副溶血弧菌檢測方法的研究進展

賈晨 王丹 王琪 劉磊 曲連海 周琦

摘 要：本文介紹了副溶血弧菌的傳統(tǒng)檢測方法、免疫學(xué)檢測方法和分子生物學(xué)檢測方法等幾種快速的檢測方法，通過對多種檢測方法的優(yōu)缺點進行分析，為食品行業(yè)中副溶血弧菌的檢測方法選擇方面提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：副溶血弧菌;培養(yǎng)法;免疫學(xué)檢測;分子生物學(xué)檢測

副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是一種革蘭氏陰性嗜鹽性弧菌[1]，常在河口、海底沉積物等海洋環(huán)境中，以及魚貝類等海產(chǎn)品中檢出較多[2]。副溶血弧菌不僅嚴(yán)重危害海水養(yǎng)殖業(yè)，還能引發(fā)人類胃腸炎、食物中毒等，是一種條件致病菌[3]。近年來，由于誤食受副溶血弧菌污染或加工不當(dāng)?shù)暮．a(chǎn)品而導(dǎo)致的食物中毒事件層出不窮，在我國部分沿海地區(qū)，細(xì)菌性食物中毒位居首位[4-5]。通過對副溶血弧菌的快速檢測，可以有效防止相關(guān)疾病的傳播和發(fā)生。近年來，對副溶血弧菌檢測方法的研究取得了較大的進展，本文主要通過對多種檢測方法的優(yōu)缺點進行分析，為檢測方法的選擇提供理論基礎(chǔ)。

1 培養(yǎng)法

目前，傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法是國家標(biāo)準(zhǔn)對于副溶血弧菌的檢測[6]，根據(jù)檢測需求，分為定性檢測和定量檢測。取樣品25 g置于3%氯化鈉堿性蛋白胨水（APW）中，分別進行定性的增菌和定量的梯度稀釋后，接種到TCBS或弧菌顯色培養(yǎng)基中。挑取可疑菌落，進行生理生化鑒定，如氧化酶試驗、革蘭氏染色鏡檢、三糖鐵試驗、嗜鹽性試驗、生化鑒定、血清學(xué)試驗、神奈川試驗等，整體操作時間過長，涉及到的試驗方法以及試劑過多，易造成檢測結(jié)果出錯。

1.1 顯色培養(yǎng)基

顯色培養(yǎng)基是近些年逐步應(yīng)用在檢測行業(yè)的傳統(tǒng)培養(yǎng)基代替品，它是一類由目標(biāo)微生物的代謝產(chǎn)物中的酶，與特異性的酶顯色底物進行反應(yīng)，顯色酶底物與微生物代謝酶相結(jié)合，顯色基團游離進而顯色的原理，檢測目標(biāo)微生物的新型培養(yǎng)基。與傳統(tǒng)的培養(yǎng)基相比，顯色培養(yǎng)基具有較高的靈敏度和特異性。OLIVIA等[7]使用弧菌的顯色培養(yǎng)基和傳統(tǒng)培養(yǎng)基對于河口不同季節(jié)的水樣進行測定，通過對菌株的測序，驗證了傳統(tǒng)培養(yǎng)基對創(chuàng)傷弧菌的假陽性率有2%，霍亂弧菌的假陽性率為19%，而副溶血弧菌的假陽性率達到59%?；【娘@色可以顯著降低假陽性率2～5倍。EDDABRA等[8]對96個糞便和拭子樣本進行測試，通過顯色培養(yǎng)基和TCBS（硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基）對比發(fā)現(xiàn)，霍亂弧菌在顯色培養(yǎng)基的檢出率為34%，在TCBS中的檢出率為31%。對霍亂弧菌和副溶血弧菌的特異性進行檢測，顯色培養(yǎng)基的特異性達到100%，而TCBS的特異性只有93.33%。顯色培養(yǎng)基的特異性明顯高于TCBS。

1.2 微生物測試片

微生物測試片是預(yù)制型的培養(yǎng)基，采用快速擴散技術(shù)、新一代微生物顯色等創(chuàng)新技術(shù)，可實現(xiàn)菌落的快速增殖和判讀，提高實驗室的檢測效率。許如蘇等[9]以副溶血弧菌、霍亂弧菌、溶藻弧菌等49株標(biāo)準(zhǔn)菌對測試片的敏感性、特異性和可重復(fù)性進行檢測。結(jié)果表明，副溶血弧菌在測試片上表現(xiàn)為紫色菌落，其他非目標(biāo)微生物顯示藍(lán)色或者不生長;重復(fù)性試驗結(jié)果相對偏差偏低，檢測結(jié)果良好。但是由于需要考慮實際樣本中的副溶血弧菌的檢測以及樣品的適應(yīng)性等多種因素干擾，有較高的難度。

2 免疫學(xué)檢測方法

免疫學(xué)檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法吸附法、血清型法、免疫熒光技術(shù)、免疫擴散技術(shù)、免疫膠體金技術(shù)和免疫印跡技術(shù)等[10]。它們主要的原理是應(yīng)用抗原和抗體的特異性進行檢測。但是免疫學(xué)檢測方法對于抗體的特異性要求較高，同時最低檢出限偏高，導(dǎo)致漏檢的可能性。

2.1 免疫膠體金技術(shù)

免疫膠體金技術(shù)是采用抗原抗體相結(jié)合的原理，以膠體金作為標(biāo)志物的一種免疫標(biāo)記技術(shù)。朱慧等[11]制備了兔抗副溶血弧菌多克隆抗體，并對其效價進行測定，提取副溶血弧菌的外膜蛋白、鞭毛蛋白、胞外產(chǎn)物和全菌破碎蛋白，確定4種標(biāo)記蛋白的濃度，以及抗原蛋白的特異性檢測。檢測結(jié)果表明膠體金試紙條準(zhǔn)確鑒定出副溶血弧菌，排除其他非目標(biāo)菌的交叉反應(yīng)干擾，對人工感染的結(jié)果可以進行準(zhǔn)確判斷。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法簡稱ELISA，是酶聯(lián)免疫中應(yīng)用較廣的免疫測定技術(shù)。其原理是抗原或抗體固定在載體表面，在載體表面發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，酶與底物發(fā)生顯色反應(yīng)，洗滌后，可通過吸光值進行檢測。ELISA方法可以進行定性或者定量的分析。李國等[12]從瀕死的文蛤中分離鑒定出一株副溶血弧菌，并用該菌苗制備兔抗血清，以HRP-羊抗兔IgG為酶標(biāo)二抗，對人工感染副溶血弧菌的樣本進行ELISA檢測。結(jié)果顯示，采用間接ELISA技術(shù)檢測副溶血弧菌，人工污染的文蛤樣本副溶血弧菌的檢出率為80%，健康文蛤樣本的副溶血弧菌檢出率為15%。結(jié)果表明ELISA檢測法可以用于發(fā)病文蛤的檢測，但還是有假陰性存在。

3 分子生物學(xué)檢測方法

3.1 PCR方法

隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，PCR的方法已經(jīng)被逐漸的寫入標(biāo)準(zhǔn)中。PCR方法（Polymerase chain reaction，PCR），又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是一種通過溫度控制可實現(xiàn)體外擴增特異DNA片段的技術(shù)。PCR檢測具有靈敏度高、特異性強等優(yōu)勢。KIM等[13]基于toxR基因的PCR方法檢測副溶血弧菌，采用28個目標(biāo)和非目標(biāo)菌株建立了PCR檢測方法，通過494株菌株檢測目標(biāo)菌株的特異性。結(jié)果75.5%的副溶血弧菌較強的特異性，非目標(biāo)菌株沒有得到擴增。PCR檢測方法雖然靈敏度較高，但是過于依賴目標(biāo)基因的分離和富集，且易受到程序設(shè)置的干擾。

3.2 實時熒光定量PCR技術(shù)

實時熒光定量PCR技術(shù)具有靈敏度高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點。王建昌等[14]根據(jù)已知的副溶血弧菌基因組序列，篩選特異性靶基因，設(shè)計特異性引物探針，優(yōu)化反應(yīng)體系，并在體系內(nèi)加入內(nèi)參（IAC），通過標(biāo)記不同熒光基團的Taqman探針來監(jiān)測IAC，進而實時監(jiān)控整個PCR反應(yīng)。建立gyrB-IAC相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)曲線，Ct值與拷貝數(shù)有良好的線性關(guān)系;人工污染的初始菌量為7 cfu/25 g，樣品增菌6 h后，副溶血弧菌即可檢出。胡興娟等[15]針對副溶血性弧菌tlh基因，沙門菌Ompc基因和單增李斯特菌hly基因設(shè)計引物和TaqMan探針，建立3種致病菌的多重?zé)晒舛縋CR檢測體系，并對海產(chǎn)品中的副溶血性弧菌、沙門菌和單增李斯特菌的進行檢測。結(jié)果3種目標(biāo)致病菌均可得到特異性擴增，而其他非目標(biāo)細(xì)菌均未見特異性擴增曲線。該體系對副溶血性弧菌、沙門氏菌和單增李斯特菌的最低檢測限均小于

100 cfu/mL。并對150粉實際樣本進行檢測，與國家標(biāo)準(zhǔn)法檢出率一致。

3.3 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一種新型的核酸擴增方法，其特點是在鏈置換特異的DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）的作用下，設(shè)計4種特異引物，進行60～65 ℃恒溫擴增，15～60 min即可實現(xiàn)核酸擴增，具有操作簡單、特異性強等特點。反應(yīng)過程中加入染料等，在DNA合成時，從脫氧核糖核酸三磷酸底物（dNTPs）中析出產(chǎn)生大量焦磷酸鎂沉淀，呈現(xiàn)白色。因此，只需肉眼觀察產(chǎn)物中的濁度即可，操作過程簡單，結(jié)果易判讀。胡元慶等[16]用tlh基因作為副溶血弧菌的靶向基因，設(shè)計了4條引物，優(yōu)化LAMP檢測方法中的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。體系用Bst DNA聚合酶催化，恒溫反應(yīng)60 min，產(chǎn)物分別用2%瓊脂糖凝膠電泳和SYBR Green I染色鑒定，對各項反應(yīng)參數(shù)進行優(yōu)化;將菌液的10倍稀釋液進行LAMP和PCR反應(yīng)，并對32株食源性病原菌進行LAMP擴增，驗證其特異性;結(jié)果顯示，確定25 μL體系中Mg2+濃度為3.6 mmol/L，dNTPs濃度為0.96 mmol/L，聚合酶用量為4.8 U，內(nèi)外引物濃度比為8∶1，最佳反應(yīng)溫度為63 ℃，時間為60 min;LAMP的最低檢測限明顯低于PCR檢出限;對32個菌株進行特異性檢測，陽性率為100%，說明LAMP具有較高的特異性。

3.4 重組酶聚合酶等溫擴增技術(shù)

重組酶聚合酶等溫擴增技術(shù)（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），是可以替代傳統(tǒng)PCR的核酸檢測技術(shù)，是新一代的等溫擴增核酸檢測技術(shù)。RPA技術(shù)基于重組酶聚合酶，且最佳反應(yīng)溫度在20～37 ℃，20 min內(nèi)完成擴增反應(yīng)。劉小青等[17]采用RPA技術(shù)，建立了以irgB為靶基因的RPA-exo副溶血弧菌的引物探針，對引物探針進行組合篩選，建立RPA-exo熒光探針快速檢測方法，

15 min可完成檢測，具有高特異性，無交叉反應(yīng)，靈敏度較高;人工污染樣品加入終濃度為1.36×103 CFU/mL時，無需增菌即可被檢出;實際樣品檢測檢測結(jié)果與GB 4789.7—2013結(jié)果一致。

4 結(jié)語

副溶血弧菌的檢測方法各有優(yōu)缺點。傳統(tǒng)國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法要經(jīng)過培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)，挑取可疑菌落分離、增菌、鏡檢和生化鑒定等煩瑣步驟;顯色培養(yǎng)基和微生物測試片使用方便，但需要具有特異性較高的酶底物。免疫學(xué)檢測方法對于抗體的特異性要求較高，同時最低檢出限偏高，導(dǎo)致漏檢的可能性。分子生物學(xué)檢測方法具有靈敏度高、重復(fù)性好、反應(yīng)高效、準(zhǔn)確性高等優(yōu)勢，但是過于依賴目標(biāo)基因的分離和富集，且容易受到程序設(shè)置的干擾。

食品中副溶血弧菌檢測方法有傳統(tǒng)檢測方法、實時熒光定量PCR、LAMP、RPA 和MPCR-DHPLC法等，并可以多種結(jié)合進行目標(biāo)菌株鑒定。多種檢測方法相結(jié)合，融合多種優(yōu)勢，如LAMP技術(shù)與生物傳感器技術(shù)相結(jié)合，酶聯(lián)免疫磁珠技術(shù)與PCR技術(shù)相結(jié)合，MALDI-TOF MS與16S rRNA鑒定相結(jié)合?；蛐酒夹g(shù)融合了PCR、納米芯片和探針雜交。

上述針對副溶血弧菌的相關(guān)檢測方法，無論是從科學(xué)調(diào)查角度還是食品安全角度來說，對副溶血弧菌的有效檢測都存在著重要的研究意義。這些方法存在著一些不可忽視的問題，應(yīng)當(dāng)綜合考慮各檢測方法優(yōu)劣勢，在多項技術(shù)的基礎(chǔ)上建立可以滿足多方面需求的快速、高效、經(jīng)濟的檢測方法，才能實現(xiàn)副溶血弧菌的有效檢測，保障食品安全。

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