天麻素對單側前庭功能喪失大鼠前庭內側核中GLU-IR、GFAP、GABA B2 表達及療效的影響★

冷輝 張琦 馬賢德 姜宇晴 石磊 王愛平

前庭系統(tǒng)實現(xiàn)空間定位、情感調節(jié)、記憶等功能有賴于前庭系統(tǒng)的前庭外周感受器以及前庭中樞的功能整合。如果前庭功能存在異常，患者往往表現(xiàn)為眩暈，站立不穩(wěn)，走路向一側偏斜等癥狀，患者除了眩暈本身帶來的痛苦，因為眩暈而增高的跌倒風險無疑雪上加霜。流行病學調查顯示眩暈患病率為4.1%（10 歲以上人群）[1]。美國NIH 針對60 歲以上人群的調查顯示，患有前庭功能障礙比例則高達64.8%[2]。

前庭代償是指損傷前庭系統(tǒng)外周部后行為的恢復過程。一側迷路切除后促進代償藥物的研究是一個重要的問題。研究促進前庭代償藥物有助于明確行為恢復的機制和促進前庭失支配恢復藥物的研究。本研究觀察單側前庭功能喪失大鼠及經(jīng)不同劑量天麻素治療后前庭內側核中GLU-IR、GFAP、GABA B2 表達的變化，探討天麻素促進前庭功能恢復及中樞代償?shù)臋C制。

資料與方法

1 實驗動物

99只SPF 級SD 大鼠，雄鼠50 只，雌鼠49 只，體重（200±20）g，于實驗動物中心適應性常規(guī)喂養(yǎng)一周。

2 實驗方法

2.1實驗分組

將99 只成年健康SD 大鼠隨機分為KBDZ 組（n=9）、JSSDZ 組（n=18）、MXDZ 組（n=18）、MXZL 組（n=54），然后將MXDZ 組和MXZL 組大鼠進行單側迷路破壞，模型評價成功后，再次將MXZL 組大鼠隨機分為TMSGJL 組（n=18）、TMSZJL 組（n=18）、TMSDJL 組（n=18）。

2.2造模方法

JSSDZ 組（假手術對照組）：鼓室內注射生理鹽水（0.1～0.2ml/耳）。

MXDZ 組（模型對照組）：鼓室內注射50%氯仿（0.1～0.2ml/耳）[3]。

2.3模型評價

注射后1h 進行模型評價。

2.3.1行為學特征及失衡行為評分

參考Petrosini 報告的方法[4]對頭偏斜、軀干卷曲、肢體外展、強迫環(huán)形運動、頭震5 個失衡癥狀分別進行評分，單項指標最嚴重為2 分，無癥狀為0分，總分在0～10 分之間。

2.3.2頭偏斜的測量

測量由骶骨中央至第一胸椎中央處和由鼻尖至顱頂正中兩延長線間的夾角并計數(shù)[5]。

2.4干預方法

KBDZ 組（正常飼養(yǎng)組）：正常飼養(yǎng)，不作處理。

術后1h，進行如下處理，肌肉注射均每日1 次，連續(xù)3d。

JSSDZ 組（假手術對照組）、MXDZ 組肌肉注射生理鹽水（75mg·kg-1·d-1）。

TMSDJL 組（天麻素低組）：肌肉注射50mg·kg-1·d-1天麻素注射液。

TMSZJL 組（天麻素中組）：肌肉注射75mg·kg-1·d-1天麻素注射液。

TMSGJL 組（天麻素高組）：肌肉注射100mg·kg-1·d-1天麻素注射液。

2.5樣本采集

KBDZ 組（空白對照組）隨機抽取3 只，余各組隨機抽取6 只，采用過量麻醉法處死，迅速將置于冰面上斷頭完整取全腦浸泡于4%多聚甲醛中，室溫固定，用于免疫組織化學法檢測各項指標。

各組剩余大鼠經(jīng)過量麻醉法處死，置于冰面分離左側前庭內側核，用手術刀將其等分為2 份，一份置于凍存管中存于-80℃冰箱，用于western-blot法檢測；另一份加入Trizol 浸泡置于凍存管中存于-80℃冰箱，用于RT-PCR 法檢測。

2.6GLU-IR、GFAP、GABA B2 的表達水平檢測

2.6.1免疫組化法

實驗操作步驟參照本課題組文獻報道[6]，以生物信號采集系統(tǒng)測定平均光密度值，平均值作為目的蛋白相對表達水平。

2.6.2RT-PCR 法

取Trizol 液浸泡的組織于液氮中研磨成粉，滴加Trizol 液提取總RNA，測濃度、質量采用一步法RT-PCR 試劑盒檢測各mRNA 表達水平。引物序列見表1。經(jīng)ABI Prism 7500 HT 序列檢測系統(tǒng)檢測CT 值并計算相對表達量[7]。

表1 引物序列表

2.6.3western-blot 法

實驗操作步驟參照本課題組文獻報道[8]，測定目的蛋白條帶和內參條帶的灰度值，并以目的條帶灰度值/內參條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達水平，進行統(tǒng)計分析。

3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 軟件，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 模型評價

麻醉清醒后，MXDZ 組和MXZL 組大鼠均出現(xiàn)明確的前庭功能失衡癥狀。MXDZ 組、TMSGJL 組、TMSZJL 組、TMSDJL 組與KBDZ 組、JSSDZ 組比較失衡癥狀評分、頭偏角明顯升高（P<0.01），見圖1、表2。

圖1 大鼠前庭功能失衡狀態(tài)

表2 模型評價（）

表2 模型評價（）

注：*P＜0.05，**P＜0.01,與KBDZ 組比較；#P＜0.05，##P＜0.01，與JSSZ 組比較。

2 免疫組化法檢測GLU-IR、GFAP、GABA B2 的表達

JSSDZ 組與KBDZ 組比較，無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。MXDZ 組、MXZL 組與JSSDZ 組、KBDZ 組比較GLU-IR 表達下調（P<0.05），GFAP、GABA B2 的表達上調（P<0.05）。治療后，MXZL 組與MXDZ 組比較：GLU-IR、GABA B2 的表達明顯上調，GFAP 的表達明顯下調（P<0.05），TMSGJL 組下調明顯（P<0.05），見圖2、表3。

表3 免疫組化法檢測結果（）

表3 免疫組化法檢測結果（）

注：*P＜0.05，**P＜0.01,與KBDZ 組比較；#P＜0.05，##P＜0.01，與假手術組比較；△P＜0.05，△△P＜0.01，與MXDZ 組比較；○P＜0.05，○○P＜0.01，與TMSGJL 組比較；☆P＜0.05，☆☆P＜0.01，與TMSZJL 組比較。

圖2 免疫組化法檢測結果

3 采用PCR 法檢測GLU-IR、GFAP、GABA B2 mRNA表達水平

JSSDZ 組與KBDZ 組比較，無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。MXDZ 組、MXZL 組與JSSDZ 組、KBDZ 組比較GLU-IR 表達下調（P<0.05），GFAP、GABA B2 的表達上調（P<0.05）治療后，MXZL 組與MXDZ 組比較：GLU-IR、GABA B2 的表達明顯上調，GFAP 的表達明顯下調（P<0.05），TMSGJL 組最為明顯（P<0.05），見表4。

表4 PCR 法檢測結果（）

表4 PCR 法檢測結果（）

注：*P＜0.05，**P＜0.01,與KBDZ 組比較；#P＜0.05，##P＜0.01，與假手術組比較；△P＜0.05，△△P＜0.01，與MXDZ 組比較；○P＜0.05，○○P＜0.01，與TMSGJL 組比較；☆P＜0.05，☆☆P＜0.01，與TMSZJL 組比較。

4 采用western-blot 檢測GLU-IR、GFAP、GABA B2的表達水平

JSSDZ 組與KBDZ 組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），MXDZ 組、MXZL 組與JSSDZ 組、KBDZ 組比較明顯升高（P<0.05），經(jīng)天麻素治療后，上述指標MXZL 組與MXDZ 組比較明顯下降，且TMSGJL 組下降最為明顯（P<0.05），見圖3。

圖3 western-blot 法檢測結果

討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能恢復的過程是代償[9]，中樞功能狀況可能與前庭功能障礙恢復密切相關[10]。隨著技術的發(fā)展，學者對代償?shù)恼J識從假說已經(jīng)發(fā)展到細胞分子水平，目前多數(shù)學者認為中樞代償?shù)幕A是損傷后的神經(jīng)元結構的再恢復，是經(jīng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）重組了各種信息[11]。研究已證實代償?shù)倪^程主要由前庭核、前庭核間連合纖維、小腦、網(wǎng)狀結構、下橄欖核、舌下神經(jīng)前置核等部位參與，其中以前庭內側核最為重要，故將前庭內側核作為本實驗研究的部位。

天麻具有平抑肝陽、息風止痙、祛風通絡的功效。《本草綱目》載：“天麻，乃肝經(jīng)氣分之藥”，《素問》云：“諸風掉眩，皆屬于肝”，羅天益言：“眼黑頭旋，風虛內作，非天麻不能治。天麻乃定風草，故為治風之神藥”。可見，天麻用于治療眩暈，歷史悠久且療效顯著。現(xiàn)代藥理研究表明。天麻素是天麻的主要成分[12]，可透過血腦屏障[13]，到達其靶器官，即腦部。

谷氨酸免疫反應物（glutamate immunoreactive substance,GLU-IR）介導興奮性神經(jīng)傳導[14]。單側前庭損傷后兩側神經(jīng)傳導興奮性出現(xiàn)差異，因而出現(xiàn)眩暈癥狀，有研究表明損傷側GLU-IR 含量出現(xiàn)明顯下降[15]。星形膠質細胞（giial fibrillary acid protein,GFAP）與前庭神經(jīng)元執(zhí)行正常功能密切相關，前庭功能受損時GFAP 反應增強[16，17]。GABA B2 參與多種神經(jīng)活動，參與前庭功能急性損傷后的功能恢復[18]，其促前庭代償功能起到改善眩暈癥狀的作用[19]。

本實驗研究結果表明：①單側前庭功能喪失，可造成患側GLU-IR 表達下調，考慮原因為：GLUIR 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的興奮性神經(jīng)遞質，當術側前庭功能喪失后，術側前庭神經(jīng)失支配，因而興奮性遞質減少；GFAP 表達上調，考慮原因為：術側前庭功能喪失導致星形膠質細胞肥大改變；GABA B2 表達上調，考慮原因為：術側前庭功能喪失，大鼠自身的前庭及中樞代償機制使GABA B2 表達上調；②天麻素能夠起到促進前庭功能恢復及中樞代償?shù)淖饔?，且高劑量天麻素效果更好?/p>

本研究中大鼠應用天麻素的高、中、低劑量均為根據(jù)天麻素注射液的藥品說明書中600 mg 1 次/d靜點的劑量根據(jù)標準體重與大鼠的折算系數(shù)進行計算得出，經(jīng)研究結果發(fā)現(xiàn)，治療前庭性眩暈TMSGJL 組效果最好。因此或可提出假說，按照每公斤體重計算用藥劑量的方案療效或許較優(yōu)，今后課題組會深入研究，擬探討安全范圍內，根據(jù)體重計算用藥量，以增加臨床療效。