豬肉中呋喃妥因代謝物殘留液相色譜檢測(cè)方法的建立

胡潔芳

(江西工業(yè)貿(mào)易職業(yè)技術(shù)學(xué)院，南昌 330038)

在眾多飼料安全問(wèn)題中，獸藥殘留一直是影響飼料安全的最主要因素之一。獸藥在促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、預(yù)防和治療動(dòng)物疾病、控制動(dòng)物繁殖等方面起著重要作用。由于我國(guó)在獸藥的使用和管理上存在很多問(wèn)題，致使動(dòng)物性產(chǎn)品中獸藥殘留超標(biāo)事件屢屢發(fā)生，嚴(yán)重影響了人們的身體健康和我國(guó)動(dòng)物性產(chǎn)品的出口貿(mào)易。目前對(duì)人畜危害較大的獸藥主要包括抗生素類、磺胺類、硝基呋喃類、抗寄生蟲類及激素類等藥物。其中硝基呋喃類藥物因具有殺菌能力強(qiáng)、抗菌譜廣、不易產(chǎn)生耐藥性、價(jià)格低廉、療效好等優(yōu)點(diǎn)，曾經(jīng)在畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中廣泛應(yīng)用[1-3]。

呋喃妥因是硝基呋喃類獸藥的一種，殺菌能力強(qiáng)、抗菌譜廣、不易產(chǎn)生耐藥性、價(jià)格低廉、療效好，在臨床上得到了廣泛應(yīng)用，主要用于雞白痢、雞大腸桿菌病、雞球蟲病等各種腸道感染性疾病的治療及用作豬、禽類和水產(chǎn)促生長(zhǎng)的添加劑。有關(guān)研究證明，大劑量或長(zhǎng)時(shí)間使用呋喃它酮原藥能對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物有毒性作用，表現(xiàn)為厭食、腹瀉、胃腸出血、周圍神經(jīng)炎、興奮、驚厥、癱瘓等，嚴(yán)重還會(huì)導(dǎo)致死亡。呋喃妥因及其代謝物AHD還能夠誘導(dǎo)有機(jī)體基因突變及致畸胎且能夠誘發(fā)癌癥[4-5]。

目前關(guān)于呋喃妥因及其代謝物AHD殘留監(jiān)測(cè)常用的方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[6]、液相-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[7]和免疫分析方法[8]。本研究采用高效液相色譜法對(duì)豬肉中呋喃妥因代謝物AHD殘留進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)色譜條件和樣品前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)選，在最優(yōu)的色譜條件和樣品前處理?xiàng)l件基礎(chǔ)上建立豬肉中AHD殘留的高效液相色譜檢測(cè)方法并對(duì)建立的方法進(jìn)行一系列的方法學(xué)評(píng)價(jià)，為動(dòng)物性食品中呋喃妥因原藥和代謝物AHD殘留監(jiān)控提供理論基礎(chǔ)，具有很好的應(yīng)用前景。

1 試驗(yàn)材料和儀器

1.1 試驗(yàn)材料

豬肉，購(gòu)買于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；鄰硝基苯甲醛，氫氧化鈉，三水合磷酸氫二鉀，吐溫-20，二甲基亞砜，冰乙酸，鹽酸等均為分析純；無(wú)水甲醇，乙腈為色譜純（天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心）；AHD標(biāo)準(zhǔn)品和NPAHD標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)Sigma公司）。

1.2 主要儀器

Waters2487高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司），TDL-5-A低速大容量離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠），RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮有限公司生化儀器廠），pHS-3C pH計(jì)（上海雷磁儀器廠）等。

2 試驗(yàn)方法

2.1 試劑配制

①PBS：0.05g磷酸二氫鉀，0.725g十二水磷酸氫二鈉，2g氯化鈉，0.05g氯化鉀溶于250mL容量瓶中。

②PBST：取50mLPBS和25μL吐溫-20混合于小燒杯中，并用保鮮膜封口。

③2mg/mL呋喃妥因母液：準(zhǔn)確稱取呋喃妥因標(biāo)準(zhǔn)品，并用二甲亞砜作為溶劑配成2mg/mL濃度的母液。

2.2 樣品處理

取1.0g均質(zhì)樣品于50mL離心管中，加入4mL蒸餾水，0.5mL 1mol/mL鹽酸和400μL 10 mmol/L 2-硝基苯甲醛，充分振蕩30 s，然后用錫箔紙進(jìn)行包裹，置于37℃水浴中恒溫振蕩16h，取出冷卻后加入5mL 0.1mol/mL磷酸氫二鉀，用1mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)至合適的pH，再加5mL乙酸乙酯，渦旋振蕩30 s，于4500g離心10min，取出乙酸乙酯層于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶蒸發(fā)至干，用3mL正己烷溶解干燥物,加1mL 0.01mol/mL PBST適當(dāng)?shù)幕旌?，在室溫?500 g離心10 min，下層液體用0.45μm濾頭過(guò)濾后進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)。

2.3 參考色譜條件

本實(shí)驗(yàn)參考了GB/T 20752-2006豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測(cè)定的色譜條件[9]，其色譜條件如下：色譜柱：Atlantis-C18,3.5μm,150mm×2.1mm； 柱 溫：35℃；進(jìn)樣量：40μL；梯度洗脫程序（見表1）：

表1 國(guó)標(biāo)色譜梯度洗脫程序

2.3.1 色譜條件的優(yōu)化

由于本實(shí)驗(yàn)使用的色譜柱同參考的國(guó)標(biāo)方法所用的色譜柱型號(hào)不同，為Symmerry-C18（5μm,4.6×250mm），在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)參考的國(guó)標(biāo)的色譜條件對(duì)此色譜柱不合適，需要對(duì)柱溫，流速，流動(dòng)相等色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，從而得到在此色譜柱條件下測(cè)定呋喃妥因代謝物AHD殘留的最佳色譜測(cè)定條件。

2.3.2 柱溫

本實(shí)驗(yàn)選擇20℃，25℃，30℃，35℃，40℃五個(gè)柱溫對(duì)同一個(gè)樣品進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定，考察不同柱溫對(duì)樣品峰分離效果的影響，從而選出最優(yōu)柱溫進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)[9-10]。

2.3.3 流速

流速對(duì)高效液相色譜測(cè)定樣品出峰時(shí)間和分離效果會(huì)有一定的影響，本實(shí)驗(yàn)中選擇0.2mL/min，0.4mL/min，0.5mL/min，0.6mL/min，0.8mL/min五個(gè)流速對(duì)同一個(gè)樣品進(jìn)行高效液相測(cè)定，探究不同流速對(duì)NPAHD峰分離效果的影響，從而選出最優(yōu)流速進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)[9-12]。

2.3.4 流動(dòng)相pH

由于流動(dòng)相的酸度對(duì)NPAHD峰分離效果有一定的影響，參考國(guó)標(biāo)中0.3%乙酸水的酸度比較大（pH約為3），考慮到流動(dòng)相酸度過(guò)高對(duì)色譜柱和液相色譜儀有較大腐蝕作用，為保護(hù)所使用的色譜柱和儀器，希望在更低的酸度條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)也能得到較好的分離效果，所以本實(shí)驗(yàn)選擇pH=3.0，pH=4.0，pH=5.0三個(gè)流動(dòng)相酸度來(lái)進(jìn)行液相色譜測(cè)定，探究流動(dòng)相不同酸度對(duì)NPAHD分離效果的影響，從而找出最優(yōu)流動(dòng)相pH。

2.4 樣品預(yù)處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.4.1 甲醇水處理對(duì)NPAHD提取影響

彭濤等人[10]發(fā)現(xiàn)樣品在酸解之前加入甲醇水處理樣品能夠有效的去除樣品中的雜質(zhì)，有利于后續(xù)NPAHD的提取，但大部分文獻(xiàn)都沒(méi)有做這一步處理，所以本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了酸解前加甲醇水處理和不加甲醇水處理兩組實(shí)驗(yàn)，考察酸解前加甲醇水處理對(duì)NPAHD提取效果的影響。

2.4.2 衍生液PH對(duì)乙酸乙酯提取NPAHD的影響

樣品衍生16h后衍生液pH對(duì)乙酸乙酯提取NPAHD有一定的影響，本實(shí)驗(yàn)選擇了pH=6.0，pH=6.5，pH=7.0，pH=7.5四個(gè)衍生液酸度梯度，考察衍生液不同pH對(duì)后續(xù)乙酸乙酯提取NPAHD的影響，每個(gè)pH做兩個(gè)平行樣，從而選出最優(yōu)衍生液pH來(lái)進(jìn)行后續(xù)添加回收的實(shí)驗(yàn)測(cè)定。

2.5 NPAHD標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

取2mg/mL NPAHD標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用PBS稀釋至1μg/mL、0.5μg/mL、0.2μg/mL、0.1μg/mL、0.05 μg/mL等濃度，按前述優(yōu)選好的色譜條件進(jìn)樣液相色譜測(cè)定，每個(gè)濃度做兩個(gè)平行測(cè)定，以濃度作為橫坐標(biāo)，峰面積作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

2.6 精密度試驗(yàn)

用3個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)NPAHD溶液在前述優(yōu)選好的色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣5次，對(duì)得到的峰面積進(jìn)行差異分析，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和變異系數(shù)（CV），確定方法的精密度。得到的變異系數(shù)越小，方法的精密度越高。按下面公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)：

式中：X為n次重復(fù)測(cè)定的算術(shù)平均值；Xi為n次測(cè)定中的一次；n為重復(fù)測(cè)定的次數(shù)。

2.7 添加回收率試驗(yàn)

稱取均質(zhì)好的1g豬肉樣品，分別加入1mL配 制 好 的0.2μg/mL，0.5μg/mL，1μg/mL，2μg/mL的AHD標(biāo)準(zhǔn)品，加入4mL蒸餾水，0.5mL 1mol/mL鹽酸和400μL 10mmol/mL 2-硝基苯甲醛，充分振蕩30 s，置于37℃水浴中恒溫振蕩16h，取出冷卻后加入5mL 0.1mol/mL磷酸氫二鉀，用1mol/mL氫氧化鈉溶液調(diào)到最適pH，5mL乙酸乙酯，渦旋振蕩30 s，于4500g離心10min，取出乙酸乙酯層于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶蒸發(fā)至干，用3mL正己烷溶解干燥物,加1mL 0.01mol/mL PBST適當(dāng)?shù)幕旌希谑覝叵?500g離心10min，下層液體用0.45μm濾頭過(guò)濾后進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)。每個(gè)樣本做2個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)NPAHD檢測(cè)結(jié)果得到AHD回收檢出量，計(jì)算方法的添加回收率。

3 結(jié)果與分析

3.1 色譜條件的優(yōu)選

3.1.1 柱溫的選擇（見圖1）

圖1 不同柱溫對(duì)NPAHD分離效果的影響

本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了40℃，35℃，30℃，25℃，20℃五個(gè)柱溫進(jìn)行高效液相色譜測(cè)定，結(jié)果如圖1所示。從圖1可知柱溫為40℃時(shí)峰型和分離效果都不是很好，而35℃，30℃，25℃，20℃時(shí)的柱溫圖形都差不多，但NPAHD都沒(méi)有完全拉開，因?yàn)橹鶞剌^高時(shí)影響色譜柱的壽命，所以最終選擇30℃作為色譜柱溫的條件，通過(guò)改變其他色譜條件來(lái)使NPAHD達(dá)到分離。

3.1.2 流速的選擇（見圖2）

流速對(duì)于出峰時(shí)間和色譜峰分離效果影響較 大，本 實(shí) 驗(yàn) 設(shè) 置 了0.2mL/min、0.4mL/min、0.5 mL/min、0.6mL/min、0.8mL/min5個(gè)流速梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出流速越慢，出峰時(shí)間也越慢，流速加大，出峰時(shí)間縮短，當(dāng)流速在0.2和0.4mL/min時(shí)NPAHD峰沒(méi)有分開，流速在0.5mL/min時(shí)峰型和分離效果最好，流速在0.8mL/min時(shí)NPAHD峰雖然也分開了，但峰形不好且在0.8mL/min流速時(shí)柱壓偏大，綜合考慮以上因素，選擇了0.5mL/min作為最佳流速進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 不同流速對(duì)NPAHD分離效果的影響

3.1.3 流動(dòng)相乙酸水pH的選擇（見圖3）

圖3 不同流動(dòng)相pH對(duì)NPAHD分離效果的影響

根據(jù)參考文獻(xiàn)，其所用的乙酸水流動(dòng)相pH在3左右，本實(shí)驗(yàn)考慮到高酸性的流動(dòng)相對(duì)實(shí)驗(yàn)儀器和色譜柱有一定的腐蝕作用，且用參考流動(dòng)相做預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)分離效果也不好，所以設(shè)置了pH=3，pH=4，pH=5的三個(gè)酸度梯度，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，pH=5時(shí)，NPAHD峰完全沒(méi)有和其它峰分開，pH=3和pH=4時(shí)，峰型和分離效果都較好，因?yàn)榭紤]到流動(dòng)相低酸度時(shí)有利于保護(hù)色譜儀和色譜柱，所以本實(shí)驗(yàn)選擇了乙酸水pH=4作為最佳流動(dòng)相pH。

3.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)選

3.2.1 甲醇水處理對(duì)NPAHD提取效果的影響（見圖4）

圖4 樣品加酸水解前加甲醇水對(duì)NPAHD提取分離效果的影響

從彭濤等人[10]實(shí)驗(yàn)中了解到，樣品在酸解前加入甲醇水，并離心去除上清液，能夠除去樣品中的一些雜質(zhì)，讓結(jié)果更加準(zhǔn)確，但根據(jù)本試驗(yàn)圖4結(jié)果可知加入甲醇水后的色譜圖與沒(méi)加甲醇水的色譜圖型基本一樣，NPAHD峰面積差別不大，沒(méi)有什么效果，所以為了簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)步驟，我們選擇不加甲醇水處理樣品，而是直接進(jìn)行酸解并離心，然后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2.2 衍生液pH的選擇（見圖5）

樣品經(jīng)過(guò)酸解衍生16h后用磷酸二氫鉀和氫氧化鈉對(duì)樣品pH進(jìn)行調(diào)節(jié)，衍生液不同pH對(duì)后續(xù)NPAHD的提取有一定的影響，所以本實(shí)驗(yàn)設(shè)置了4個(gè)pH梯度6.0，6.5，7.0，7.5來(lái)進(jìn)行優(yōu)選，結(jié)果如圖5所示。從圖5結(jié)果發(fā)現(xiàn)pH在7.0時(shí)的峰面積、峰型和分離效果較其他pH更好，所以本實(shí)驗(yàn)選擇了將衍生液pH調(diào)至7.0時(shí)做為最優(yōu)衍生液pH進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖5 衍生液不同pH對(duì)乙酸乙酯提取NPAHD效果的影響

3.3 NPAHD標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖6）

圖6 NPAHD標(biāo)準(zhǔn)曲線

以NPAHD濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖6，線性回歸方程為y=35648x-442.84，相關(guān)系數(shù)R2=0.9985。

3.4 精密度試驗(yàn)（見表2）

由表2知，本實(shí)驗(yàn)的變異系數(shù)均小于6%，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)建立的高效液相色譜法精密度較好。

表2 高效液相色譜法的精密度

3.5 添加回收試驗(yàn)

采用本實(shí)驗(yàn)建立的高效液相色譜法進(jìn)行豬肉樣品添加AHD標(biāo)樣的添加回收實(shí)驗(yàn)，計(jì)算4個(gè)濃度加標(biāo)樣品中的標(biāo)準(zhǔn)偏差（CV）和本方法的添加回收率，對(duì)本實(shí)驗(yàn)建立的高效液相色譜法檢測(cè)實(shí)際樣品的能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。從表3可知，高效液相色譜法的加標(biāo)回收率范圍為81%~95%，符合方法建立的加標(biāo)回收率要求。

表3 高效液相色譜法對(duì)豬肉中AHD添加回收率(n=2)

4 討論

本實(shí)驗(yàn)使用的色譜柱和國(guó)標(biāo)GB/T 20752-2006所用的色譜柱的型號(hào)不同，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)參考的國(guó)標(biāo)的色譜條件對(duì)此色譜柱不合適，需要對(duì)柱溫，流速，流動(dòng)相等色譜條件重新進(jìn)行優(yōu)化，使得NPAHD能得到良好分離，從而得到在此色譜柱條件下測(cè)定呋喃妥因代謝物的衍生物NPAHD殘留的最佳色譜測(cè)定條件。從色譜條件優(yōu)選實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，色譜柱溫在40℃時(shí)峰型和分離效果最差，其它溫度條件下效果相差不大，也沒(méi)有完全分開，流速過(guò)高或過(guò)低都影響了NPAHD出峰效果，流速在0.5mL/min時(shí)峰型和分離效果最好，流動(dòng)相乙酸水的pH不同對(duì)結(jié)果也產(chǎn)生了較大的影響，在其pH=4時(shí)，效果最好。所以本實(shí)驗(yàn)選擇了柱溫30℃，流速0.5mL/min，pH=4的乙酸水-乙腈流動(dòng)相作為最佳色譜條件。

在上述優(yōu)選確定了的色譜條件下再對(duì)樣品前處理的一些條件進(jìn)行優(yōu)選。由于樣品酸解前甲醇水處理和樣品酸解衍生16h后的衍生液pH對(duì)NPAHD提取有一定影響，所以本實(shí)驗(yàn)針對(duì)這兩個(gè)前處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)樣品經(jīng)甲醇水處理后，NPAHD的提取效果并沒(méi)有得到提高，而衍生液pH為7的樣品經(jīng)高效液相檢測(cè)出的NPAHD的峰型、分離效果和峰面積最好。所以我們將甲醇水處理這一操作步驟去除，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)，并且將衍生液pH調(diào)至7作為樣品前處理的優(yōu)選。

然后在最佳的前處理和最佳的色譜條件下對(duì)精密度和添加回收率進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)精密度和添加回收率的數(shù)據(jù)來(lái)評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)建立的NPAHD高效液相色譜測(cè)定方法。精密度實(shí)驗(yàn)變異系數(shù)均小于6%，添加回收實(shí)驗(yàn)回收率范圍為81%～95%，可知精密度和添加回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果都符合要求，說(shuō)明建立的高效液相色譜法可以用于豬肉中呋喃妥因代謝物AHD殘留的檢測(cè)。

從本試驗(yàn)我們得到的經(jīng)驗(yàn)是在借鑒相關(guān)文獻(xiàn)和方法時(shí)切忌盲目搬抄，應(yīng)該具體問(wèn)題具體分析。本實(shí)驗(yàn)因?yàn)樯V柱型號(hào)和參考文獻(xiàn)不一致，所以需要對(duì)所用的色譜條件和前處理?xiàng)l件重新進(jìn)行優(yōu)選，得出最適合自己的色譜條件和前處理?xiàng)l件來(lái)建立合理可靠的高效液相色譜檢測(cè)方法。

5 結(jié)論

(1)本試驗(yàn)優(yōu)化的色譜條件為柱溫30℃，流速0.5mL/min，流動(dòng)相為pH=4.0的乙酸水溶液（A）和乙腈(B)，梯度洗脫時(shí)間、乙酸水溶液和乙腈配比參考國(guó)標(biāo)（見表1），提高了測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度。

(2)本試驗(yàn)優(yōu)化的前處理?xiàng)l件為加酸酸解衍生前不加甲醇水，乙酸乙酯提取前調(diào)衍生液pH＝7.0，提高了前處理的效率。

(3)在優(yōu)化的色譜條件和預(yù)處理?xiàng)l件下建立測(cè)定NPAHD的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得到其線性回歸方程為y=35648x-442.84，相關(guān)系數(shù)R2=0.9985；本試驗(yàn)建立的高效液相色譜法精密度實(shí)驗(yàn)的平均相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于6%；高效液相色譜法添加回收率范圍為81%～95%，說(shuō)明建立的高效液相色譜法可用于豬肉中呋喃妥因代謝物AHD殘留的檢測(cè)。