PCR檢測技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

洪亮

摘 要：PCR作為分子生物學(xué)的基礎(chǔ)技術(shù)，已經(jīng)在環(huán)境工程、食品工程、醫(yī)藥行業(yè)等眾多領(lǐng)域得到了較為廣泛的應(yīng)用。目前，多項(xiàng)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中在微生物鑒定環(huán)節(jié)也已引入PCR檢測方法。中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)等多項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)引用該方法。本文就傳統(tǒng)微生物檢測方法存在的問題引出對各項(xiàng)PCR檢測技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行列舉分析，提出各檢測方面的實(shí)際用途以及優(yōu)缺點(diǎn)，以期為未來的PCR檢測技術(shù)發(fā)展提供方向。

關(guān)鍵詞：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);食品;檢測

1 傳統(tǒng)微生物檢測方法存在的問題

每年夏季都是食源性疾病高發(fā)期，金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、大腸埃希氏菌和副溶血性弧菌等都是食品中較為常見的致病菌，易引發(fā)人畜疾病，應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)檢，確保食品安全。目前，食品微生物檢測的國家通用標(biāo)準(zhǔn)主要為GB 4789系列，共計40多個標(biāo)準(zhǔn)方法，大部分標(biāo)準(zhǔn)方法都是采用培養(yǎng)法進(jìn)行檢測分析。少數(shù)標(biāo)準(zhǔn)方法，例如GB 4789.6中致瀉大腸埃希氏菌檢驗(yàn)、GB 4789.42中諾如病毒檢驗(yàn)等采用了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法。傳統(tǒng)檢測方法（培養(yǎng)法）的一般流程為樣品稱量、增菌（預(yù)培養(yǎng)）、分離純化、生理生化鑒定、菌株血清分型等，菌落形態(tài)觀察、菌株生化鑒定及血清學(xué)分型等冗繁的操作歷時較長，對培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件要求也較嚴(yán)苛，易導(dǎo)致漏檢，且無法滿足部分廠商要求的快速檢測周期，不利于及時發(fā)現(xiàn)問題、解決問題。此外，部分檢測用試劑毒性較大，對檢測人員身體健康也容易造成威脅。同時，對于新冠病毒等不便于培養(yǎng)的微生物來說，傳統(tǒng)的檢測方法也無從解決檢測需求。

近年來，隨著分子生物學(xué)檢測技術(shù)的快速發(fā)展，微生物檢測的方法也日趨多元化、現(xiàn)代化。流式細(xì)胞儀、PCR儀（Real-time PCR、RT-PCR等）、酶聯(lián)免疫吸附法和免疫層析測定等多種較新的檢測方法或儀器的加入[1]，也使得食品微生物檢測的靈敏度、特異性和檢測速度得到了極大的提升，這些更為快捷、準(zhǔn)確的檢測技術(shù)也更能適應(yīng)人們對食品產(chǎn)品質(zhì)量的要求。

2 PCR檢測技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用現(xiàn)狀

PCR又稱聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是通過儀器和試劑在體外模擬天然DNA復(fù)制的過程，可在較短時間內(nèi)獲得大量目的基因片段，再通過瓊脂糖凝膠電泳和熒光檢測技術(shù)等對目的片段進(jìn)行分析確認(rèn)，最終可實(shí)現(xiàn)對食源性微生物進(jìn)行準(zhǔn)確的定性分析。目前PCR作為分子生物學(xué)基礎(chǔ)技術(shù)，目前已經(jīng)在環(huán)境工程、食品工程、醫(yī)藥行業(yè)等多領(lǐng)域得到了較為廣泛的應(yīng)用[2]，特別是新冠疫情爆發(fā)之后，基于PCR技術(shù)的分子生物學(xué)檢測技術(shù)得到了更為廣泛的應(yīng)用，尤其是在醫(yī)藥領(lǐng)域及鮮活農(nóng)產(chǎn)品及食品領(lǐng)域的應(yīng)用較之前更為頻繁。

PCR檢測技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用與其在其他領(lǐng)域的應(yīng)用類似，需要特異性的引物與靶序列進(jìn)行結(jié)合引導(dǎo)反應(yīng)的開始，整個反應(yīng)包括DNA模板的變性解鏈、復(fù)性（或稱退火）模板與引物結(jié)合、子鏈延伸等過程的不斷循環(huán)，實(shí)現(xiàn)DNA的指數(shù)級增長，最終在短時間內(nèi)獲得更多的目的DNA片段，用于后續(xù)的凝膠電泳和基因測序等分析，以確定擴(kuò)增DNA的具體序列信息。PCR檢測技術(shù)非常適用于對生長條件要求特殊，不容易實(shí)現(xiàn)常規(guī)增菌培養(yǎng)的微生物的檢測、鑒定和分型。較常采用的有常規(guī)PCR技術(shù)、實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)、RT-PCR檢測技術(shù)以及基于PCR的基因芯片檢測技術(shù)等4種[3]。

目前在食品領(lǐng)域這4種檢測技術(shù)不僅可用于微生物檢測，還能應(yīng)用在疫病檢測、食品種質(zhì)資源鑒定、食物中轉(zhuǎn)基因成分檢測、食物中過敏源成分檢測、藥食同源樣品基源鑒定和產(chǎn)品真?zhèn)舞b別等方面。

2.1 常規(guī)PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

常規(guī)PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用一般用于同時檢測多種食源性微生物以及對分離純化后的微生物進(jìn)行菌種鑒定等領(lǐng)域。前者主要通過在反應(yīng)體系中同時加入多種致病微生物的特異性引物以實(shí)現(xiàn)多個目的基因片段同時擴(kuò)增，共同分析，縮短檢測周期、縮減檢測費(fèi)用的目標(biāo)。后者主要用于提高傳統(tǒng)檢測方法的準(zhǔn)確率，防止漏檢、錯檢，也適用于對未知菌株進(jìn)行鑒定分型，為食品生產(chǎn)實(shí)踐過程中準(zhǔn)確分析污染源和制定針對性的除菌措施提供指導(dǎo)方向[4]。但是常規(guī)PCR技術(shù)雖然造價較便宜，應(yīng)用最為廣泛，但是也只能單純的用作基因擴(kuò)增，后續(xù)的基因分析還需要借助電泳技術(shù)、熒光檢測技術(shù)或測序技術(shù)才能達(dá)到最終的檢測目標(biāo)。而且在后續(xù)染色環(huán)節(jié)還會用到溴化乙錠，易對檢測人員的身體健康造成威脅。

2.2 實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，是在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上，在反應(yīng)體系中加入熒光信號再利用儀器對信號進(jìn)行監(jiān)測，從而實(shí)現(xiàn)對起始模板進(jìn)行定量和定性分析的方法。利用該技術(shù)對食品微生物進(jìn)行分析，可以避免在檢測過程中的交叉污染，也省去了后續(xù)溴化乙錠等有毒物質(zhì)染色及紫外熒光檢測等步驟，自動化程度更高，特異性更強(qiáng)。當(dāng)前，食品中多種致病菌檢測以及霉菌、酵母、乳酸菌等定性及定量檢測都可采用該方法[5]，雖然設(shè)備成本相對較高，但是節(jié)省人力，且更為精準(zhǔn)，目前應(yīng)用較為廣泛[6-8]。

2.3 基于PCR的基因芯片檢測技術(shù)

基因芯片是目前較先進(jìn)的一種高通量核酸分子雜交技術(shù)，它通過原位合成或顯微打印技術(shù)將核酸分子探針按照擬定的順序固定到固相介質(zhì)芯片的表面，在將樣品的核酸分子提取經(jīng)PCR擴(kuò)增后與該具有高密度的寡核苷酸陣列的芯片上的探針進(jìn)行雜交，最后再借助熒光掃描等技術(shù)對雜交信號進(jìn)行檢測，以確定樣品中特定微生物的存在情況[9]。

大部分食品營養(yǎng)較為豐富，同時具備碳源、氮源、生長因子等微生物生長需要的成分，適合多種微生物的生長繁殖，因此很多食品樣品中微生物的種類較為繁雜、品種分布隨機(jī)性強(qiáng)，而傳統(tǒng)的增菌、培養(yǎng)、純化鑒定等方法可能會導(dǎo)致部分低豐度以及不容易培養(yǎng)的微生物漏檢，常規(guī)PCR多限于檢測幾種微生物的基因，無法全面分析食品受污染的具體狀況，對于生產(chǎn)者改良工藝提升產(chǎn)品質(zhì)量指導(dǎo)意義不強(qiáng)。而基因芯片具備的高通量、高度自動化等優(yōu)點(diǎn)，可以為食品微生物種類研究、致病菌毒力研究、藥敏基因檢測等提供有力的數(shù)據(jù)支持[10-11]。此方法準(zhǔn)確度高、可操作性強(qiáng)，但是成本相對較高，目前在食品微生物檢測中應(yīng)用尚不廣泛[6]。但是隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，基因芯片的制作成本日益下降，相信在不久的將來，應(yīng)該也會得到大范圍的應(yīng)用。

2.4 RT-PCR檢測技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

RT-PCR即逆轉(zhuǎn)錄PCR，是通過將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再通過常規(guī)的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)（PCR）實(shí)現(xiàn)在體外快速擴(kuò)增cDNA的過程。該技術(shù)多用于檢測食品中RNA病毒污染，例如新冠病毒等檢測。疫情期間，三文魚、櫻桃等檢測出新冠病毒，多采用該法進(jìn)行。但是該法使用范圍較窄，一般僅用于以RNA為遺傳物質(zhì)的病毒的檢測中，其他微生物檢測不適用于該法。

3 結(jié)語

由微生物（致病細(xì)菌、生物毒素、病毒等）造成的食源性危害嚴(yán)重時可危及生命，檢測技術(shù)的進(jìn)步使得人們能夠及時發(fā)現(xiàn)，預(yù)防其對人類健康造成嚴(yán)重危害。目前基于PCR技術(shù)的食品微生物檢測應(yīng)用已經(jīng)非常廣泛，商業(yè)化程度較高，它一方面可以用于檢測食品中的致病菌存在情況，從而有效防止食源性風(fēng)險發(fā)生，另一方面也可以對食品中的菌相進(jìn)行分析，對于食品發(fā)酵和食品工藝改進(jìn)等方面也有重大意義。此外，在水生動物疫病檢測、畜禽疫病檢測、農(nóng)作物種質(zhì)資源鑒定、食品中轉(zhuǎn)基因成分檢測、食品中過敏源檢測、物種鑒定、中藥材及食品真?zhèn)舞b別等方面，PCR作為基礎(chǔ)技術(shù)也被廣泛應(yīng)用。總之，無論是植物源食品還是動物源食品，只要是涉及基因檢測，就一定會使用到PCR技術(shù)，PCR已經(jīng)成為檢測技術(shù)中最為常見的基礎(chǔ)技術(shù)手段[12]。

目前，雖然PCR技術(shù)應(yīng)用廣泛，但是基于PCR的食品微生物檢測技術(shù)對于復(fù)雜樣品仍然存在背景干擾和假陽性等諸多問題，為了更好地防范由有害微生物污染帶來的食品安全風(fēng)險，進(jìn)一步探索針對不同樣品合適的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，摸索開發(fā)出更靈敏、快捷、準(zhǔn)確、通用的檢測技術(shù)條件也迫在眉睫。此外，圍繞PCR進(jìn)行的很多化學(xué)試劑、酶、儀器等成本相對還是較高，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展和機(jī)械工業(yè)不斷發(fā)展，試劑耗材儀器成本的降低，相信PCR技術(shù)的使用前景將更為廣闊。

參考文獻(xiàn)

[1]代娟.快速檢測腸道致病菌的PCR技術(shù)的研究[D].成都：西華大學(xué)，2007.

[2]阮雁春.多重PCR檢測技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用價值分析[J].現(xiàn)代食品，2019（20）：127-128.

[3]楊平，楊迎伍，陳偉，等.食品中4種致病微生物的多重PCR快速檢測技術(shù)研究[J].西南大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2007（5）：90-94.

[4]馮可，胡文忠，姜愛麗，等.鮮切果蔬中4種病原微生物多重PCR檢測技術(shù)[J].食品科學(xué)，2018，39（6）：276-283.

[5]安利偉，陳蕊.多重PCR技術(shù)在檢測食源性病原微生物中的應(yīng)用[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2010，6（8）：172-173.

[6]孫吉浩.PCR技術(shù)在食源性微生物檢測中的應(yīng)用與發(fā)展研究[J].生物化工，2016，2（2）：56-58.

[7]蔡軍，李慧，歐競堃，等.針對食品中的三類致病菌的多重PCR檢測用引物組，試劑盒及檢測方法：105463063B[P].2019-08-09.

[8]吳科明.多重PCR技術(shù)在致病菌檢測中的應(yīng)用進(jìn)展[J].醫(yī)藥前沿，2018，8（11）：381-383.

[9]陳昱.基因芯片技術(shù)在食源性致病微生物檢測中的應(yīng)用研究[D].上海：上海海洋大學(xué)，2009.

[10]肖劍.分子生物學(xué)技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用[J].廣西輕工業(yè)，2011，27（3）：10-12.

[11]馬新秀，胡文忠，馮可，等.多重PCR技術(shù)在鮮活農(nóng)產(chǎn)品病原微生物檢測中的應(yīng)用[C]//2017中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會第十四屆年會暨第九屆中美食品業(yè)高層論壇論文摘要集.北京：中國食品科學(xué)技術(shù)學(xué)會，2017：1.

[12]張玉霞，黃鳴.食品檢驗(yàn)中多重PCR技術(shù)的應(yīng)用[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008（5）：958-960.