結(jié)核分枝桿菌DNA糖基化酶TagA的表達(dá)、純化及晶體學(xué)研究

劉作隆，祁 祺，戰(zhàn)博聞，耿 璐，李繼喜

（復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438）

結(jié)核病被認(rèn)定為全球十大主要死亡原因之一，其病原體結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）也是最致命的傳染病病原體之一。目前全世界大約四分之一的人口感染了結(jié)核分枝桿菌［1］。僅2019年，全球大約就有1 000萬(wàn)新增病例以及140萬(wàn)死亡病例。雖然近幾年結(jié)核病病例數(shù)量正在緩慢下降，但突如其來(lái)的一場(chǎng)新冠肺炎疫情很可能使各國(guó)政府和世界衛(wèi)生組織的努力付之一炬。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）模型估算的結(jié)果，新冠肺炎疫情對(duì)公共衛(wèi)生服務(wù)造成的干擾可使得發(fā)現(xiàn)和治療的結(jié)核病患者人數(shù)在3個(gè)月內(nèi)下降25%～50%，最終導(dǎo)致全球結(jié)核病死亡人數(shù)可能增加約20萬(wàn)～40萬(wàn)［2］。因此，結(jié)核病仍然是對(duì)世界公共衛(wèi)生安全的一項(xiàng)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

結(jié)核分枝桿菌寄生在宿主巨噬細(xì)胞中，經(jīng)常受到各種內(nèi)源性和外源性因素的DNA損傷攻擊，且基因組完整性對(duì)其生存和增殖至關(guān)重要［3］。結(jié)核分枝桿菌中存在強(qiáng)大的DNA修復(fù)系統(tǒng)，不僅確保其遺傳物質(zhì)的復(fù)制準(zhǔn)確無(wú)誤，而且在結(jié)核分枝桿菌的基因組多樣化以及耐藥性的發(fā)展中也發(fā)揮著重要作用［4］。DNA修復(fù)系統(tǒng)中的堿基切除修復(fù)（base repair excision，BER）主要用于修復(fù)單核苷酸損傷［5-6］，結(jié)核分枝桿菌在這一途徑中進(jìn)化出了顯著的功能冗余。它表達(dá)大量的DNA糖基化酶，識(shí)別和切除各種受損的堿基和DNA骨架之間的N-糖苷鍵，產(chǎn)生脫嘌呤嘧啶（apurinic or apyrimidinic，AP）位點(diǎn)［7］。糖基化酶可分為單功能酶和雙功能酶，單功能酶僅具有糖基化酶活性，而雙功能酶還具有裂解酶活性，能裂解AP位點(diǎn)的DNA骨架［8-9］。

作為一種單功能3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶，TagA目前僅在原核生物及擬南芥中發(fā)現(xiàn)同源序列，在結(jié)構(gòu)上屬于烷基化DNA糖基化酶中的螺旋-發(fā)夾-螺旋（helix-hairpin-helix，HHH）蛋白超家族。其中結(jié)核分枝桿菌來(lái)源Ⅰ型3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶TagA（MtbTagA）共包含204個(gè)氨基酸，理論相對(duì)分子質(zhì)量（molecular weight，Mw）為21 005.10 Da，理論等電點(diǎn)（theoreticalpI）為7.72，最早于1998年通過(guò)基因組學(xué)鑒定出來(lái)。一直到2019年，MtbTagA的研究仍然止步于基因?qū)用?，幾乎沒(méi)有生理功能以及結(jié)構(gòu)性質(zhì)的相關(guān)報(bào)道［10］。HHH超家族糖基化酶都有一個(gè)保守的天冬氨酸殘基，用于去質(zhì)子化或穩(wěn)定糖苷鍵斷裂時(shí)在糖上形成的正電荷［11-12］。然而其同源蛋白大腸桿菌來(lái)源的TagA（EcTagA）卻不存在這一保守殘基。因此，EcTagA使用Glu38、Tyr16以及Leu44，通過(guò)氫鍵連接到6-氨基和N7位［13］，通過(guò)與3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3MA）的范德華力相互作用以及與保守的Trp側(cè)鏈的傳統(tǒng)π-π堆積來(lái)選擇性地將中性的3MA結(jié)合在帶正電的堿基上，以此促進(jìn)受損堿基的識(shí)別和去除，維持基因組的正常復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯［14-15］。結(jié)核分枝桿菌的BER過(guò)程在宿主巨噬細(xì)胞維持正常生理過(guò)程中起著重要作用［16］。因此，針對(duì)BER，尤其是關(guān)鍵蛋白MtbTagA的研究可為發(fā)掘新型抗結(jié)核感染藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

表達(dá)載體pSMT3質(zhì)粒［通過(guò)在pET28b（+）質(zhì)粒的T7啟動(dòng)子后添加6×組氨酸（histidine，His）-類(lèi)泛素蛋白修飾分子（small ubiquitin-like modifier，SUMO）標(biāo)簽改造獲得］為本實(shí)驗(yàn)室保存；Ulp1酶購(gòu)于BioVision公司；E. coliDH5α以及E. coliBL21（DE3）感受態(tài)菌株均購(gòu)于上海諾唯贊生物技術(shù)有限公司；BamHⅠ和XhoⅠ限制性?xún)?nèi)切酶均購(gòu)于New England Biolabs公司；卡那霉素、二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）、異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl β -D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）等試劑均購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司；Anti-6×His tag一抗以及Goat-Anti-Mouse二抗均購(gòu)于A(yíng)bcam公司；3MA和次黃嘌呤（hypoxanthine，Hx）購(gòu)于MedChemExpress公司；鎳-氮三乙酸（nickel-nitrilotriacetic acid，Ni-NTA）介質(zhì)、Superdex 200 16/600凝膠過(guò)濾層析柱、Superdex 75 10/300 GL凝膠過(guò)濾層析柱以及Q Sepharose Fast flow陰離子交換柱均購(gòu)于GE healthcare公司；蛋白結(jié)晶試劑盒JCSG2 Suite、JCSG+Suite、Crystal Screen（HR2-110）、Crystal Screen 2（HR2-112）、PEG/Ion Screen（HR2-126）以及Index（HR2-144）均購(gòu)于Hampton公司；Wizard I～Ⅳ購(gòu)于Rigaku公司；蛋白質(zhì)結(jié)晶優(yōu)化試劑購(gòu)于Hampton公司和Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1MtbTagA的克隆、蛋白表達(dá)及純化

以結(jié)核分枝桿菌Mycobacterium tuberculosisH37Ra（無(wú)毒株）基因組DNA片段作為模板擴(kuò)增獲得MtbTagA的基因（NP_215726.1）；使用雙酶切（酶切位點(diǎn)為BamHⅠ和XhoⅠ）以及同源重組的方法構(gòu)建表達(dá)帶有6×His-SUMO標(biāo)簽MtbTagA重組蛋白的MtbTagA-pSMT3質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序鑒定正確后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E. coliBL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中用于蛋白表達(dá)。當(dāng)OD600nm達(dá)到0.8時(shí)，加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG，在18℃條件下誘導(dǎo)蛋白表達(dá)20 h后，于4℃以5 000 r/min離心15 min，收集表達(dá)菌株；將菌體沉淀重懸于裂解緩沖液［50 mmol/L Tris-HCl（pH 9.0）、500 mmol/L NaCl、10 mmol/L咪唑、體積分?jǐn)?shù)為5%的甘油、2 mmol/L β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol，β-ME）、體積分?jǐn)?shù)為1‰的聚乙二醇單辛基苯基醚（nonidet p40，NP40）］中，經(jīng)高壓破菌儀破碎，然后在4℃下以18 000 r/min離心60 min，去除細(xì)胞碎片。將收集到的上清溶液通過(guò)Ni-NTA層析柱純化，并在含有30～250 mmol/L咪唑的緩沖液［50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、500 mmol/L NaCl、體積分?jǐn)?shù)為5%的甘油、2 mmol/L β-ME］中梯度洗脫。使用Ulpl酶切除His-SUMO標(biāo)簽，同時(shí)透析降低咪唑濃度。酶切時(shí)，MtbTagA的質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL，Ulp1酶的質(zhì)量濃度為1 mg/mL，透析緩沖液為50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、500 mmol/L NaCl、體積分?jǐn)?shù)為5%的甘油，透析和酶切在4℃下過(guò)夜。通過(guò)二次Ni-NTA層析柱純化，收集流穿樣品，以去除His-SUMO標(biāo)簽。再用Superdex 200 16/600、Superdex 75 10/300 GL凝膠過(guò)濾層析柱以及陰離子交換柱，通過(guò)蛋白質(zhì)層析純化系統(tǒng)AKTA Purifier（GE）進(jìn)一步純化MtbTagA蛋白。其中凝膠過(guò)濾層析洗脫緩沖液為20 mmol/L Tris-HCl（pH 9.0）、300 mmol/L NaCl、2 mmol/L DTT；陰離子交換柱洗脫緩沖液為A液［20 mmol/L Tris-HCl（pH 9.0）、2 mmol/L DTT］和B液［1 mol/L NaCl、20 mmol/L Tris-HCl（pH 9.0）、2 mmol/L DTT］各500 mL。陰離子交換柱層析的具體方法如下：將蛋白樣品通過(guò)AKTA Purifier系統(tǒng)上樣至陰離子交換柱中，并設(shè)定梯度洗脫程序?yàn)?0 min內(nèi)B液所占洗脫液比例從0%勻速提高至100%，隨后打開(kāi)UV280、UV260以及電導(dǎo)率的監(jiān)控設(shè)備，用于實(shí)時(shí)觀(guān)測(cè)蛋白質(zhì)、核酸以及鹽離子濃度；將對(duì)應(yīng)的上樣管放入A液和B液中，點(diǎn)擊執(zhí)行，并對(duì)出峰位置處樣品進(jìn)行收集。使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、考馬氏亮藍(lán)染色以及免疫印跡試驗(yàn)（Western blot，WB）等方法鑒定蛋白性質(zhì)［17］。

1.2.2 動(dòng)態(tài)光散射分析

在DynaProNanoStar?（Wyatt Technology，USA）的DYNAMICS軟件上完成動(dòng)態(tài)光散射（dynamic light scattering，DLS）。設(shè)置溫度為25℃，光源波長(zhǎng)為658 nm，固定散射角為90°，待指示燈變綠即可上樣。將MtbTagA蛋白稀釋至1 mg/mL，稀釋緩沖液成分為20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、300 mmol/L NaCl、2 mmol/L DTT。然后將其分為3組：第一組作為對(duì)照組添加相同體積的緩沖液；第二組添加終濃度為50 nmol/L的Hx；第三組添加終濃度為50 nmol/L的3MA。室溫孵育30 min后，每組取3個(gè)樣品，每個(gè)樣品測(cè)量10次。統(tǒng)計(jì)并分析所采集參數(shù)，包括分子半徑（radium，R）、粒度分布（ploydispersity，PD）和不同半徑分子所占質(zhì)量分?jǐn)?shù)（mass fraction，MF）等。

1.2.3 結(jié)晶和數(shù)據(jù)收集

將MtbTagA蛋白樣品分裝并分別濃縮至1.6、2.3、3.4 mg/mL，采用氣相坐滴擴(kuò)散法，通過(guò)96孔結(jié)晶板以及7種結(jié)晶試劑盒，使用Gryphon LCP蛋白自動(dòng)結(jié)晶工作站（Art Robbins Instruments）進(jìn)行晶體初篩，并置于18℃結(jié)晶房中。3 d后，發(fā)現(xiàn)2.3 mg/mLMtbTagA蛋白在體積分?jǐn)?shù)為22.5%的PEG 4000、100.0 mmol/L Bis-Tris（pH 4.5）、0.2 mol/L Li2SO4條件下出現(xiàn)針狀晶體。驗(yàn)證其可重復(fù)后，將MtbTagA蛋白與初始結(jié)晶條件中不同濃度的沉淀劑和不同pH組成的池液以1∶1的體積比混合，并在18℃結(jié)晶房通過(guò)懸滴擴(kuò)散法進(jìn)行MtbTagA蛋白晶體的優(yōu)化。經(jīng)過(guò)幾輪優(yōu)化后，篩選出生長(zhǎng)狀態(tài)較好的晶體。將晶體挑入含有體積分?jǐn)?shù)為25%的甘油做防凍劑的結(jié)晶緩沖液中，并在液氮中快速冷凍后保存，X射線(xiàn)衍射數(shù)據(jù)在BL17U1線(xiàn)站（SSRF，中國(guó)）收集。其衍射波長(zhǎng)為0.979 3 ?，與探測(cè)器間的距離為250 mm。最后通過(guò)HKL2000軟件將收集的數(shù)據(jù)進(jìn)行整合［18］。

2 結(jié)果與分析

2.1 MtbTagA與同源家族DNA糖基化酶蛋白的生物信息學(xué)分析

通過(guò)MtbTagA的基因序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，TagA蛋白家族除了在真細(xì)菌中普遍存在以外，在擬南芥中同樣發(fā)現(xiàn)存在8個(gè)MtbTagA同源蛋白（37%～40%的同源性）。然而，在古生菌、酵母或其他低等真核生物以及哺乳動(dòng)物中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)同源編碼序列。為了揭示DNA糖基化酶MtbTagA的潛在催化活性位點(diǎn)，本文將其和HHH蛋白超家族的其他同源酶類(lèi)（包括大腸桿菌來(lái)源的EcTagA以及傷寒沙門(mén)氏菌來(lái)源的StTagA）通過(guò)氨基酸多序列同源比對(duì)以及云深智藥蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)比對(duì)（https://drug.ai.tencent.com/）進(jìn)行分析（圖1）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MtbTagA在二級(jí)結(jié)構(gòu)上展現(xiàn)出經(jīng)典的HHH蛋白超家族的特點(diǎn)，由兩段螺旋結(jié)構(gòu)以及中間的短鏈組成；與大腸桿菌來(lái)源的EcTagA以及傷寒沙門(mén)氏菌來(lái)源的StTagA同源性為35%～45%，與其他4種已有結(jié)構(gòu)的同源蛋白同源性為7%～20%（未展示）；它們?cè)贛tbTagA的α2、α3、α4、α7、α8、α9、α10這7個(gè)α螺旋上存在保守序列，其中亮氨酸、苯丙氨酸占比最高，兩者相同特點(diǎn)為均具有疏水基團(tuán)的側(cè)鏈；在EcTagA的酶活位點(diǎn)（Glu38、Tyr16、Leu44）為高度保守序列。這表明MtbTagA屬于HHH蛋白超家族，這3個(gè)氨基酸殘基可能是其催化活性位點(diǎn)和輔助催化的氨基酸殘基。

圖1 Tag家族的氨基酸序列多重對(duì)比和同源建模Fig. 1 Multiple comparison of amino acid sequences of Tag family and homology modeling（a）氨基酸序列同源性比對(duì)。結(jié)核分枝桿菌來(lái)源（MtbTagA，結(jié)構(gòu)來(lái)源云深智藥預(yù)測(cè)）；大腸桿菌來(lái)源（EcTagA，PDB ID: 1P7M；傷寒沙門(mén)桿菌來(lái)源（StTagA，PDB ID: 2OFK）；（b）同源建模。紅色代表MtbTagA，青色代表EcTagA，紫色代表鋅原子。(a) Amino acid sequence homology comparison. Mycobacterium tuberculosis (MtbTagA, iDrug Protein Structure Prediction); Escherichia coli (EcTagA, PDB ID:1LMZ); Salmonella typhimurium (StTagA, PDB ID:2OFK); (b) Homology modeling: red represents MtbTagA, cyan represents EcTagA, purple represents zinc atom.

2.2 MtbTagA蛋白的表達(dá)與純化

對(duì)MtbTagA的基因（NCBI ID: NP_215726.1）進(jìn)行分析，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室改造的pSMT3質(zhì)粒，設(shè)計(jì)MtbTagA-pSMT3質(zhì)粒，如圖2所示。該質(zhì)粒所表達(dá)的重組蛋白6×His-SUMO-MtbTagA一共有322個(gè)氨基酸，分子量為36 394.06 Da，等電點(diǎn)為6.30。

圖2 MtbTagA全長(zhǎng)重組蛋白的質(zhì)粒構(gòu)建框架圖Fig. 2 Plasmid diagram of MtbTagA full-length fusion protein

從圖3a可以看出，雖然重組MtbTagA質(zhì)粒所表達(dá)的重組蛋白6×His-SUMO-MtbTagA在大腸桿菌（泳道1）中表達(dá)量較高，但是大部分在沉淀（泳道3）中，并且在二次Ni-NTA梯度洗脫雜蛋白的過(guò)程中出現(xiàn)大量灰色絮狀沉淀。因此酶切后二次Ni-NTA的流穿樣品（紅框部分）中蛋白含量較低。如圖3b所示，表達(dá)蛋白（泳道1～3）的確含有帶有6×His-SUMO標(biāo)簽的重組蛋白，并且在Ulp1酶切（可特異性識(shí)別SUMO的三級(jí)結(jié)構(gòu)）及二次Ni-NTA親和層析后，所得的蛋白樣品（紅框部分）已去除6×His-SUMO標(biāo)簽。通過(guò)多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在1.2.1的裂解緩沖液條件下MtbTagA蛋白溶解度最高。使用Superdex200 16/600凝膠過(guò)濾層析柱對(duì)去除6×His-SUMO標(biāo)簽后的MtbTagA全長(zhǎng)蛋白進(jìn)行純化后發(fā)現(xiàn)，目的蛋白在91.6 mL洗脫液處出峰，但是存在大小接近的雜蛋白（未展示），因此，利用蛋白在不同鹽離子濃度下對(duì)填料的結(jié)合能力不同，使用陰離子交換柱對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步純化。最后在Superdex75 10/300 GL凝膠過(guò)濾層析柱上驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)蛋白在13.8 mL的峰上被洗脫出來(lái)，其對(duì)應(yīng)分子量約為25 kD，與理論分子量21 kD基本相符合，表明MtbTagA在溶液中以單體形式存在。其洗脫樣品的SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色分析結(jié)果如圖3e～3f所示。

圖3 MtbTagA蛋白表達(dá)與純化結(jié)果Fig. 3 Expression and purification of MtbTagA protein（a）大腸桿菌表達(dá)與Ni-NTA純化MtbTagA蛋白樣品的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果。1：全菌樣品；2：上清樣品；3：沉淀樣品；4：流穿樣品；5：咪唑濃度為10 mmol/L的洗脫樣品；6：咪唑濃度為50 mmol/L的洗脫樣品；7：咪唑濃度為250 mmol/L的洗脫樣品；8：Ulp1酶切后過(guò)二次Ni-NTA的流穿樣品；9：酶切后二次Ni-NTA中咪唑濃度為250 mmol/L的洗脫樣品；M: 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；（b）大腸桿菌表達(dá)與Ni-NTA純化MtbTagA蛋白樣品的WB檢測(cè)結(jié)果。一抗為6×His標(biāo)簽；1～9以及M所代表樣品與圖a一致；（c）MtbTagA蛋白陰離子交換柱純化結(jié)果。MtbTagA（Mw:21 kD）在陰離子交換柱上從32.6 mL的峰上洗脫出來(lái)，其對(duì)應(yīng)分子量約為25 kD；（d）MtbTagA蛋白凝膠過(guò)濾層析柱純化結(jié)果。MtbTagA（Mw:21 kD）在陰離子交換柱上從13.8 mL的峰上洗脫出來(lái)，其對(duì)應(yīng)分子量約為25 kD；（e）MtbTagA蛋白陰離子交換柱樣品的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果。M：蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；FT：流穿樣品；30～38以及70～72：圖c中相應(yīng)體積（30～38 mL以及70～72 mL）洗脫樣品；（f）MtbTagA蛋白凝膠過(guò)濾層析柱樣品的SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果。M：蛋白標(biāo)準(zhǔn)品； 13～16：圖d中相應(yīng)體積（13～16 mL）洗脫樣品。(a) The SDS-PAGE analysis of MtbTagA protein samples expressed by E. coli and purified by use of Ni-NTA purification; 1: Whole cell sample; 2: Supernatant sample; 3: Precipitation sample; 4: Flow through sample; 5: Elution sample with imidazole concentration of 10 mmol/L; 6: Elution sample with imidazole concentration of 50 mmol/L; 7: Elution sample with imidazole concentration of 250 mmol/L; 8: Flow through sample of secondary Ni-NTA after Ulp1 digestion; 9: Elution sample with 250 mmol/L concentration in secondary Ni-NTA after restriction enzyme digestion; M: Protein marker; (b) The WB analysis of MtbTagA protein samples expressed by E. coli and purified by use of Ni-NTA purification; primary antibody was anti-6×His tag; the samples of 1～9 and M were consistent with (a); (c) The purification of MtbTagA protein by anion-exchange chromatography. MtbTagA (Mw: 21 kD) was eluted from the peak of 32.6 mL on an anion exchange column with Mw of about 25 kD; (d) The purification of MtbTagA protein by gel filtration chromatography. MtbTagA (Mw: 21 kD.) was eluted at a peak of 13.8 mL, the corresponding Mw was about 25 kD; (e) The SDS-PAGE analysis of MtbTagA protein samples purified by anion-exchange chromatography. M: Protein marker; FT: Flow through sample; 30～38 and 70～72: Elution sample of corresponding volume (30～38 mL and 70～72 mL) in (c) ; (f) The SDS-PAGE analysis of MtbTagA protein samples purified by gel filtration chromatography. M: Protein marker; 13～16: Elution sample of corresponding volume (13～16 mL) in (d).

2.3 底物對(duì)MtbTagA蛋白聚集狀態(tài)的影響分析

為了探究MtbTagA蛋白的底物對(duì)其聚合狀態(tài)的影響，我們根據(jù)已報(bào)道的同源家族蛋白EcTagA（PDB ID: 1P7M）選擇Hx和3MA這兩種底物，分別與MtbTagA蛋白共孵育作為試驗(yàn)組，通過(guò)DLS檢測(cè)溶液中粒子的平均半徑（RAVG/nm）以及各組分所占質(zhì)量百分?jǐn)?shù)（Mass%）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組MtbTagA的RAVG為（7.54±0.275）nm，粒子半徑為3.1 nm的峰1的Mass%為99.5%，說(shuō)明在溶液中多為單體存在；而添加Hx與3MA后的RAVG分別為（12.99±2.260）nm和（145.66±30.670）nm；通過(guò)One-Way ANOVA檢驗(yàn)顯著性發(fā)現(xiàn)，添加Hx后RAVG無(wú)顯著性差異，而添加3MA后RAVG存在極顯著提高，并且溶液中半徑更大的粒子所占的Mass%也更高（圖4）。這說(shuō)明預(yù)測(cè)底物3MA與MtbTagA存在相互作用，并能使其蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，從而促進(jìn)MtbTagA蛋白發(fā)生聚集沉淀。

圖4 MtbTagA蛋白與底物共孵育DLS分析Fig. 4 DLS analysis of co-incubation of MtbTagA protein with substrate（a）不同條件蛋白溶液平均粒子半徑的比較。白色代表2 mg/mL MtbTagA蛋白，藍(lán)色代表2 mg/mL MtbTagA蛋白與50 nmol/L Hx共孵育，紅色代表2 mg/mL MtbTagA蛋白與50 nmol/L 3MA共孵育。數(shù)據(jù)用三組平行試驗(yàn)的均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示（n=30），通過(guò)One-Way ANOVA計(jì)算顯著性；（b）MtbTagA蛋白溶液中粒子分布狀況的單次檢測(cè)；（c）添加Hx的MtbTagA蛋白溶液中粒子分布狀況的單次檢測(cè)；（d）添加3MA的MtbTagA蛋白溶液中粒子分布狀況的單次檢測(cè)。(a) Comparison of the average particle radius of protein solution under different conditions. White represents 2 mg/mL MtbTagA protein, blue represents 2 mg/mL MtbTagA protein co-incubated with 50 nmol/L Hx, and red represents 2 mg/mL MtbTagA protein co-incubated with 50 nmol/L 3MA; the data were expressed by the ± s of three groups of parallel experiments (n=30), and the significance was calculated by Student’s t test; (b) Single detection of particle distribution in MtbTagA protein solution; (c) Single detection of particle distribution in MtbTagA protein solution with Hx; (d) Single detection of particle distribution in MtbTagA protein solution with 3MA.

2.4 MtbTagA蛋白結(jié)晶與數(shù)據(jù)收集

將新鮮純化的MtbTagA蛋白濃縮至2.3 mg/mL，并用于7×96個(gè)條件下的初始晶體篩選。在體積分?jǐn)?shù)為22.5%的PEG 4000、100 mmol/L Bis-Tris（pH 4.5）、0.2 mol/L Li2SO4條件下，針狀和片狀晶體在第3天長(zhǎng)出。經(jīng)過(guò)幾輪優(yōu)化后，于第3天在體積分?jǐn)?shù)為18%的PEG 4000、100 mmol/L Na Acetate（pH 5.2）、0.2 mol/L Li2SO4的條件下（條件一）篩選品質(zhì)較高的晶體（圖5a）。晶體保存于含體積分?jǐn)?shù)為25%的甘油防凍劑的結(jié)晶緩沖液中并迅速在液氮中冷凍保存。隨后在上海同步輻射裝置（中國(guó)上海）的BL17U1線(xiàn)站上收集X射線(xiàn)衍射數(shù)據(jù)，最終得到約7 ?分辨率的衍射數(shù)據(jù)（圖5b）。在2個(gè)月后，在體積分?jǐn)?shù)為20%的PEG 4000、100 mmol/L Na Acetate（pH 5.6）、0.2 mol/L Li2SO4的條件（條件二）下發(fā)現(xiàn)有質(zhì)量更高的晶體生長(zhǎng)，有望獲得分辨率更高的衍射數(shù)據(jù)（圖5c）。

圖5 MtbTagA的晶體圖和X射線(xiàn)衍射圖Fig. 5 The crystals and X-ray diffraction image of MtbTagA （a）條件一中MtbTagA蛋白晶體圖。上方兩塊長(zhǎng)方體晶體；（b）條件一中MtbTagA蛋白晶體的X射線(xiàn)衍射圖。分辨率約為7 ?；（c）條件二中MtbTagA蛋白晶體圖。中間三塊片狀晶體。(a) The crystal image of MtbTagA on the first condition. Two rectangular crystals are on the top; (b) The X-ray diffraction image of MtbTagA crystal in the first condition. The resolution is about 7 ?; (c) The crystal image of MtbTagA on the second condition. Three pieces of lamellar crystals are in the middle.

3 討論

結(jié)核病是目前世界上最致命的傳染病，中國(guó)也是受結(jié)核病影響最深的國(guó)家之一［19］。結(jié)核病的致病菌結(jié)核分枝桿菌是專(zhuān)性需氧菌，可以侵染全身的組織和器官，并且擁有高度冗余的DNA損傷修復(fù)機(jī)制。已有研究表明，3-甲基腺嘌呤DNA糖基化酶能夠識(shí)別并切除受損堿基，在BER通路中發(fā)揮重要作用，從而對(duì)抗人體中的活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）引發(fā)的基因損傷，因此對(duì)結(jié)核分枝桿菌的生存繁殖和耐藥性都有重要意義［20-21］。另外，被用于多藥耐藥結(jié)核病治療的一種新藥griselimycins能通過(guò)抑制DNA聚合酶滑動(dòng)鉗蛋白DnaN的酶活性發(fā)揮作用［22］。因此，MtbTagA能作為結(jié)核分枝桿菌來(lái)源的3MA DNA糖基化酶在DNA修復(fù)途徑發(fā)揮功能，也有望作為結(jié)核藥物開(kāi)發(fā)新靶點(diǎn)的潛在來(lái)源。

本研究通過(guò)氨基酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，MtbTagA與EcTagA的同源度在35%左右，但在二級(jí)結(jié)構(gòu)上呈現(xiàn)出相似的HHH蛋白超家族特點(diǎn)，并且酶活位點(diǎn)高度保守，且首次在大腸桿菌中成功異源表達(dá)并純化了MtbTagA全長(zhǎng)蛋白，這對(duì)后續(xù)的功能研究具有重要意義。通過(guò)DLS發(fā)現(xiàn)，異源表達(dá)的MtbTagA蛋白在溶液中多為單體存在，并且在預(yù)測(cè)的2種底物3MA和Hx中，只有3MA能夠使其發(fā)生極顯著高聚。雖然Hx也能提高RAVG值，但是并不存在顯著性。這暗示我們MtbTagA蛋白可能在底物選擇性上更傾向于偏中性的3MA，這也與Cao等［23］對(duì)EcTagA的研究結(jié)果一致。同時(shí)，晶體生長(zhǎng)的條件中存在的鋰離子與EcTagA（PDB ID: 1P7M）結(jié)構(gòu)中存在的鋅離子均為金屬離子，說(shuō)明金屬離子可能對(duì)穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)、輔助其行使生理功能具有一定意義。對(duì)MtbTagA蛋白進(jìn)行的晶體篩選和X射線(xiàn)衍射分析有助于其結(jié)構(gòu)的解析，以便于闡明其催化機(jī)制以及與底物結(jié)合的特點(diǎn)，為進(jìn)一步探究DNA糖基化酶蛋白的生化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)性質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。