基于NE-4C細(xì)胞模型制備豬腦促增殖肽

諶 迪，肖朝耿*，盧文靜，葉 沁，唐宏剛，張 怡，張治國，周天瓊

（1 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品科學(xué)研究所 杭州 310021 2 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品保鮮加工研究中心 上海 201403 3 杭州華津藥業(yè)股份有限公司 杭州 311241）

豬腦鮮嫩可口，富含蛋白質(zhì)、腦磷脂和各種礦物質(zhì)，可増加機(jī)體的免疫力，是傳統(tǒng)的健腦食品[1]。Sharma 等[2]發(fā)現(xiàn)豬腦水解產(chǎn)物多肽可以減緩腦水腫，抑制神經(jīng)元損傷。林元藻等[3]發(fā)現(xiàn)豬腦水解物可顯著增強(qiáng)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。研究表明，豬腦多肽對大腦的改善作用可能與其NSC-34 細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)，然而過高濃度的豬腦多肽會(huì)抑制細(xì)胞的增殖[4]。臨床上，Ziganshina 等[5]發(fā)現(xiàn)豬腦多肽可以改善急性缺血性腦卒中患者的癥狀并延緩病情進(jìn)展，其水解物還可用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病并預(yù)防年齡依賴性癡呆[6-8]。Guekht 等[9]將豬腦多肽水解物用于治療認(rèn)知能力逐漸喪失的血管型失智。豬腦多肽水解物可以通過提高腦組織無氧代謝的ATP 生成量、減少氧自由基生成等作用機(jī)制促進(jìn)腦代謝，增加腦活性[10]。臨床上采用豬腦水解物治療腦功能障礙疾病已有數(shù)十年，早在上世紀(jì)我國就已開發(fā)出中藥制劑用于治療頭痛，如鎮(zhèn)腦寧就是以豬腦為原料開發(fā)而成，采用乳豬制備的腦活性多肽與價(jià)格昂貴的進(jìn)口腦活素具有類似作用[11]。腦活素已在臨床上廣泛應(yīng)用40 多年，已知腦活素是75%游離氨基酸和25%短鏈肽的混合物，短肽可能是其生理活性成分[12]。綜上，豬腦多肽具有重要的藥學(xué)價(jià)值。

與酸堿水解等方法相比，生物酶解法制備多肽具有專一性強(qiáng)，反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)過程容易控制，對環(huán)境友好，無毒性物質(zhì)產(chǎn)生等優(yōu)點(diǎn)[13-15]。采用酶解制備的生物活性肽具有抗氧化、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等多種功能[16-19]。豬腦酶解產(chǎn)物已被用于治療腦功能障礙疾病，如奧地利生產(chǎn)的腦活素（Cerebrolyzin），日本生產(chǎn)的Ceremon 及德國、羅馬尼亞生產(chǎn)的Crelizin 都是通過酶水解腦蛋白獲得的制劑。豬腦多肽可保護(hù)神經(jīng)元防止大腦損傷，還能預(yù)防炎癥，抑制細(xì)胞凋亡[20]。豬腦多肽水解物中的活性短肽與內(nèi)源神經(jīng)營養(yǎng)因子有類似的作用[21]?；诖僭鲋郴钚詢?yōu)化豬腦多肽的提取制備技術(shù)很有必要。

本文以豬腦蛋白為材料，通過胃蛋白酶、胰蛋白酶和脂肪酶等制備豬腦促增殖肽，采用色譜法比較豬腦酶解液中多肽分子質(zhì)量的分布。確定了豬腦促增殖肽培養(yǎng)小鼠神經(jīng)干細(xì)胞的條件，基于NE-4C 神經(jīng)干細(xì)胞模型，考查了加酶量，酶解溫度、酶解時(shí)間和pH 值等對其促增殖活性的影響，以NE-4C 促增殖活性為指標(biāo)，通過正交法優(yōu)化酶解工藝，以期為豬腦促增殖肽的制備提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷凍鮮豬腦，購自農(nóng)貿(mào)市場。胰蛋白酶（1∶250）、胃蛋白酶（1∶30 000），上海源葉生物科技有限公司；脂肪酶（Palatase 2000L，20 000 U/g），諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司；標(biāo)準(zhǔn)牛血清蛋白，生工生物工程（上海）股份有限公司；Eagle MEM 培養(yǎng)基，Gibco 公司；胎牛血清，Hyclon 公司；MTT 試劑盒，南京凱基生物技術(shù)有限公司；多聚賴氨酸（cat#P-9155），Sigma 公司；谷氨酰胺（35050）、非必需氨基酸（100×，11140），Invitrogen 公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純級。

1.2 主要儀器與設(shè)備

5424R 冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf 公司；Spectra MAX190 全波長酶標(biāo)儀，美國MD 公司；超濾設(shè)備，美國Millipore 公司；超凈工作臺(tái)，HITIK公司；二氧化碳培養(yǎng)箱，Thermo 公司；pH 計(jì)，上海三星儀器有限公司；ULTRA-TURRAXT1.8basic 勻漿機(jī)，德國IKA 公司；電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；粉碎機(jī)，德清拜杰電器有限公司；烘箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 豬腦促增殖肽制備酶的篩選 冷凍的鮮豬腦自然解凍后，除去血塊和腦膜（軟腦膜和蛛網(wǎng)膜），用生理鹽水沖洗，均質(zhì)機(jī)勻漿得到豬腦勻漿[22]，密封于冰箱中冷藏儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 NE-4C 神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng) 將Eagle MEM、胎牛血清、谷氨酰胺和非必需氨基酸（100×）按88∶10∶1∶1 的比例在無菌條件下制備小鼠神經(jīng)干細(xì)胞完全培養(yǎng)液。細(xì)胞復(fù)蘇及傳代前至少提前2 h在T25 培養(yǎng)瓶中鋪15 μg/mL 多聚賴氨酸進(jìn)行預(yù)處理。在無菌件下，將NE-4C 細(xì)胞接種于小鼠神經(jīng)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基中，在CO2培養(yǎng)箱中（37 ℃、5% CO2）環(huán)境培養(yǎng)，每天更換完全培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞生長至培養(yǎng)瓶總體積的70%～80%時(shí)，用0.25%胰酶消化，多聚賴氨酸預(yù)處理2 h 后傳代并繼續(xù)培養(yǎng)。試驗(yàn)所需細(xì)胞取自同代。

1.3.3 MTT 法測定NE-4C 的細(xì)胞促增殖活性促增殖活性檢測參考文獻(xiàn)并作適當(dāng)修改[23]：將NE-4C 細(xì)胞按2 000 個(gè)/孔接種至96 孔板中，接種前2 h 用15 μg/mL 多聚賴氨酸預(yù)處理T25 培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)過夜去后去掉培養(yǎng)基。酶解液中多肽含量用Bradford 法檢測[24]，用完全培養(yǎng)基將豬腦多肽稀釋至0.5 mg/mL，培養(yǎng)NE-4C 細(xì)胞48 h，每孔加入50 μL MTT 工作液4 h 后去掉培養(yǎng)基，加入150 μL 二甲亞砜（DMSO）混勻，室溫?fù)u床15 min，于波長492 nm 處檢測吸光值。

1.3.4 色譜法檢測酶解后豬腦多肽分子質(zhì)量分布 采用高效凝膠滲透色譜法對豬腦多肽的分子質(zhì)量分布進(jìn)行表征，參考文獻(xiàn)中方法并作適當(dāng)修改[25]。色譜條件：Ultrahydrogel TM Linear 2 根串聯(lián)（7.8 mm×300 mm），柱溫45 ℃，流動(dòng)相0.1 mol/L NaNO3，流速0.6 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。采用RID示差折光檢測器進(jìn)行檢測。用流動(dòng)相配制1.0 mg/mL 豬腦多肽酶解物及系列葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，過0.22 μm 水系濾膜后分析。系列標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間和對應(yīng)分子質(zhì)量的對數(shù)值，由GPC 軟件自動(dòng)分析并生成分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線。待測樣品色譜圖中各個(gè)峰的相對分子質(zhì)量由GPC 軟件基于標(biāo)準(zhǔn)曲線自動(dòng)計(jì)算。

1.3.5 加酶量、pH 值、酶解溫度和酶解時(shí)間對促增殖活性的影響 準(zhǔn)確稱取豬腦勻漿（1.00±0.01）g，置于250 mL 錐形瓶中，加入200 mL 去離子水，磁力攪拌30 min，依次研究加酶量、pH 值、酶解溫度和酶解時(shí)間對酶解液促增殖活性的影響。

1.3.6 豬腦促增殖肽提取工藝優(yōu)化 針對豬腦促增殖肽提取制備工藝，采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化胰蛋白酶的加入量（A，mg）、pH 值（B）、酶解溫度（C，℃）以及酶解時(shí)間（D，h），因素與水平見表1。

表1 因素與水平Table 1 Factors and levels

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果 通過SPSS 18.0 軟件分析，組間差異比較采用One-way ANOVA 檢驗(yàn)比較其差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬腦促增殖肽制備酶的篩選

由圖1a 可知，與對照組相比，胰蛋白酶酶解豬腦后，其多肽水解物的促增殖活性顯著高于對照組（P＜0.05），而胃蛋白酶及脂肪酶的酶解產(chǎn)物與對照組無顯著性差異（P＞0.05），這可能與胰蛋白酶酶解豬腦后，其小分子質(zhì)量多肽占比較高相關(guān)。很多調(diào)控促進(jìn)細(xì)胞增殖的多肽以短肽的形式存在，分子質(zhì)量較小，如蠶蛹蛋白肽[26]、成骨生長肽[27]及神經(jīng)肽P 物質(zhì)[28]等。

由圖1b 可以發(fā)現(xiàn)，采用胰蛋白酶酶解豬腦蛋白，隨著酶解物中多肽質(zhì)量濃度的增加，對NE-4C 細(xì)胞的促增殖能力提高，但當(dāng)質(zhì)量濃度高于5 mg/mL 時(shí)，促增殖能力未出現(xiàn)繼續(xù)增強(qiáng)的現(xiàn)象，因此，豬腦多肽添加質(zhì)量濃度為5 mg/mL 時(shí)，可適于NE-4C 細(xì)胞培養(yǎng)。

圖1 不同豬腦酶解物對NE-4C 細(xì)胞促增殖活性的影響Fig.1 Effects of different enzymic hydrolysis on proliferative activities of porcine brain

2.2 豬腦酶解物中多肽分子質(zhì)量分布

由圖2和表2可知，豬腦勻漿液在未酶解前，其多肽含量較低，儀器無法檢出。胃蛋白酶、胰蛋白酶及復(fù)合酶（胃蛋白酶和胰蛋白酶依次酶解）酶解豬腦蛋白后，多肽分子質(zhì)量分布主要集中在2 000 u 以下。胰蛋白酶酶解產(chǎn)物中，多肽分子質(zhì)量分布主要集中在500 u 以下，而此分子質(zhì)量的多肽多表現(xiàn)出較高的生物活性[29]。豬腦經(jīng)胰蛋白酶酶解后，分子質(zhì)量在180～500 u 范圍的多肽占總多肽含量的41.42%，其次為分子質(zhì)量低于180 u 的多肽，占30.67%，均高于胃蛋白酶和復(fù)合酶酶解產(chǎn)物，表明在制備豬腦小分子肽方面，胰蛋白酶優(yōu)于胃蛋白酶及復(fù)合酶。

圖2 豬腦酶解物中多肽分子質(zhì)量分布Fig.2 Polypeptide molecular weight distribution of porcine brain enzymic hydrolysates

表2 豬腦酶解液中多肽分子質(zhì)量分布Table 2 Polypeptides molecular weight distribution of porcine brain enzymic hydrolysates

復(fù)合酶酶解液中大于5 000 u 和5 000～3 000 u 范圍的多肽含量均低于另外2 種酶，分別僅占總多肽含量的0.10%和0.61%。結(jié)果表明，復(fù)合酶可以提高分子質(zhì)量小于2 000 u 的多肽比例，然而制備分子質(zhì)量小于180 u 多肽的效果不如胰蛋白酶，推測胰蛋白酶酶解產(chǎn)物的促增殖活性與其較高比例分子質(zhì)量小于180 u 的短肽相關(guān)。

2.3 各因素對促增殖活性的影響

由圖3可知，加酶量為20 mg 和30 mg 時(shí)，豬腦促增殖肽的活性最強(qiáng)；隨著酶解時(shí)間的增加，促增殖活性逐漸增加，但無顯著性差異；酶解溫度為30 ℃時(shí)，制備的豬腦促增殖肽活性最低，而當(dāng)酶解溫度為45 ℃時(shí)可顯著增加其促增殖活性；pH 值對促增殖活性的影響無顯著性差異。

圖3 不同因素對豬腦多肽促增殖活性的影響Fig.3 Effects of different factors on the proliferative activity of porcine brain polypeptides

2.4 豬腦多肽制備的最適條件

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按表1中所列的因素與水平，以促增殖活性為指標(biāo)，通過L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化豬腦促增殖肽提取工藝，結(jié)果見表3。

此試驗(yàn)研究了4 個(gè)因素對豬腦促增殖肽酶解工藝的影響，分別是加酶量、pH 值、酶解溫度和酶解時(shí)間。由表3可以看出，影響酶解工藝的主次因素依次是加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度和pH 值。較優(yōu)水平是加酶量25 mg，酶解時(shí)間4 h，酶解溫度45 ℃，pH 7.5。在最適條件下，NE-4C 相對活力為0.161。

表3 L9 （34）正交試驗(yàn)Table 3 L9 （34）orthogonal tests

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過酶促水解豬腦制備促增殖肽，以酶解液的促增殖能力為指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶較胃蛋白酶和脂肪酶更適合用于豬腦促增殖肽的制備。利用高效凝膠滲透色譜法發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶解產(chǎn)物中分子質(zhì)量小于500 u 的多肽占總多肽含量的72.09%，特別是分子質(zhì)量小于180 u 的多肽含量為30.67%，遠(yuǎn)高于胃蛋白的8.75%和復(fù)合酶的5.62%，表明胰蛋白酶酶解豬腦產(chǎn)物的促增殖活性與其較高比例的低分子質(zhì)量肽相關(guān)。針對胰蛋白酶的加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度和pH 值設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，最終得到較優(yōu)水平為加酶量25 mg，酶解時(shí)間4 h，酶解溫度45 ℃，pH 7.5。在最適條件下，NE-4C 相對活力為0.161。本試驗(yàn)制備的豬腦多肽具有一定的促增殖活性，可作為功能性配料應(yīng)用于相關(guān)食品中，為豬腦的高值化利用提供了新的參考。