3種轉(zhuǎn)化人參皂苷CK菌群的結(jié)構(gòu)與多樣性

孫海明，王 晶，王金龍

(1.北華大學藥學院，吉林 吉林 132013；2.吉林省中藥生物技術(shù)科技創(chuàng)新中心，吉林 吉林 132013；3.北華大學理學院，吉林 吉林 132013)

人參素有“百草之王”之稱，由于其特有的生理學和藥理學特性而被廣泛利用[1].人參皂苷是人參質(zhì)量評價的重要指標，其分布及含量在不同品質(zhì)的人參中有明顯的差異.目前，從三七或人參等中草藥中已經(jīng)分離鑒定出100余種人參皂苷，其中，超過了90%的人參皂苷屬于Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf和Rg[2-3].以往的研究[4]表明：經(jīng)過不同方式轉(zhuǎn)化后的人參皂苷其次級代謝產(chǎn)物具有更強的藥用活性，我們將這些次級代謝產(chǎn)物稱為稀有人參皂苷，包括Rh1、Rh2、F1、F2、Rh3、Rg3、CM、CY和CK在內(nèi)的稀有人參皂苷在人參中的含量極少，人體胃腸道對常見主要人參皂苷的吸收率相對較低，而稀有人參皂苷則更容易被人體吸收并發(fā)揮作用[5].

天然的二醇型人參皂苷Rb1、Rb2、Rc可在人腸道內(nèi)轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷CompoundK(CK)[6-7]，作為一種潛在的天然藥物，稀有人參皂苷CK在體內(nèi)和體外都有良好的抑制腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用[8-9].另外，人參皂苷CK在延緩衰老[10]、調(diào)節(jié)神經(jīng)及抗感染等方面都有很好的效果.因此，如何實現(xiàn)人參皂苷CK的規(guī)模生產(chǎn)是人參皂苷相關研究的重點課題之一.目前，人參皂苷CK主要通過微生物轉(zhuǎn)化或糖苷酶水解制備，作為一個多靶點、高活性化合物，CK具有廣闊的應用前景和開發(fā)價值.

微生物轉(zhuǎn)化是目前能夠轉(zhuǎn)化人參皂苷CK的主要方法之一，它是利用微生物個體在生長發(fā)育過程中產(chǎn)生并釋放的生物酶定向水解主要人參皂苷而獲得稀有人參皂苷的代謝過程.微生物在轉(zhuǎn)化人參皂苷CK的過程中會產(chǎn)生多種生物酶，主要包括阿拉伯呋喃糖苷酶、半乳糖苷酶和葡萄糖苷酶，這3種酶可在第3個、第6個和第20個C處斷開糖基，從而實現(xiàn)對人參皂苷的轉(zhuǎn)化[11].與物理轉(zhuǎn)化和化學轉(zhuǎn)化方法比較，微生物轉(zhuǎn)化具有一定的優(yōu)勢，主要體現(xiàn)在微生物轉(zhuǎn)化安全性高、作用周期短、成本較低、副產(chǎn)物少等方面[5].近年來，國內(nèi)外在微生物轉(zhuǎn)化稀有人參皂苷的研究方面已有一定進展.目前，利用微生物轉(zhuǎn)化方法開展人參皂苷CK制備可為其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù).但目前的大部分研究仍處于起步階段，微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)CK仍然存在技術(shù)難題.關于微生物轉(zhuǎn)化人參皂苷的研究主要集中在單一菌株的轉(zhuǎn)化，而往往自然界中的微生物具有復雜而密切的協(xié)同關系.崔宗均等[12]首次提出了微生物菌群在纖維素降解方面的作用，通過構(gòu)建分解纖維素菌群，發(fā)現(xiàn)其比單一菌株更加高效，進而推動了纖維素資源的開發(fā)和利用.但是關于人參皂苷的微生物菌群轉(zhuǎn)化方面的研究很少.因此，研究對人參皂苷轉(zhuǎn)化能力強的高產(chǎn)復合菌群，尋找在人參皂苷轉(zhuǎn)化中具有密切合作關系的微生物群落，能夠為生產(chǎn)稀有人參皂苷CK提供一個新的思路，對微生物轉(zhuǎn)化人參皂苷CK大規(guī)模生產(chǎn)的實現(xiàn)提供可能.因此，本研究從3種來自長白山人參栽培基地的土壤中篩選出能夠高效轉(zhuǎn)化人參皂苷CK的復合菌群，比較不同群落中細菌的群落組成和多樣性，以探討微生物群落組成與人參皂苷CK轉(zhuǎn)化之間的關系，為CK的微生物轉(zhuǎn)化研究提供新的方向，也為稀有人參皂苷微生物轉(zhuǎn)化的大規(guī)模生產(chǎn)提供理論依據(jù).

1 研究方法

1.1 土壤樣品的采集

土壤樣品采自吉林省撫松縣人參栽培基地，分別采集15、20、25和30 a人參栽培地共計18個土壤樣品，裝入已經(jīng)滅菌的牛皮紙袋中，4 ℃冰箱保存.

1.2 富集培養(yǎng)

取1 g土樣溶于9 mL無菌蒸餾水中，稀釋100倍，取0.1 mL接種在人參總皂苷濃度為0.1%的R2A、MRS、PDA、LB 4種液體培養(yǎng)基中，30 ℃富集培養(yǎng)7 d.

1.3 發(fā)酵培養(yǎng)

取富集培養(yǎng)物0.5%接種量接種至底物濃度為0.1%的R2A、MRS、PDA、LB 4種液體培養(yǎng)基中，37 ℃、120 r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)15 d.

1.4 人參皂苷CK轉(zhuǎn)化量測定

在上述實驗條件下對人參皂苷進行轉(zhuǎn)化，應用HPLC法測定人參皂苷CK含量.

1.5 DNA抽提和PCR擴增

選擇上述實驗中轉(zhuǎn)化率最高的3個微生物群落，使用 E.Z.N.A.?土壤 DNA 試劑盒(Omega Bio- tek，Norcross，GA，U.S.)提取土壤樣品微生物 DNA.提取 DNA 濃度以及純化由 NanoDrop 2000紫外可見分光光度計檢驗，利用 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測微生物DNA 質(zhì)量.細菌16S rRNA 基因的 V3～V4 高變區(qū)通過熱循環(huán)儀 PCR 系統(tǒng)(GeneAmp 9700，ABI，美國)用引物 338F(5′-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3′)和 806R(5′-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′)進行擴增.PCR反應使用以下程序進行：95 ℃變性3 min，95 ℃ 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，27個循環(huán)，最后延伸在72 ℃下保持10 min.PCR 反應在 20 μL 混合物中進行3次，其中包含 4 μL 5 × FastPfu 緩沖液、2 μL 2.5 mmol dNTP、0.8 μL每種引物 (5 μmol/L)、0.4 μL FastPfu 聚合酶和10 ng模板 DNA.從 2% 瓊脂糖凝膠中提取得到的 PCR 產(chǎn)物，使用 AxyPrep DNA 凝膠提取試劑盒(Axygen Biosciences，Union City，CA，USA)進一步純化，并根據(jù)制試劑盒Quanti FluorTM-ST(Promega，USA)的使用說明進行質(zhì)量檢測.

1.6 Illumina MiSeq 測序

根據(jù)宏基因組測序的標準方案，利用純化后的擴增片段PE 2*300文庫構(gòu)建Illumina MiSeq 平臺(Illumina，San Diego，USA).構(gòu)建文庫步驟：首先，先進行“Y”字形接頭的連接；其次，利用磁珠篩選去除接頭自連片段；再次，利用PCR擴增進行文庫模板的富集；最后，利用氫氧化鈉變性，產(chǎn)生單鏈DNA片段.

1.7 測序數(shù)據(jù)的處理

質(zhì)控標準：原始fastq文件由Trimmomatic進行質(zhì)量控制，并由 FLASH 進行拼接，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，去除質(zhì)控后長度低于50 bp的序列；引物精確匹配，允許2個核苷酸錯配，并刪除不明確堿基；重疊超過10 bp的序列，然后根據(jù)它們的重疊序列進行合并.

使用UPARSE(版本 7.1，http：∥drive5.com/uparse/)對操作分類單元 (OTU)進行聚類(相似度97%)，并使用UCHIME識別和刪除嵌合序列.每個16S rRNA 基因序列的分類通過RDP分類器算法(http：∥rdp.cme.msu.edu/)針對Silva(SSU123)16S rRNA 數(shù)據(jù)庫使用70%的置信閾值進行分析.

2 結(jié) 果

2.1 高通量測序結(jié)果

采用Miseq測序技術(shù)對微生物16srDNA基因進行測序分析，3個微生物菌群共測得原始序列143 232條，質(zhì)量控制后剩余141 384條，長度分布為250～380 bp，平均序列長度為337.3 bp.樣品經(jīng)過濾、拆分、去冗余后按97%的相似度進行OTU分析和聚類，一共得到2 017個OTUs.所有優(yōu)質(zhì)序列經(jīng)比對鑒定得到3個門、15個綱、32個目、66個科、82個屬、95個種的微生物分類學信息.所有土樣的稀釋曲線隨有效序列數(shù)目增加而逐漸平緩(見圖1)，說明本次取樣基本能反映真實環(huán)境.由圖2可以看出，不同土壤微生物OTU 數(shù)目中，R48獲得的 OTU 數(shù)目最多(770)，其次是 R43(754)，R47 最低(644).3組土壤共有的OTU數(shù)目較少(31)，每個樣本中獨有的OTU數(shù)較多，在R48、R43和R47中分別為673、652和572.

圖1 Shannon指數(shù)稀疏曲線Fig.1Rarefaction curves of Shannon index

圖2 樣本間OTUs分布的韋恩圖Fig.2Venn diagram of OTUs among samples

2.2 不同轉(zhuǎn)化人參皂苷CK菌群的群落組成

在門分類水平上(見圖3)，3種能夠轉(zhuǎn)化人參皂苷CK的菌群中含有大量未分類的微生物，組成比例為47.5%～77.2%.而在有注釋的微生物中，有3 種菌群中以子囊菌門(Ascomycota)為主，其相對豐度分別為14.7%～38.1%，子囊菌門的組成比例在R47菌群中最高(38.1%)，但在R48菌群中比例最低(14.7%).同時在 3 種菌群中還含有少量的接合菌門(Zygomycota)、擔子菌門(Basidio-mycota).

在微生物的屬水平分析中，根據(jù)菌群相對豐度，選取前20的種屬，將未鑒定的種屬去除后制圖，觀察3種人參皂苷CK轉(zhuǎn)化菌群中的種屬分布情況(見圖4).結(jié)果表明：在3種菌群中，未知菌屬所占比例較大；已知菌屬中，占比達 2%以上的菌屬有Penidiella、纖孔菌屬(Inonotus)、赤霉菌屬(Gibberella)、馬拉色氏霉菌屬(Malassezia)、Ophi-osphaerella.其中Penidiella為核心菌屬，在R43土壤中最高(14.95%)，R48土壤中最低(4.37%).馬拉色氏霉菌屬在R47中含量最高(7.67%)，R43土壤中含量為3.54%，R48土壤中含量最低(1.07%).其他相對豐度大于 0.3%的菌屬有曲霉屬(Aspe-rgillus)、單孢釀酒酵母(Kazachstania)、線黑粉酵母屬(Filobasidium)、核腔菌屬(Pyrenophora)等屬.

圖3 3種土壤中門水平的微生物群落組成Fig.3Community composition of microorganisms in three kinds of soil at phylum level

圖4 3種土壤中屬水平的微生物群落組成 Fig.4Community composition of microorganisms in three kinds of soil at genus level

2.3 不同人參皂苷CK轉(zhuǎn)化微生物群落的多樣性分析

3種能夠高效轉(zhuǎn)化人參皂苷CK菌群中微生物α多樣性指數(shù)的統(tǒng)計結(jié)果見表1.結(jié)果表明：3種菌群中微生物的Shannon指數(shù)在R47樣本高于R43和R48.R48菌群中的ACE指數(shù)最高，R47中最低.Chao1指數(shù)在R48中最高，但是在R43中最低，Coverage指數(shù)在3個樣本中無變化，Simpson指數(shù)表現(xiàn)出與Shannon指數(shù)相反的變化趨勢，在R48中最高，而在R47中最低.

表1 3種土壤中微生物的α多樣性Tab.1 Alpha diversity of microorganisms in three kinds of soil

3 結(jié) 論

目前，進行人參皂苷CK轉(zhuǎn)化的微生物多采用單一菌株.但是，在自然界物質(zhì)轉(zhuǎn)化是多種微生物協(xié)同作用的結(jié)果，因此，利用多種微生物間的協(xié)同關系進行轉(zhuǎn)化非常重要.本研究從人參種植地土壤中篩選出能將人參總皂苷轉(zhuǎn)化成人參皂苷CK的復合菌群，獲得了具有較強轉(zhuǎn)化能力的菌群R43、R47和R48.3種能夠高效轉(zhuǎn)化人參皂苷CK的微生物群落主要包括子囊菌門(Ascomycota)、接合菌門(Zygomycota)和擔子菌門(Basidiomycota)，其中，子囊菌門在各樣本中的含量最高.在屬水平上，3個樣本中的微生物主要分布在Penidiella、纖孔菌屬(Inonotus)、赤霉菌屬(Gibberella)、馬拉色氏霉菌屬(Malassezia)和Ophiosphaerella等菌屬.多樣性指數(shù)中Shannon指數(shù)在R47中最高，而在R48樣本中含量最低.