飼料中β-受體激動劑檢測方法前處理方式改進(jìn)研究

王楠 安晨亮 安陽麗 常瑞雪

摘 要：現(xiàn)行農(nóng)業(yè)部1063號公告-6—2008，農(nóng)業(yè)部1629號公告-1—2011，NY/T 3145—2017等檢測標(biāo)準(zhǔn)都是使用外標(biāo)法對飼料中的β-受體激動劑進(jìn)行檢測，而外標(biāo)法在檢測飼料中β-受體激動劑時所測數(shù)值有一定的誤差?；诖耍n題組應(yīng)用內(nèi)標(biāo)法對β-受體激動劑進(jìn)行測試。內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)是結(jié)果更準(zhǔn)確，可以消除操作條件等變化引起的誤差。對飼料中的β-受體激動劑提取液進(jìn)行優(yōu)化，克服了原提取液中鹽酸易揮發(fā)且腐蝕性強(qiáng)的缺點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：飼料;β-受體激動劑;液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法;內(nèi)標(biāo)法;提取液優(yōu)化

近年來，隨著生活水平的提高，我國居民的飲食習(xí)慣轉(zhuǎn)向追求飲食的健康均衡，因此脂肪含量較低的瘦肉獲得更多青睞。但是國內(nèi)外頻發(fā)的食品污染和中毒事件，使食品安全問題成為消費(fèi)者、政府等關(guān)注的焦點(diǎn)問題。其中β-受體激動劑的殘留一直是肉制品安全的難題，它不僅影響我國的畜牧產(chǎn)品的出口貿(mào)易，還威脅著消費(fèi)者的健康，因此該類藥物逐漸被禁止用于畜禽生產(chǎn)[1]。

β-受體激動劑[2]是腎上腺素類、β激動劑、β興奮劑等一類藥物的統(tǒng)稱，當(dāng)以超過治療劑量5-10倍的用量用于家畜飼養(yǎng)時，會干擾胰島素的釋放，加快體內(nèi)糖原和脂肪的分解[3]，從而能顯著提高胴體的瘦肉率、增重和提高飼料轉(zhuǎn)化率，帶來更多經(jīng)濟(jì)價值。但它對人體有很危險的副作用，對于患有高血壓、心臟病、甲亢和前列腺肥大等疾病的人影響和危害更大，嚴(yán)重者可危及生命[4]。中國農(nóng)業(yè)部1997年發(fā)文禁止瘦肉精在飼料和畜牧生產(chǎn)中使用，2001年12月27日、2002年2月9日、4月9日，農(nóng)業(yè)部分別下發(fā)文件禁止使用β-受體激動劑類藥物作為飼料添加劑。盡管國家針對瘦肉精問題明令禁止，但是在利益的驅(qū)動下，β-受體激動劑仍被大量非法用于畜牧生產(chǎn)[5]，動物性食品中因而出現(xiàn)了不同程度的藥物殘留。β-受體激動劑殘留問題導(dǎo)致了許多食物中毒事件，所以需要從源頭抓起，做好飼料中“瘦肉精”

（β-受體激動劑）的檢測，杜絕瘦肉精在養(yǎng)殖過程中的使用，從根本上杜絕該類添加劑的有害殘留。

β-受體激動劑在食品中殘留會對人體產(chǎn)生危害，對其準(zhǔn)確、快速地檢測非常重要，從國家到地方政府都非常重視?，F(xiàn)行農(nóng)業(yè)部1063號公告-6—2008、農(nóng)業(yè)部1629號公告-1—2011、NY/T 3145—2017等檢測標(biāo)準(zhǔn)都是使用外標(biāo)法對飼料中的β-受體激動劑進(jìn)行檢測，由于在飼料中提取β-受體激動劑存在一定的缺陷，所以外標(biāo)法所測數(shù)值有一定的誤差。針對這個問題本課題組應(yīng)用內(nèi)標(biāo)法對β-受體激動劑進(jìn)行測試，內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn)是結(jié)果更準(zhǔn)確，可以消除操作條件等變化引起的誤差。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、甲酸均為色譜純;濃鹽酸、磷酸、醋酸、三氟乙酸、氨水和醋酸鉛均為分析純;MCX混合型陽離子交換柱（60 mg/3 mL）;標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)沙丁胺醇，購自中國食品藥品檢定研究院;萊克多巴胺、、鹽酸克倫特羅、同位素內(nèi)標(biāo)物萊克多巴胺-D9和沙丁胺醇-D3，均購自北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司，純度均≥98%;實(shí)驗(yàn)用水由純水儀制備，德國賽多利斯Sartorius公司。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀由1100液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）API 4000三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX公司）組成，其他儀器設(shè)備包括TD10002C電子天平、RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、QL-901旋渦混合器、水浴恒溫振蕩器、超低溫離心機(jī)、CM-12氮吹儀和SPE-24固相萃取裝置。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.3.1 外標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)選取了萊克多巴胺、克倫特羅、沙丁胺醇，用甲醇配制成1 μg·mL-1的混標(biāo)儲備液，避光冷藏保存。

1.3.2 內(nèi)標(biāo)法標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

內(nèi)標(biāo)物選取了萊克多巴胺-D9、沙丁胺醇-D3，用甲醇配制成100 μg/mL的混標(biāo)儲備液，避光冷藏保存。

1.4 方法

1.4.1 提取液

配制了4種不同提取液，分別為鹽酸-甲醇提取液、磷酸-甲醇提取液、醋酸-甲醇提取液和三氟乙酸-甲醇提取液，分別取0.1 mol/L鹽酸、磷酸、醋酸和三氟乙酸溶液80 mL，再分別加入甲醇20 mL混勻。

1.4.2 提取方法

分別稱取2 g左右粉碎過篩好的飼料樣品，于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入19 mL提取液和1 mL飽和醋酸鉛溶液，渦旋混合30 s，超聲提取10 min，再渦旋混合30 s，超聲提取10 min，然后于8 000 r/min離心10 min，取上清液備用。

1.4.3 凈化

先將MCX固相萃取小柱，依次用3 mL甲醇、3 mL水活化，取上清液5 mL過柱，用2 mL水和2 mL甲醇依次淋洗，空氣抽干2 min，用5%氨水甲醇溶液5 mL洗脫，收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（40 ℃）至干，用1.0 mL 0.2%甲酸水溶液溶解，過0.22 μm有機(jī)濾膜后，待上機(jī)測定。

1.4.4 色譜條件

色譜柱：C18柱，150 mm×2.1 mm，粒度3.5 μm（2020-SPZ-07-01），柱溫：40 ℃，進(jìn)樣體積：5 μL，流動相A：甲醇，流動相B：0.2%甲酸水溶液，流速：0.3 mL/min，梯度洗脫程序見表1。

1.4.5 質(zhì)譜條件

掃描方式：正離子掃描;監(jiān)測方式：MRM多反應(yīng)監(jiān)測，MRM參數(shù)見表2;噴霧電壓：5 500 V;氣體溫度：550 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)外標(biāo)法的優(yōu)化

稱取2 g左右空白飼料樣品，分為兩組，一組加入10 μg/kg萊克多巴胺、克倫特羅、沙丁胺醇的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合液，另一組加入等量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合液后，再加入等量的萊克多巴胺-D9、沙丁胺醇-D3混標(biāo)儲備液。加標(biāo)后采用鹽酸-甲醇提取液的方式進(jìn)行前處理，設(shè)置空白對照，測定3種β-受體激動劑的回收率和精密度。從表3中可以看出，外標(biāo)法測定的回收率為77.0%、77.2%、77.5%，內(nèi)標(biāo)法測定的回收率為102.5%、103.2%、100.2%。結(jié)果表明，內(nèi)標(biāo)法的回收率較外標(biāo)法有顯著提高，精密度良好，檢測結(jié)果更接近于真值。

2.2 提取方法的優(yōu)化

稱取2 g左右空白飼料樣品分為4組，均加入等量內(nèi)標(biāo)混標(biāo)儲備液和10 μg/kg外標(biāo)混標(biāo)儲備液，即采用內(nèi)標(biāo)法，加標(biāo)后分別加入4種不同的提取液，即鹽酸-甲醇提取液、磷酸-甲醇提取液、醋酸-甲醇提取液和三氟乙酸-甲醇提取液，按照上述的前處理方式進(jìn)行處理，同時設(shè)置空白對照，測定4種不同提取液處理后的β-受體激動劑的回收率和精密度。從表4中可以看出，鹽酸-甲醇提取液處理后的回收率為99.5%、99.4%、98.1%，磷酸-甲醇提取液回收率為82.8%、82.8%、96.2%，醋酸-甲醇提取液回收率為90.5%、87.0%、98.5%，三氟乙酸-甲醇提取液回收率為82.9%、81.0%、94.8%。濃鹽酸-甲醇提取液的回收率最好，但濃鹽酸易揮發(fā)，且腐蝕性強(qiáng);醋酸-甲醇提取液的回收率稍遜于鹽酸-甲醇提取液，但相對揮發(fā)性小，沒有腐蝕性，較安全;磷酸-甲醇提取液和三氟乙酸-甲醇提取液的回收率相對較低，因此最終選擇醋酸-甲醇作為提取飼料中β-受體激動劑的提取液。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，內(nèi)標(biāo)法的回收率較外標(biāo)法有顯著提高，精密度良好，檢測結(jié)果更接近于真值。設(shè)計不同的提取液對飼料中的β-受體激動劑進(jìn)行提取，結(jié)果表明，濃鹽酸-甲醇提取液的回收率最好，但濃鹽酸易揮發(fā)，且腐蝕性強(qiáng);醋酸-甲醇提取液的回收率稍遜于鹽酸-甲醇提取液，但相對揮發(fā)性小，沒有腐蝕性，較安全;磷酸-甲醇提取液和三氟乙酸-甲醇提取液的回收率相對較低，最終選擇醋酸-甲醇作為提取飼料中β-受體激動劑的提取液。雖然我國在食品安全領(lǐng)域逐漸加大了監(jiān)管力度，并建立了數(shù)量眾多的各級食品檢測中心，但β-受體激動劑作為廉價的促進(jìn)動物生長劑仍有不法分子會使用，所以有必要繼續(xù)開發(fā)靈敏度高、檢測速度快、準(zhǔn)確度高的檢測方法。

參考文獻(xiàn)

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