SARS-CoV-2 NP和NP-FlaB融合蛋白的 免疫原性研究

劉 杭，葉生寶，俞 杰，譚文芝，葛行義

（醫(yī)學(xué)病毒學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南大學(xué)生物學(xué)院，長沙 410082）

2019年12 月，嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）在中國武漢最先被發(fā)現(xiàn)鑒定。其導(dǎo)致的疾病被命名為新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19），癥狀包括發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難、肌痛和疲勞等。COVID-19在全球持續(xù)流行超過一年，對衛(wèi)生和經(jīng)濟(jì)造成了巨大影響［1］。截至2021年7月12日，我國累計(jì)確診病例共119 321例，累計(jì)死亡共5 588例，國外累計(jì)確診病例共186 291 690例，日增長18萬余例確診病例，累計(jì)死亡病例達(dá)4 031 725例之多，對世界的經(jīng)濟(jì)、人類生活等造成了巨大的危害（WHO，https://covid19.who.int/）。新型冠狀病毒主要通過唾液、飛沫、接觸等傳播，目前主要通過控制傳染源、切斷傳播途徑來進(jìn)行有效防控。而長遠(yuǎn)來看，SARSCoV-2疫苗的普及使用是COVID-19防控的關(guān)鍵一環(huán)。但是由于新型冠狀病毒的變異，某些突變株型能逃逸現(xiàn)有疫苗，因此需要設(shè)計(jì)研發(fā)更廣譜且高效的SARS-CoV-2疫苗，而亞單位疫苗是其中一個重要候選［2］。

SARS-CoV-2屬于冠狀病毒科β-冠狀病毒屬，是一種有囊膜的單股正鏈RNA病毒，其基因組大約為30 kb，編碼4種主要的結(jié)構(gòu)蛋白，即刺突（spike，S）蛋白、包膜（envelope，E）蛋白、膜（membrane，M）蛋白和核衣殼（nucleocapsid，N）蛋白［3］。核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，NP）在病毒感染過程中高表達(dá)，且在成熟病毒粒子中含量高，同時具有很好的免疫原性［4］。病毒感染時，NP蛋白與病毒RNA一起進(jìn)入宿主細(xì)胞，促進(jìn)其復(fù)制，參與病毒粒子的組裝和釋放［5］。血清學(xué)診斷發(fā)現(xiàn)，嚴(yán)重急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）患者血清中針對NP蛋白的特異性抗體比嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）的其他結(jié)構(gòu)蛋白具有更高的敏感性和更長的持久性［6-7］。冠狀病毒的S蛋白負(fù)責(zé)病毒受體的識別與結(jié)合，協(xié)調(diào)病毒入侵，是重要的疫苗設(shè)計(jì)靶點(diǎn)，但是S基因變異高，如SARSCoV-2與SARS-CoV的S蛋白有76%的氨基酸相似性［8］。相比之下，N基因更保守穩(wěn)定，且在長期流行過程中突變較少，如SARS-CoV-2與SARS-CoV的NP蛋白氨基酸同源性為90%［9］。因此，NP蛋白常用于血清學(xué)檢驗(yàn)，也是疫苗設(shè)計(jì)的重要靶點(diǎn)。如Kumar等［10］對NP蛋白的平均抗原傾向進(jìn)行分析，選擇了SARS-CoV-2 NP蛋白設(shè)計(jì)多表位疫苗；Iwarson等［11］使用NP蛋白來防治感染，證明了乙型肝炎NP抗原免疫能保護(hù)黑猩猩免受乙型肝炎病毒的感染；黃亞渝等［12］證明了以胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸的寡脫氧核苷酸（cytosine-phosphate-guanine oligonucleotide，CpG-ODN）為佐劑的人黑色素瘤NP蛋白疫苗能誘發(fā)較強(qiáng)的特異性的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，可以減緩腫瘤的生長速度，延長荷瘤鼠的生存期，對荷瘤鼠有較好的抗腫瘤效果。因此，NP蛋白可以作為SARS-CoV-2的優(yōu)質(zhì)候選疫苗，其優(yōu)勢有序列保守、穩(wěn)定、具有強(qiáng)大的免疫原性、在感染過程中不易發(fā)生突變等［13-14］。目前，關(guān)于SARS-CoV-2 NP蛋白的研究報(bào)道不多，對SARS-CoV-2 NP持續(xù)進(jìn)行研究是有必要的。

FlaB（Flagellin B）是幽門螺旋桿菌鞭毛素基因編碼的蛋白，可作為免疫佐劑增強(qiáng)抗原的免疫原性，也可作為基因工程疫苗的候選抗原［15］。此外，F(xiàn)laB還可以增強(qiáng)腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)，抑制過敏反應(yīng)，殺死腫瘤細(xì)胞［16-17］，具有很強(qiáng)的黏膜免疫佐劑活性，經(jīng)鼻內(nèi)給藥后，可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生保護(hù)性免疫［18］。有文獻(xiàn)報(bào)道，用FlaB蛋白口服免疫劑可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，產(chǎn)生高水平免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM），促進(jìn)白細(xì)胞分化，加強(qiáng)其吞噬活性，提高機(jī)體的體液免疫應(yīng)答［19］。目前其已應(yīng)用到多種疫苗研究中。本研究對FlaB是否能增強(qiáng)SARS-CoV-2 NP蛋白的免疫原性，以及NP-FlaB融合蛋白是否能作為黏膜免疫亞單位疫苗誘導(dǎo)有效的黏膜免疫應(yīng)答進(jìn)行了研究，通過原核表達(dá)純化NP、NP-FlaB融合蛋白，并將兩組蛋白分別通過皮下注射和滴鼻免疫兩種不同的免疫方式免疫BALB/c小鼠，對比兩組蛋白免疫誘導(dǎo)的NP特異性血清抗體和黏膜抗體效價(jià)及特異性效應(yīng)T細(xì)胞的應(yīng)答水平，來分析FlaB對SARS-CoV-2 NP免疫原性的影響，并評估NP、NP-FlaB融合蛋白成為新型冠狀病毒亞單位疫苗的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

SARS-CoV-2的N基因由生工生物工程公司合成，通過限制性內(nèi)切酶EcoR I和XhoI雙酶切將SARS-CoV-2（NCBI序列號：NC_045512.2）NP構(gòu)建到pET28a（+）表達(dá)載體上。SARS-CoV-2的N基因經(jīng)過原核密碼子優(yōu)化后，由生工生物工程公司合成，通過限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI雙酶切將NP構(gòu)建到pET32a（+）表達(dá)載體上。利用編碼FlaB的質(zhì)粒，通過限制性內(nèi)切酶EcoR I和PstI雙酶切將FlaB構(gòu)建到pTYB12表達(dá)載體上。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建

以材料中提到的NP- pET32a（+）質(zhì)粒為模板擴(kuò)增同源重組NP片段，通過限制性內(nèi)切酶SalI和EcoR I雙酶切含F(xiàn)laB序列的pTYB12質(zhì)粒，并以同源重組法將片段重組至pTYB12質(zhì)粒中，構(gòu)建NPFlaB-pTYB12重組表達(dá)質(zhì)粒，隨后轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株BL21（DE3）中，測序成功后待用。

1.2.2 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

誘導(dǎo)表達(dá)NP蛋白。將過夜活化的表達(dá)菌株菌液以體積比1∶100的比例接種到液體溶菌肉湯（luria-bertani，LB）培養(yǎng)基中。當(dāng)OD600nm值為0.8時，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylbeta-D-thiogalactopyranoside，IPTG），使得終濃度為1.00 mmoI/L；37℃下200 r/min誘導(dǎo)12 h進(jìn)行可溶性表達(dá)；10 000 r/min離心10 min后收集菌體，稱重，按照每克菌體加4 mL非變性裂解液混合液（往4 mL非變性裂解液中加入40 μL溶菌酶和40 μL蛋白酶抑制劑），漩渦震蕩混勻后在冰上放置30 min。設(shè)置超聲破碎儀破碎功率為120 W，破碎2 s，暫停3 s，總破碎時長為45 min，對樣品進(jìn)行超聲破碎。4℃下10 000 r/min離心30 min，收集上清，用碧云天Ni親和層析柱純化目的蛋白。磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）過夜透析后，用超濾管進(jìn)行濃縮，聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）法測蛋白濃度。蛋白可直接用于皮下免疫，分裝后置于-80℃保存。

誘導(dǎo)表達(dá)NP-FlaB融合蛋白。當(dāng)OD600nm值為0.8時，加入IPTG，使得終濃度為0.06 mmol/L；16℃下110 r/min誘導(dǎo)21 h進(jìn)行可溶性表達(dá)；10 000 r/min離心5 min，收集菌體，后續(xù)同上。最后取上清過幾丁質(zhì)柱純化NP-FlaB融合蛋白。

1.2.3 目的蛋白內(nèi)毒素的去除和檢測

用1%的聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）這種表面活性劑處理NP和NP-FlaB融合蛋白，在4℃冰箱中翻轉(zhuǎn)30 min，隨后置于37℃水浴鍋中靜置10 min，使之成為均相溶液；37℃下12 000 r/min離心10 min，取上層液體，重復(fù)3次，即可得到無內(nèi)毒素的目的蛋白。用內(nèi)毒素檢測鱟試劑盒檢測，檢測合格后的蛋白用于滴鼻免疫試驗(yàn)。

1.2.4 疫苗的免疫

分別用NP、NP-FlaB融合蛋白對6～8周的BALB/c小鼠進(jìn)行免疫，并分別使用皮下注射和滴鼻免疫兩種方式進(jìn)行免疫，每組6只，等摩爾質(zhì)量給藥。每次免疫前進(jìn)行臉頰采血5～10滴，4℃下3 000 r/min 離心10 min后取上清，分裝放置于-80℃保存待測。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和酶免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（ELISPOT）

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）：用包被液（coating buffer，CB）稀釋NP蛋白至2 μg/mL，以每孔100 μL加入到酶標(biāo)板孔中，4℃過夜包被；拍干，每孔加入200 μL含1% 牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）的PBS封閉液，于37℃封閉2 h后拍干；將收集的血清和黏膜樣品分別用磷酸鹽吐溫緩沖液（phosphate tween bufferedsaline ，PBST）按梯度稀釋（血清樣品的稀釋梯度為1∶300、1∶900、1∶2 700、1∶8 100、1∶24 300、1∶72 900、1∶218 700、1∶656 100，黏膜樣品稀釋梯度為1∶10、1∶30、1∶90、1∶270、1∶810、1∶2 430、1∶7 290、1∶21 870）后加入100 μL至酶標(biāo)板孔中，作為試驗(yàn)組，并設(shè)置僅加入等體積PBST的孔作為陰性對照；常溫孵育1 h后洗板3次［洗液為PBST（含0.05% 吐溫20的PBS）］，拍干；用含1% BSA的PBST將辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗鼠二抗稀釋5 000倍，每孔加入100 μL，常溫孵育1 h，洗板4次并拍干；每孔加入100 μL 四甲基聯(lián)苯胺（tetramethyl benzidin，TMB）顯色液反應(yīng)10 min；每孔加入50 μL的終止液，在酶標(biāo)儀上測OD450nm，并記錄數(shù)據(jù)，從中得到血清和黏膜樣品中抗體滴度和抗體產(chǎn)生的趨勢。

酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）：取小鼠脾臟分離T淋巴細(xì)胞，細(xì)胞密度統(tǒng)一稀釋至2.5×106個/mL；活化白細(xì)胞介素4（interleukin 4，IL-4）和伽馬干擾素（interferon-gamma，IFN-γ）ELISPOT板之后，設(shè)置加入100 μL1640培養(yǎng)基稀釋的刺激物（5 μg/mL NP蛋白）作為試驗(yàn)組，設(shè)置僅加入1640培養(yǎng)基的孔作為陰性對照，并設(shè)置加入佛波酯（phorbol-12-myristate-13-acetate+inomycin，PMA + Iono）的孔作為陽性對照；每孔加入100 μL稀釋的各組細(xì)胞，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)40～48 h；傾倒孔內(nèi)細(xì)胞及培養(yǎng)基，每孔加入200 μL冰冷的滅菌超純水，4℃冰箱放置10 min低滲裂解細(xì)胞［20］；洗板6次，扣干，將稀釋好的生物素標(biāo)記的抗體工作液加入各孔，每孔100 μL，37℃ 孵育1 h；洗板6次，將稀釋好的酶標(biāo)親和素工作液加入各孔，每孔100 μL，37℃孵育1 h；洗板5次，扣干，揭開板底座，用滅菌水洗滌膜底面及底座，吸干底座及膜底殘留的水跡，合上底座，洗板1次，徹底扣干孔內(nèi)液體；將現(xiàn)配的3-氨基-9-乙基咔唑（3-amino-9-eyhylcarbazole，AEC）顯色液加入各試驗(yàn)孔中，每孔100 μL，室溫避光靜置10 min；傾倒孔內(nèi)液體，揭開板底座，用滅菌水洗滌正反面及底座3～5遍，終止顯色；自然晾干后拍照計(jì)數(shù)，記錄斑點(diǎn)的各種參數(shù)做統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

免疫血清和黏膜樣品的抗體效價(jià)是由試驗(yàn)組測得的吸光度值（用P表示）與陰性對照組的吸光度值（用N表示）的比值計(jì)算得到的數(shù)值，P＞2.1N時的稀釋倍數(shù)計(jì)為樣品的抗體效價(jià)。對照組和試驗(yàn)組同一批次進(jìn)行試驗(yàn)，避免批次間的誤差，且應(yīng)至少重復(fù)2次，以保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)2次以上，取平均值。不同組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異以t-test進(jìn)行檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 NP蛋白在感染康復(fù)患者中的分布

本試驗(yàn)用ELISA檢測法對感染康復(fù)患者血清混合樣本進(jìn)行了針對NP蛋白的特異性抗體檢測，在混合血清中檢測到了針對NP蛋白的免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）抗體（圖1），證明了NP蛋白在人體感染SARS-CoV-2時引起的免疫反應(yīng)中扮演著重要的角色。這一結(jié)果與Zeng等［14］、Guo等［21］在確診的COVID-19患者不同稀釋倍數(shù)的血清中檢測到針對NP蛋白的IgG、免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）和IgM抗體的結(jié)果一致，且這一現(xiàn)象在康復(fù)期患者的血清中也被證實(shí)存在。Tan等［6］、Shi等［7］在血清學(xué)診斷中發(fā)現(xiàn)，SARS患者血清中針對NP蛋白的特異性抗體比SARS-CoV的其他結(jié)構(gòu)蛋白具有更高的敏感性和更長的持久性。這一結(jié)果證實(shí)了NP蛋白抗體在機(jī)體對抗SARS-CoV-2感染的免疫應(yīng)答，以及其在新冠滅活疫苗的免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。因此，開發(fā)NP作為SARSCoV-2亞單位疫苗具有重要的意義。

圖1 采用ELISA法檢測不同稀釋度感染康復(fù)患者血清和正常人血清中SARS-CoV-2 NP的特異性IgGFig. 1 Using ELISA assay to detect the SARS-CoV-2 NP-specific IgG in different dilutions of infected convalescent patient serum and normal human serum

2.2 NP、NP-FlaB蛋白的純度分析

NP、NP-FlaB蛋白分別以Ni親和層析柱和幾丁質(zhì)親和層析柱純化，得到純度較高的目的蛋白。SDS-PAGE分析和Western blot分析結(jié)果顯示，NP、NP-FlaB的分子量大小分別為48 kD和92 kD。SDSPAGE圖像的灰度分析結(jié)果顯示，NP、NP-FlaB蛋白的純度分別為83.9%、81.5%（圖2）。

圖2 NP、NP-FlaB蛋白的純化及灰度分析Fig. 2 Purification and gray scale analysis of NP and NP-FlaB proteins （a）SDS-PAGE檢測純化的NP蛋白；（b）灰度分析純化的NP蛋白（1為NP蛋白峰；2～5為雜蛋白峰）；（c）Western blot檢測純化的NP蛋白；（d）SDS-PAGE檢測純化的NP-FlaB蛋白；（e）灰度分析純化的NP-FlaB蛋白（1為NP-FlaB蛋白峰；2～4為雜蛋白峰）；（f）Western blot檢測純化的NP蛋白。(a) The purified NP protein was detected by SDS-PAGE; (b) The NP protein was purified by gray scale analysis (peak 1 is NP protein peak；2～5 for miscellaneous protein peak); (c) The purified NP protein was detected by Western blot; (d) The purified NP-FlaB protein was detected by SDS-PAGE; (e) The NP-FlaB protein was purified by gray scale analysis (peak 1 is NP-FlaB protein peak；2～4 for miscellaneous protein peak); (f) The purified NP protein was detected by Western blot.

2.3 NP疫苗滴鼻免疫的免疫效果分析

如圖3所示，滴鼻免疫NP-FlaB疫苗的小鼠獲得了較高滴度的特異性IgG抗體，且抗體滴度顯著高于NP組。NP組第二、三次免疫后血清稀釋倍數(shù)分別為50、600時，其與對照組OD450nm比值仍然大于2∶1；NP-FlaB組第二、三、四次免疫后血清稀釋倍數(shù)平均值分別為1 050、2 900、17 100時，其與對照組OD450nm比值仍然大于2∶1。滴鼻免疫組小鼠的黏膜樣品中，除了NP-FlaB組肺灌洗液（lung washing fluid，LW）IgA抗體滴度明顯高于NP組外（圖4c），唾液、鼻腔灌洗液（nasal washing fluid，NW）、陰道灌洗液（vaginal washing fluid，VW）和肺組織中的IgA抗體效價(jià)較低，與對照組基本無差別（圖4a、4b、4d、4e）。結(jié)果顯示，NP-FlaB滴鼻組小鼠血清和肺灌洗液中抗體效價(jià)明顯高于NP滴鼻組，表明融合FlaB增強(qiáng)了NP蛋白的黏膜免疫應(yīng)答效果。

圖3 NP-FlaB滴鼻免疫BALB/c小鼠誘導(dǎo)SARS-CoV-2 NP特異性抗體水平的評測Fig. 3 Evaluation of SARS-CoV-2 NP-specific antibodies induced by intranasal immunized with NP, NP-FlaB in BALB/c mice（a）滴鼻免疫流程；（b）免疫56天不同稀釋度血清SARS-CoV-2 NP特異性IgG的檢測；（c）免疫70天不同稀釋度血清SARS-CoV-2 NP特異性IgG的檢測；（d）免疫80天不同稀釋度血清SARS-CoV-2 NP特異性IgG的檢測；（e）免疫56天血清NP特異性IgG抗體效價(jià)；（f）免疫70天血清NP特異性IgG抗體效價(jià)；（g）免疫80天血清NP特異性IgG抗體效價(jià)。●表示NP組；■表示NP-FlaB組；▲表示無熱源水對照組。 **：P＜0.01；ns：P＞0.05。(a) Protocal of intranasal immunization; (b) Detection of the SARS-CoV-2 NP-specific IgG in different dilutions of serum from day 56; (c) Detection of the SARS-CoV-2 NP-specific IgG in different dilutions of serum from day 70; (d) Detection of the SARS-CoV-2 NP-specific IgG in different dilutions of serum from day 80; (e) NP-Specific IgG titer in serum from day 56; (f) NP-Specific IgG titer in serum from day 70; (g) NP-Specific IgG titer in serum from day 80. ● stands for group NP; ■ stands for group NP-FlaB; ▲ stands for group non-thermal water. **: P＜0.01; ns: P＞0.05.

圖4 NP、NP-FlaB滴鼻免疫小鼠的黏膜樣品中SARS-CoV-2 NP特異性IgA抗體的檢測Fig. 4 Detection of NP-specific IgA antibodies against SARS-CoV-2 in the mucosa samples of intranasal immunization BALB /c mice by NP, NP-FlaB vaccine （a）滴鼻免疫唾液；（b）滴鼻免疫鼻腔灌洗液；（c）滴鼻免疫肺灌洗液；（d）滴鼻免疫陰道灌洗液；（e）滴鼻免疫肺組織。●表示NP組；■表示NP-FlaB組；▲表示無熱源水對照組。(a) Saliva of intranasal immunization; (b) Nasal washing fluid of intranasal immunization; (c) Lung washing fluid of intranasal immunization; (d) Vaginal washing fluid of intranasal immunization; (e) Lung tissue of intranasal immunization. ● stands for group NP; ■ stands for group NPFlaB; ▲stands for group non-thermal water.

2.4 NP疫苗皮下注射的免疫效果分析

如圖5所示，皮下注射NP、NP-FlaB的小鼠血清中抗體滴度很高。NP組第一、二、三次免疫后血清稀釋倍數(shù)分別為18 000、437 400、656 100時，其與對照組OD450nm比值仍然大于2∶1；NP-FlaB組第一、二、三次免疫后血清稀釋倍數(shù)分別為3 300、291 600、510 300時與對照組OD450nm比值仍然大于2∶1。由此可以得出，兩組試驗(yàn)組小鼠血清中抗體效價(jià)基本一致，NP-FlaB皮下注射的免疫方式對NP的免疫原性沒有增強(qiáng)作用或增強(qiáng)效果不明顯。但值得注意的是，兩組免疫血清中都獲得了高滴度NP特異性的IgG抗體。

圖5 NP、NP-FlaB皮下免疫BALB/c小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生SARS-CoV-2 NP特異性抗體Fig. 5 Inducing the production of SARS-CoV-2 NP-specific antibodies in BALB/c mice subcutaneous immunized with NP, NP-FlaB （a）皮下免疫流程；（b）免疫14天不同稀釋度血清SARS-CoV-2 NP特異性IgG的檢測；（c）免疫28天不同稀釋度血清SARS-CoV-2 NP特異性IgG的檢測；（d）免疫35天不同稀釋度血清SARS-CoV-2 NP特異性IgG的檢測；（e）免疫14天血清NP特異性IgG抗體效價(jià)；（f）免疫28天血清NP特異性IgG抗體效價(jià)；（g）免疫35天血清NP特異性IgG抗體效價(jià)?！癖硎綨P組；■表示NP-FlaB組；▲表示PBS組。 ***：P＜0.001；ns：P＞0.05。(a) Protocal of subcutaneous immunization; (b) Detection of the SARS-CoV-2 NP-specific IgG in different dilutions of serum from day 14; (c) Detection of the SARS-CoV-2 NP-specific IgG in different dilutions of serum from day 28; (d) Detection of the SARS-CoV-2 NP-specific IgG in different dilutions of serum from day 14; (e) NP-specific IgG titer in serum from day 14; (f) NP-specific IgG titer in serum from day 28; (g) NPspecific IgG titer in serum from day 35. ● stands for group NP; ■ stands for group NP-FlaB; ▲ stands for group PBS. ***: P＜0.001; ns: P＞0.05.

ELISPOT的每個斑點(diǎn)代表一個分泌抗體或細(xì)胞因子的細(xì)胞［22］。如圖6所示，皮下注射組NP、NP-FlaB的NP刺激試驗(yàn)組斑點(diǎn)數(shù)量無顯著差異，但I(xiàn)L-4組斑點(diǎn)數(shù)比IFN-γ組斑點(diǎn)數(shù)多近百倍。這證明皮下注射NP、NP-FlaB疫苗都誘導(dǎo)出了分泌細(xì)胞因子IL-4的NP特異性的效應(yīng)T細(xì)胞，從而調(diào)控免疫應(yīng)答。

圖6 ELISPOT法檢測特異性T細(xì)胞應(yīng)答Fig. 6 Specific T-cell responsee measured by ELISPOT（a）分泌IFN-γ的特異性T細(xì)胞數(shù)量；（b）分泌IL-4的特異性T細(xì)胞數(shù)量；（c）分泌IFN-γ的特異性T細(xì)胞斑點(diǎn)圖；（d）分泌IL-4的特異性 T細(xì)胞斑點(diǎn)圖。*：P＜0.05；***：P＜0.001。(a) The number of specific T cells with secretion of IFN-γ; (b) The number of specific T cells with secretion of IL-4; (c) Spot of specific T cells secreting IFN-γ; (d) Spot of specific T cells secreting IL-4. *: P＜0.05; ***: P＜0.001.

3 討論

本文通過不同免疫方式免疫小鼠，采用ELISA方法對其血清、黏膜樣品進(jìn)行抗體滴度的檢測，用ELISPOT分析評價(jià)免疫效果，探究其可能的作用路徑。NP-FlaB組免疫血清的NP特異性IgG抗體效價(jià)和肺灌洗液中NP特異性IgA抗體效價(jià)明顯高于NP組和對照組。皮下注射兩組蛋白后都誘導(dǎo)出了高滴度的抗體，刺激產(chǎn)生一定數(shù)量的分泌IL-4的特異性效應(yīng)T細(xì)胞，產(chǎn)生的抗體效價(jià)和特異性效應(yīng)T細(xì)胞數(shù)量無顯著差別。皮下免疫NP、NP-FlaB都能產(chǎn)生高滴度的抗體，使得機(jī)體獲得體液免疫，調(diào)控免疫應(yīng)答。NP有可能是通過刺激淋巴細(xì)胞分泌IL-4這種細(xì)胞因子，促進(jìn)II型輔助T細(xì)胞（T helper cells 2，Th2）細(xì)胞增殖，抑制I型輔助T細(xì)胞（T helper cells 1，Th1）細(xì)胞增殖，同時輔助B細(xì)胞活化，發(fā)揮機(jī)體體液免疫作用，從而調(diào)控免疫應(yīng)答。是否是通過此方式激活體液免疫還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。以上結(jié)果表明，F(xiàn)laB可以作為黏膜佐劑增強(qiáng)SARSCoV-2 NP的免疫原性?？偠灾?，皮下注射50 μg NP、NP-FlaB，免疫3次，可以得到高滴度的NP特異性IgG抗體，使機(jī)體獲得免疫。NP、NP-FlaB的免疫應(yīng)答主要是通過誘導(dǎo)體液免疫來實(shí)現(xiàn)的，可以作為SARS-CoV-2的疫苗候選，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

SARS-CoV-2引發(fā)的COVID-19成為全球大流行疾病，且這種感染比季節(jié)性流感等其他疾病更容易傳播，在世界范圍內(nèi)廣泛地人傳人。由于目前尚無針對SARS-CoV-2的特效藥物，疫苗的研發(fā)和應(yīng)用對疾病防控顯得尤為關(guān)鍵。有研究報(bào)道，CoV NP蛋白能誘導(dǎo)保護(hù)性的特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，且中和抗體滴度與NP蛋白特異性T細(xì)胞數(shù)量顯著相關(guān)［23-25］，這與本文研究結(jié)果一致。此外，S蛋白作為SARS-CoV-2中最常見的候選蛋白，其突變速度要遠(yuǎn)高于NP蛋白。NP蛋白的保守性、免疫原性及其隨時間的突變率低等特點(diǎn)，都使得其在新冠肺炎全球大流行背景下極大可能成為通用性的保護(hù)性疫苗，具有成為SARS-CoV-2候選疫苗的巨大潛力。

FlaB作為黏膜佐劑已應(yīng)用到多種疫苗研究中，如諾如病毒二聚體疫苗可通過黏膜佐劑FlaB增強(qiáng)特異性保護(hù)性免疫應(yīng)答［26］；鼻內(nèi)給藥的FlaB佐劑滅活流感疫苗能增強(qiáng)黏膜免疫應(yīng)答，以保護(hù)小鼠免受致命感染［27］；融合FlaB的重組肺炎球菌表面蛋白A（pneumococci surface protein A，PspA）的鼻內(nèi)免疫能增強(qiáng)小鼠對肺炎鏈球菌感染的交叉保護(hù)免疫［28］。以上結(jié)果與本文研究結(jié)果一致，F(xiàn)laB能作為黏膜佐劑增強(qiáng)目的蛋白的免疫原性。pcD-FlaB疫苗肌肉注射豚鼠后，其在豚鼠體內(nèi)不但具有抗同型鉤體感染的作用，也具有較好的交叉保護(hù)作用［29］。但在我們的研究中，用皮下注射的方式注射FlaB對SARS-CoV-2 NP蛋白的免疫增強(qiáng)作用不明顯，但也能誘導(dǎo)出高滴度的抗體。這暗示著，免疫方式對FlaB能否起到免疫增強(qiáng)劑的作用是至關(guān)重要的，用滴鼻或者口服等方式才能更好地發(fā)揮FlaB的佐劑活性。本文為SARS-CoV-2 NP蛋白免疫原性及其成為潛在的亞單位疫苗提供了理論依據(jù)，有助于后續(xù)基于NP疫苗的設(shè)計(jì)和研發(fā)。