的表達(dá)調(diào)控[15]。然而到目前為止，有關(guān)甘薯WRKY基因結(jié)構(gòu)和功能方面的研究報道仍然較少。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法挖掘甘薯全基因組WRKY轉(zhuǎn)錄因子，并對其序列、保守結(jié)構(gòu)域、潛在復(fù)制關(guān)系等進(jìn)行分析，利用SRA數(shù)據(jù)庫中甘薯在生物脅迫(蔓割病菌侵染)和非生物脅迫(貯藏期低溫)條件下的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析WRKY基因的差異表達(dá)，為甘薯WRKY基因功能與調(diào)控的分子機(jī)制研究以及WRKY基因的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 甘薯全基因組基因注釋

從https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=Ipomoea+batatas下載甘薯全基因組序列[16]。使用擬南芥、水稻和線蟲的HMM模型分別對甘薯染色體蛋白質(zhì)編碼區(qū)進(jìn)行預(yù)測[17]。從結(jié)果文件中隨機(jī)選取500組制作針對甘薯的HMM模型，以此模型預(yù)測得到甘薯全基因組蛋白序列[18]。

1.2 WRKY的基因預(yù)測與鑒定

從Pfam網(wǎng)站[19]下載WRKY(PF03106)的HMM模型，運(yùn)行Hmmsearch檢索甘薯全基因組蛋白序列，選取E值≤4.2×10-11的序列構(gòu)建針對甘薯的HMM模型[20]。以此特異的HMM模型預(yù)測得到124個候選WRKY蛋白序列，上傳至Conserved Domains Tool[21]，篩選得到90個WRKY蛋白候選序列。對這些序列使用InterProScan[22]確認(rèn)WRKY結(jié)構(gòu)域，得到89個WRKY蛋白候選序列。核對每個蛋白序列后，得到56個結(jié)構(gòu)域完整的WRKY蛋白。應(yīng)用AUGUSTUS[23]對其余33個WRKY結(jié)構(gòu)域不完整的基因進(jìn)行序列預(yù)測和校對；同時下載Lin等[16]的甘薯SRA數(shù)據(jù)，將基因序列與轉(zhuǎn)錄組測序得到的read序列進(jìn)行比對，從而修補(bǔ)基因的WRKY結(jié)構(gòu)域序列，得到14個完整的WRKY蛋白，兩組相加共得到70個WRKY蛋白。用擁有完整WRKY結(jié)構(gòu)域的70個WRKY蛋白在甘薯全基因組蛋白庫運(yùn)行Blastp，檢索更多的WRKY候選蛋白序列，再次對序列的WRKY結(jié)構(gòu)域進(jìn)行確定和序列修補(bǔ)，最終得到82個甘薯WRKY蛋白，根據(jù)其相應(yīng)基因在染色體上的位置，以IbWRKY1～I(xiàn)bWRKY82進(jìn)行編號并建立甘薯IbWRKY蛋白數(shù)據(jù)庫。

1.3 WRKY基因序列潛在復(fù)制關(guān)系的分析

對甘薯所有WRKY基因序列進(jìn)行Blastn比對，篩選出序列相似度大于75%并且兩條序列比對上的序列長度大于較長序列長度75%的基因?qū)?，提取基因在染色體上的位置以及基因?qū)Φ臐撛趶?fù)制關(guān)系，使用Circos[24]繪圖。

1.4 WRKY蛋白的亞家族分類

根據(jù)參考文獻(xiàn)[2,5,25-26]的分類依據(jù)，下載擬南芥WRKY蛋白序列(http://www.arabidopsis.org/)與甘薯WRKY蛋白序列進(jìn)行比對分析，分類成各亞家族。

1.5 WRKY蛋白保守結(jié)構(gòu)域序列的分析

應(yīng)用Clustal Omega軟件[27]對WRKY蛋白序列進(jìn)行多序列比對后，使用Jalview軟件[28-29]分析并繪圖。

1.6 WRKY蛋白亞家族系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

利用軟件MEGA X[30]，使用ML(maximum likelihood)方法，并添加擬南芥WRKY蛋白序列后，對甘薯WRKY蛋白序列的各亞家族構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.7 WRKY蛋白保守基序分析

使用MEME[21]對82個甘薯WRKY蛋白進(jìn)行保守基序預(yù)測，保守性基序的數(shù)目限制為10，分別命名為基序1～基序10。

1.8 WRKY基因的抗逆表達(dá)模式分析

從SRA數(shù)據(jù)庫分別下載蔓割病菌[16]和低溫脅迫下的甘薯轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[32]，將82個甘薯WRKY基因序列與甘薯轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比對，提取基因在不同處理組和對照組中的表達(dá)信息。應(yīng)用DESeq2對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，數(shù)據(jù)篩選的Padj設(shè)為小于0.05，只保留以2為底差異表達(dá)倍數(shù)的對數(shù)(log2FoldChange)值大于1或者小于-1的數(shù)據(jù)，使用Pheatmap繪制熱圖。

1.9 甘薯SPF1相似IbWRKY蛋白檢索

從NCBI下載SPF1的氨基酸序列(GenBank ID:BAA06278.1)。本地運(yùn)行Blastp軟件，檢索1.2節(jié)中建立的IbWRKY蛋白數(shù)據(jù)庫，搜索與SPF1相似的蛋白，并使用EMBOSS needle軟件進(jìn)行序列比對和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘薯WRKY轉(zhuǎn)錄因子的鑒定、染色體定位和潛在復(fù)制關(guān)系

經(jīng)鑒定分析，在甘薯全基因組中得到82個WRKY基因，對其進(jìn)行染色體定位，發(fā)現(xiàn)其在15條染色體上分布不均勻(圖1)，其中8號染色體和15號染色體上各僅有1個，12號染色體和14號染色體上最多，均為11個?；蛟谌旧w上的分布可分為2種形式：單個存在和2個及以上在同一區(qū)域形成基因簇。甘薯WRKY基因在多條染色體上存在基因簇，擁有最多基因簇的是12號染色體，有3個基因簇，其中2個基因簇包含3個基因，另1個基因簇包含2個基因。

染色體之間和染色體內(nèi)的潛在復(fù)制基因連線分別為藍(lán)色和橘色I(xiàn)nter-chromosomal and intra-chromosomal potential duplication relationships are represented by blue and orange lines,respectively圖1 甘薯82個WRKY基因在15條染色體上的定位及其潛在復(fù)制關(guān)系Fig.1 Analysis of chromosomal localization and potential duplication relationship of 82 Ipomoea batatas WRKY genes in 15 chromosomes

根據(jù)Gu等[33]確定的基因潛在復(fù)制關(guān)系的分析方法，發(fā)現(xiàn)有25對基因存在潛在復(fù)制關(guān)系，包括10對染色體間潛在復(fù)制基因和15對染色體內(nèi)潛在復(fù)制基因，分布于1、7、8、9、11、12和14號染色體上。11號染色體與12號染色體之間的潛在復(fù)制基因?qū)ψ疃?，?對，但僅涉及4個基因，而且它們之間的位置非常接近。染色體內(nèi)的潛在復(fù)制通常發(fā)生在較為相近的基因之間，例如1號染色體上的3對潛在復(fù)制基因，分別為IbWRKY5與IbWRKY6(距離338 810 bp)、IbWRKY6與IbWRKY4(距離405 185 bp)、IbWRKY4與IbWRKY5(距離64 233 bp)；但也有染色體內(nèi)潛在復(fù)制基因之間的距離較遠(yuǎn)，例如9號染色體上的IbWRKY40與IbWRKY37之間的距離為5 317 598 bp。

2.2 甘薯WRKY亞家族分類與保守結(jié)構(gòu)域的序列分析

按照Eulgem等[2,5,25-26]的WRKY蛋白分類方法，引入擬南芥WRKY蛋白進(jìn)行比對后，可將82個甘薯WRKY蛋白分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3大類，其中Ⅱ類蛋白還可進(jìn)一步分為Ⅱ-a、Ⅱ-b、Ⅱ-c、Ⅱ-d和Ⅱ-e等5個亞類。不同類的蛋白數(shù)量不同，Ⅰ類蛋白18個，Ⅱ-a亞類4個，Ⅱ-b亞類14個，Ⅱ-c亞類20個，Ⅱ-d亞類8個，Ⅱ-e亞類13個，Ⅲ類5個。

為了比較和分析甘薯WRKY蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，截取82個WRKY蛋白中長度約65個氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行多序列比對。結(jié)果顯示絕大多數(shù)Ⅰ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子擁有2個WRKY結(jié)構(gòu)域：Ⅰ-N和Ⅰ-C(分別位于蛋白N端和C端)，WRKY七肽高度一致，而鋅指結(jié)構(gòu)的保守性相對較弱(圖2)。此外，在Ⅰ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子中有少數(shù)缺失保守結(jié)構(gòu)域，例如IbWRKY59和IbWRKY1缺失N端的WRKY結(jié)構(gòu)域，IbWRKY65和IbWRKY42缺失C端WRKY結(jié)構(gòu)域，IbWRKY45和IbWRKY25的C端WRKY結(jié)構(gòu)域缺失鋅指結(jié)構(gòu)域。Ⅲ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子只有1個WRKY結(jié)構(gòu)域，WRKYGQK高度保守，而鋅指結(jié)構(gòu)保守性較弱(圖2)。

依照Clustal X的配色原則[27]，藍(lán)色為疏水性氨基酸，紅色為正電荷氨基酸，紫色為負(fù)電荷氨基酸，綠色為極性氨基酸，粉色為半胱氨酸，橙色為甘氨酸，黃綠色為脯氨酸，藍(lán)綠色為芳香族氨基酸，無配色為非保守性氨基酸。蛋白名斜杠后的數(shù)字為截取的氨基酸范圍。圖3同The amino acids are colored according to the guidelines of Clustal X in reference[27].Blue indicates hydrophilic amino acids,red indicates positively charged amino acids,purple indicates negatively charged amino acids,green indicates polar amino acids,pink indicates cysteines,orange indicates glycine,yellow-green indicatesprolines,and blue-green indicates aromatic amino acids.The non-conservative amino acids are uncolored.The number behind forward slash represents the range of selected amino acids.The same for Fig.3.圖2 甘薯WRKY轉(zhuǎn)錄因子Ⅰ和Ⅲ類WRKY的保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 Conservative domains of subfamily-Ⅰ and subfamily-Ⅲ WRKY transcription factors in Ipomoea batatas

在82個甘薯WRKY轉(zhuǎn)錄因子中，Ⅱ類的數(shù)量最多，占72%。Ⅱ類轉(zhuǎn)錄因子擁有1個保守的WRKY結(jié)構(gòu)域，根據(jù)其結(jié)構(gòu)域的序列差異，分為5個亞類[5]。在截取的長度約為65個氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)域中，Ⅱ-a、Ⅱ-b、Ⅱ-d和Ⅱ-e這4個亞類的保守結(jié)構(gòu)域較為保守，Ⅱ-c亞類的氨基酸序列結(jié)構(gòu)域則存在較多變異(圖3)。

圖3 甘薯WRKY轉(zhuǎn)錄因子Ⅱ類WRKY的保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Conservative domains of subfamily-Ⅱ WRKY transcription factors in Ipomoea batatas

甘薯WRKY蛋白中的WRKY結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)域大部分比較保守，但是在一些WRKY蛋白中存在不同程度的氨基酸序列變異(表1)，其中Ⅱ-c亞類中8個WRKY蛋白存在WRKY結(jié)構(gòu)域序列的氨基酸變異，其WRKYGQK變異為WRKYGKK；鋅指結(jié)構(gòu)域的變異多見于Ⅱ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子，其中Ⅱ-b亞類中最多，變異類別包括鋅指結(jié)構(gòu)中Cys到His之間的氨基酸殘基數(shù)目的增加或減少，例如氨基酸殘基減少的變異形式，由CX5CX23HXH變異為CX5CX16HXH。還有兩個Cys之間的氨基酸殘基的數(shù)量變異，如屬于Ⅱ-d亞類的蛋白由CX5CX25HXH變異為CX6CX25XXX的形式。此外還有一些WRKY蛋白缺失WRKY七肽結(jié)構(gòu)域或鋅指結(jié)構(gòu)，這類缺失除了這些WRKY蛋白本身缺失相應(yīng)結(jié)構(gòu)域的原因之外，也不排除由于基因組質(zhì)量偏低造成[34]。

表1 甘薯WRKY轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域的變異情況Table 1 Variation of conservative domain in Ipomoea batatas WRKY transcription factors

2.3 甘薯WRKY轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了對甘薯WRKY蛋白進(jìn)行更為準(zhǔn)確的分類，引入擬南芥AtWRKY蛋白參與系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。由于WRKY轉(zhuǎn)錄因子Ⅰ類亞家族擁有2個WRKY保守結(jié)構(gòu)域，將蛋白N端的WRKY結(jié)構(gòu)域和C端的WRKY結(jié)構(gòu)域分別獨(dú)立構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，若存在缺失某個WRKY結(jié)構(gòu)域的情況，則該WRKY蛋白只保留另一端的WRKY序列參與進(jìn)化樹構(gòu)建。甘薯和擬南芥的Ⅰ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子保守域進(jìn)化樹如圖4所示。

蛋白名稱+C/N代表該蛋白的C/N端WRKY結(jié)構(gòu)域。節(jié)點處的數(shù)字代表換算成百分?jǐn)?shù)的自助抽樣自展值(例如最右上方的72代表在1 000次的自助抽樣建樹中，IbWRKY62C和IbWRKY44C大約720次為鄰位，四舍五入為72%)。圖5和圖6同The protein name+C/N indicates the WRKY domain in the C/N-terminal domain of the protein.The number at the node denotes the bootstrap value in percentage (for example,the 72 at the top right means there are about 720 out of times,rounding to 72%,that the IbWRKY62C and IbWRKY44C are the nearest neighbors during the bootstrap sampling for phylogenetic tree construction).The same for Fig.5 and Fig.6

由圖4可知，Ⅰ類WRKY家族蛋白的N端與C端WRKY保守結(jié)構(gòu)域序列在進(jìn)化上大部分距離較遠(yuǎn)，大部分蛋白呈現(xiàn)出按物種少量聚集的現(xiàn)象，即包含5～7個節(jié)點的甘薯WRKY分支與擬南芥WRKY分支相鄰。

由圖5可以看出，Ⅱ-a、Ⅱ-b和Ⅱ-c這3個亞類蛋白屬于同一分支，進(jìn)化關(guān)系較近，而Ⅱ-e亞類WRKY蛋白與其他4類蛋白的進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。由圖5還可以看出，甘薯和擬南芥WRKY蛋白在幾個亞類內(nèi)的位置一致，大部分分支中的擬南芥WRKY蛋白和甘薯WRKY蛋白互相交錯排列。

用實心圓、空心圓、空心正方形、實心三角形、空心三角形Ⅱ類甘薯與擬南芥WRKY家族蛋白分別標(biāo)記Ⅱ-e、Ⅱ-d、Ⅱ-b、Ⅱ-a和Ⅱ-c亞類。加粗字體標(biāo)記甘薯WRKY家族蛋白For subfamily-Ⅱ WRKY proteins,the solid circle,hollow circle,hollow square,solid triangle,hollow triangle indicate Ⅱ-e,Ⅱ-d,Ⅱ-b,Ⅱ-a and Ⅱ-c subgroups,respectively.The blod font indicates proteins in I.batatas WRKY family

Ⅱ-c亞類的WRKY蛋白數(shù)量最多，與Ⅱ-a亞類的蛋白從同一分支進(jìn)化而來，進(jìn)化關(guān)系較近，但Ⅱ-c亞類的WRKY蛋白與Ⅱ-e亞類的進(jìn)化關(guān)系最遠(yuǎn)。另外還存在一些只有擬南芥WRKY或甘薯WRKY的分支，例如Ⅱ-b亞類的IbWRKY18所在的進(jìn)化樹分支只包含甘薯WRKY轉(zhuǎn)錄因子。Ⅱ-a亞類的WRKY蛋白數(shù)量最少，且不統(tǒng)一在一個進(jìn)化樹分支內(nèi)，IbWRKY16和IbWRKY14的親緣關(guān)系與Ⅱ-b亞類較近。

甘薯WRKY家族有5個蛋白屬于Ⅲ類，相比擬南芥(13個)較少。從進(jìn)化樹(圖6)上看，甘薯和擬南芥WRKY蛋白整體上分為2個進(jìn)化樹分支，均有甘薯WRKY分布在內(nèi)，其中IbWRKY21和IbWRKY29親緣關(guān)系較近。

圖6 甘薯和擬南芥的Ⅲ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of subfamily-Ⅲ WRKY transcription factors of I. batatas and A. thaliana

2.4 甘薯WRKY轉(zhuǎn)錄因子保守基序分析

應(yīng)用MEME對甘薯82個WRKY蛋白進(jìn)行基序分析，每亞類內(nèi)按照蛋白序列長度排序，結(jié)果見表2和圖7。由圖7結(jié)果可以看出，每個亞類內(nèi)甘薯WRKY家族蛋白的基序比較一致，而亞類間則存在一定的差異性。82個甘薯WRKY蛋白中有70個蛋白內(nèi)部存在基序1-基序4-基序2的基序串，占全部蛋白數(shù)量的85.4%。Ⅰ類WRKY蛋白的N端大多數(shù)都有基序7和基序3，其中基序3為Ⅰ類WRKY家族特有的基序。基序7除了存在于I類蛋白的N端WRKY結(jié)構(gòu)域中，也存在于一些蛋白的C端結(jié)構(gòu)域，如IbWRKY43和IbWRKY51等。Ⅱ-a亞類WRKY蛋白的基序與Ⅱ-b亞類較為相似。Ⅱ-b亞類WRKY蛋白的典型基序串為基序1-基序4-基序2-基序6。Ⅱ-c亞類的蛋白均具有典型的WRKY結(jié)構(gòu)域，個別蛋白還含有基序5；Ⅱ-d亞類蛋白均有基序9(除IbWRKY53外)。Ⅱ-e亞類蛋白的保守基序與Ⅱ-d亞類相似。Ⅲ類WRKY蛋白的基序數(shù)量較少，而Ⅰ類和Ⅱ-b亞類WRKY蛋白的基序種類較為豐富。由圖7和表2可知，10個基序的長度為8～57個氨基酸，其中2個屬于WRKY保守結(jié)構(gòu)域，分別為基序1和基序7；2個屬于鋅指結(jié)構(gòu)，分別為基序2和基序3?；?-基序3形式的基序串只出現(xiàn)在Ⅰ類WRKY蛋白中，是N端WRKY結(jié)構(gòu)域的保守基序；基序4是最短的基序，存在于WRKY七肽結(jié)構(gòu)域與鋅指結(jié)構(gòu)域之間。

表2 甘薯WRKY轉(zhuǎn)錄因子的保守基序長度及其氨基酸序列Table 2 Length and amino acid sequence of motifs for the WRKY transcription factors in I. batatas

左側(cè)羅馬數(shù)字為甘薯WRKY轉(zhuǎn)錄因子所屬的亞類，最下方橫軸為蛋白序列長度軸Roman numbers in the left side represent the subgroups of I. batatas WRKY transcription factors and the lowest horizontal axis indicates length of protein sequences

2.5 甘薯WRKY轉(zhuǎn)錄因子在蔓割病菌侵染下的差異表達(dá)分析

筆者之前用蔓割病強(qiáng)致病菌株F07與非致病菌株F04對甘薯高抗品種JS57(金山57)與高感品種XZH(新種花)進(jìn)行侵染，以莖段作為材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序[16]。本研究利用該轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，經(jīng)過基因表達(dá)差異顯著性分析，篩選到19個存在顯著差異的甘薯WRKY基因(圖8)。由圖8可知，存在差異表達(dá)的WRKY基因類型豐富，分別為Ⅰ類3個、Ⅱ-a亞類2個、Ⅱ-b亞類4個、Ⅱ-c亞類7個、Ⅱ-e亞類2個、Ⅲ類1個。其中Ⅱ-c亞類的WRKY基因最多，Ⅱ-a亞類的IbWRKY14和IbWRKY16在進(jìn)化樹上屬于同一分支，在XZH_F07中均為下調(diào)表達(dá)。Ⅱ-e亞類的IbWRKY67和IbWRKY66進(jìn)化關(guān)系近，但在XZH_F07中分別為下調(diào)和上調(diào)表達(dá)。

XZH_F07代表甘薯品種XZH受F07侵染的試驗組，JS57_F04代表甘薯品種JS57受F04侵染的試驗組，JS57_F07代表甘薯品種JS57受F07侵染的試驗組。熱圖左側(cè)部分為Pheatmap軟件根據(jù)各基因在不同處理中的以2為底差異表達(dá)倍數(shù)的對數(shù)值以歐式距離建立的聚類關(guān)系，熱圖上部為不同處理中包含的所有基因以2為底差異表達(dá)倍數(shù)的對數(shù)值以歐式距離建立的聚類關(guān)系，右側(cè)色卡代表相應(yīng)的以2為底差異表達(dá)倍數(shù)的對數(shù)值。圖9同The XZH_F07 indicates the test group of I.batatas cultivar XZH infected by F07.The JS57_F04 indicates the test group of I. batatas cultivar JS57 infected by F04.The JS57_F07 indicates the test group of I. batatas cultivar JS57 infected by F07.The left part of the heat map shows the clustering relationship among the different genes with regard to the log2FoldChanges based on the Euclidean distance according to the Pheatmap.The top part of the heat map shows the clustering relationship among the different treatments in terms of the comprised genes with regard to the log2FoldChanges based on the Euclidean distance.The color card in the right side indicates the corresponding log2FoldChange values.The lines in the left and up sides indicate the data clustering and thecolor card in the right side indicates the corresponding log2 FoldChange values.The same for Fig.9圖8 甘薯WRKY基因在甘薯蔓割病菌脅迫下的差異性表達(dá)Fig.8 Differential expression of WRKY genes in I. batatas under the stress of Fusarium oxysporum f. sp.batatas

對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析表明，高感品種XZH在強(qiáng)致病菌株F07侵染后，許多WRKY基因出現(xiàn)了較為明顯的上調(diào)或下調(diào)變化；而高抗品種JS57在F07侵染條件下，只有IbWRKY82基因表達(dá)顯著下調(diào)(以2為底差異表達(dá)倍數(shù)的對數(shù)為-2.83)。JS57_F04中大部分存在差異表達(dá)的WRKY基因為上調(diào)。在XZH_F07中下調(diào)表達(dá)的基因在JS57_F04中為上調(diào)表達(dá)，如IbWRKY67、IbWRKY63和IbWRKY64；或差異未達(dá)顯著性，如IbWRKY76。IbWRKY82在JS57受到非致病菌株F04侵染后下調(diào)表達(dá)(以2為底差異表達(dá)倍數(shù)的對數(shù)為-2.63)，但在XZH_F07試驗組內(nèi)為上調(diào)表達(dá)(以2為底差異表達(dá)倍數(shù)的對數(shù)為2.05)。

2.6 甘薯WRKY轉(zhuǎn)錄因子在塊根儲藏期低溫條件下的差異表達(dá)分析

低溫儲存是延長甘薯貨架期的重要方式，但在較低溫度條件下，會導(dǎo)致源于熱帶的甘薯受到冷害。Ji等[32]對低溫敏感甘薯品種Xushu 15-4和對低溫耐受性較好的Xushu 15-1，分別設(shè)置4 ℃條件貯存2周或6周，進(jìn)行甘薯塊根儲藏期低溫試驗，分別測得2個品種的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。以該轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，分析甘薯在低溫儲藏過程中WRKY基因的差異表達(dá)情況，結(jié)果如圖9所示。由圖9可知，82個甘薯WRKY基因有34個存在表達(dá)差異。其中Ⅰ類WRKY基因最多，達(dá)到13個；其余分別為Ⅱ-a亞類1個，Ⅱ-b亞類3個，Ⅱ-c亞類8個，Ⅱ-d亞類4個，Ⅱ-e亞類3個，Ⅲ類2個。4個處理中均存在WRKY基因表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的情況，以2為底差異表達(dá)倍數(shù)的對數(shù)值為-6.42～8.60；下調(diào)表達(dá)的WRKY基因數(shù)量(18個)略多于上調(diào)表達(dá)的基因數(shù)(16個)。

Xushu 15-1_6w代表甘薯品種Xushu 15-1冷藏6周的試驗組，Xushu 15-4_2w代表甘薯品種Xushu 15-4冷藏2周的試驗組，Xushu 15-1_2w代表甘薯品種Xushu 15-1冷藏2周的試驗組，Xushu 15-4_6w代表甘薯品種Xushu 15-4冷藏6周的試驗組The Xushu 15-1_6w indicates the test group of I. batatas cultivar Xushu 15-1 stored at low temperature for 6 weeks.The Xushu 15-4_2w indicates the test group of I. batatas cultivar Xushu 15-4 stored at low temperature for 2 weeks.The Xushu 15-1_2w indicates the test group of I. batatas cultivar Xushu 15-1 stored at low temperature for 2 weeks.The Xushu 15-4_6w indicates the test group of I. batatas cultivar Xushu 15-4 stored at low temperature for 6 weeks圖9 甘薯WRKY基因在甘薯低溫脅迫下的差異性表達(dá)Fig.9 Differential expression of WRKY genes in I. batatas under low temperature stress

不同甘薯WRKY基因在冷藏2周、6周和整個冷藏過程中的差異表達(dá)情況不同，僅在冷藏2周、6周和冷藏全期存在差異表達(dá)的WRKY基因數(shù)分別有7，5和21個。有些WRKY基因在2個甘薯品種塊根中冷藏全期存在表達(dá)差異，可以觀察到在6周時，Xushu 15-4塊根中WRKY基因差異表達(dá)的幅度相比冷藏2周時更低，而甘薯Xushu 15-1仍保持著較高的差異水平。有些基因只在Xushu 15-1塊根中存在差異表達(dá)，而在Xushu 15-2中冷藏全期均不存在差異表達(dá)，如IbWRKY33、IbWRKY63和IbWRKY64等。由此可見，不同低溫敏感度的甘薯品系間存在表達(dá)差異的WRKY基因，其可能參與甘薯對低溫脅迫的響應(yīng)。

2.7 甘薯SPF1蛋白與IbWRKY蛋白的比較

1994年，Ishiguro等[14]從甘薯高系14(Kokei no.14)中克隆出第1個WRKY基因，取名為SPF1。本研究從NCBI下載SPF1的氨基酸序列，在建立的WRKY蛋白數(shù)據(jù)庫內(nèi)檢索，結(jié)果得到4個相似蛋白，分別為IbWRKY32、IbWRKY44、IbWRKY63和IbWRKY64，這4個蛋白的氨基酸序列與SPF1的氨基酸序列一致度分別為85.4%,52.0%,50.5%和38.4%。IbWRKY32與SPF1的一致度最高，位于第7號染色體上的第9 504 956～9 514 219 位核苷酸處。SPF1與IbWRKY32的氨基酸個數(shù)分別為549和582個，在SPF1蛋白的第29～549區(qū)域內(nèi)，IbWRKY32與SPF1的氨基酸序列完全一致(一致度為100%)，占SPF1蛋白序列全長的95%(圖10)。不同之處在于，IbWRKY32的N端氨基酸比SPF1少而C端氨基酸比SPF1多，這種差異可能與甘薯品種差異或基因組測序質(zhì)量有關(guān)。

灰色標(biāo)記為WRKY保守結(jié)構(gòu)域Conservative WRKY domains were highlighted with gray color圖10 甘薯IbWRKY32與SPF1的氨基酸序列比對Fig.10 Alignment of amino acid sequences of I. batatas IbWRKY32 and SPF1

3 討 論

WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族作為重要的一類轉(zhuǎn)錄因子，參與植物生長發(fā)育過程并響應(yīng)生物脅迫以及非生物脅迫。甘薯是我國重要的糧食作物和淀粉加工來源，其基因組序列已測定但基因尚未注釋，因而無法直接研究甘薯WRKY轉(zhuǎn)錄因子。本研究使用隱馬爾可夫模型，在甘薯全基因組中預(yù)測和鑒定甘薯WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因并進(jìn)行一系列分析，包括染色體定位、基因潛在復(fù)制關(guān)系、保守結(jié)構(gòu)域、進(jìn)化樹構(gòu)建以及保守基序分析等，同時結(jié)合Lin等[16]和Ji等[32]的甘薯RNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，得到差異表達(dá)的WRKY基因，獲得可能參與抗蔓割病機(jī)制和抗低溫脅迫機(jī)制的WRKY基因。

本研究從甘薯全基因組篩選并鑒定到82個甘薯WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員，分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3個大類，其中Ⅱ類轉(zhuǎn)錄因子分為5個亞類。從蛋白數(shù)量上看，Ⅱ-c亞類的蛋白最多，占全部蛋白的24.4%；其次是Ⅰ類，占全部蛋白的22.0%。在其他植物的WRKY轉(zhuǎn)錄因子分類中，也是Ⅰ類和Ⅱ-c亞類的數(shù)量較多，例如草莓(Fragaria×ananassaDuch.)的WRKY蛋白數(shù)量為47[35]，其中Ⅰ類和Ⅱ-c亞類的數(shù)量均為10；擬南芥的WRKY蛋白數(shù)量為72[2]，其中Ⅰ類和Ⅱ-c亞類的數(shù)量分別為13和19。甘薯的WRKY轉(zhuǎn)錄因子中，發(fā)生WRKYGKK變異的8個蛋白都在Ⅱ-c亞類，與蘋果[36](MalusdomesticaBorkh.)的一致。從系統(tǒng)進(jìn)化樹的位置看(圖5)，這8個蛋白中除了IbWRKY46外，其余7個蛋白均為進(jìn)化樹的同一分支，其中IbWRKY78、IbWRKY77和IbWRKY79這3個基因在甘薯第14號染色體內(nèi)存在潛在復(fù)制基因?qū)?圖1)，基序的種類和排列順序也一致(圖7)；推測甘薯的部分WRKY基因在進(jìn)化過程中發(fā)生了變異和復(fù)制，造成WRKY結(jié)構(gòu)域七肽變異也高度相似。有研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子家族的進(jìn)化和擴(kuò)張得益于這樣的基因復(fù)制事件[37]。

甘薯蔓割病作為一種真菌病害，多在苗期發(fā)病，病株蒂部常發(fā)生腐爛，嚴(yán)重影響甘薯的生長和產(chǎn)量。JS57(金山57)是蔓割病高抗品種，在蔓割病菌株F04和F07的侵染下，JS57_F07的試驗結(jié)果顯示，甘薯JS57的WRKY基因發(fā)生差異表達(dá)的數(shù)量很少，相比之下JS57_F04受影響程度較大，大部分差異表達(dá)基因呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)。甘薯起源于熱帶地區(qū)[32]，適應(yīng)性廣，在我國種植面積大，在較冷的北方地區(qū)也有廣泛種植。因此，探索影響甘薯抗低溫機(jī)制相關(guān)的WRKY基因具有重要的實踐價值。在2個耐冷性不同的甘薯品種的低溫貯藏試驗中，甘薯WRKY基因在低溫貯藏2周和6周時的表達(dá)存在差異，表明甘薯塊根在低溫條件下貯藏前期與后期的抗低溫脅迫機(jī)制可能存在差異。

SPF1來自于甘薯品種高系14，是WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族報道的第一個基因[14]。在82個WRKY轉(zhuǎn)錄因子中進(jìn)行檢索后發(fā)現(xiàn)，IbWRKY32與SPF1的蛋白序列一致度達(dá)到85.4%，WRKY保守結(jié)構(gòu)域完全一致，定位于甘薯的第7條染色體上。根據(jù)進(jìn)化樹(圖4)發(fā)現(xiàn)，IbWRKY32與AtWRKY33的N端WRKY保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)化關(guān)系較近，AtWRKY33在過量表達(dá)的情況下可以增強(qiáng)擬南芥對NaCl脅迫的耐受性[38]。在甘薯塊根貯藏期的冷脅迫下，IbWRKY32在耐冷性不同的2個甘薯品種中均上調(diào)表達(dá)，以2為底差異表達(dá)倍數(shù)的對數(shù)值在Xushu 15-1_2w、Xushu 15-1_6w、Xushu 15-4_2w和Xushu 15-4_6w試驗組中分別為1.42，2.78，1.00和2.00，可看出基因在冷脅迫6周時上調(diào)表達(dá)的幅度增大，表明IbWRKY32可能參與增強(qiáng)甘薯塊根耐冷過程。

本研究應(yīng)用隱馬爾可夫方法從甘薯全基因組中鑒定得到82個WRKY基因，并分析其染色體定位、蛋白保守結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進(jìn)化以及蔓割病脅迫與低溫脅迫條件下的差異表達(dá)，為甘薯WRKY轉(zhuǎn)錄因子的機(jī)制研究及其實踐應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。