利用LC-MS/MS輔助優(yōu)化GICA對(duì)硝基呋喃類代謝物的快速檢測(cè)

盧義博，余海霞，張小軍，嚴(yán)忠雍，倫麗麗，王瑞瑞

(1.浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江 舟山 316021；2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江 舟山 316021；3.浙江大學(xué)舟山海洋研究中心，浙江 舟山 316021；4.江蘇美正生物科技有限公司，浙江 無錫 214135)

硝基呋喃類藥物是一類廣譜抗生素，具有5-硝基基本結(jié)構(gòu)，通過影響細(xì)菌體內(nèi)的氧化還原酶體系，干擾細(xì)菌正常代謝，曾普遍應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖、畜牧業(yè)和其他養(yǎng)殖行業(yè)中疾病的預(yù)防和治療[1-2]。研究表明，硝基呋喃類藥物對(duì)動(dòng)物具有“三致”毒性，并對(duì)人體具有致畸胎作用，且能誘發(fā)癌癥[3]。因此，1995年歐盟禁止將其應(yīng)用于食品中，并將其歸類為A類禁用藥物[4-5]。原農(nóng)業(yè)部于2002年發(fā)布193公告，規(guī)定所有食品動(dòng)物中禁止檢出硝基呋喃類抗生素藥物。

硝基呋喃類藥物主要包含呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃西林和呋喃妥因4種，在動(dòng)物體內(nèi)代謝迅速，大約數(shù)小時(shí)，但是該類藥物的代謝產(chǎn)物3-氨基-2-噁唑烷基酮(AOZ)、5-甲基嗎啉-3-氨基-2-噁唑烷基酮(AMOZ)、氨基脲(SEM)及1-氨基-2內(nèi)酰脲 (AHD)能夠與膜蛋白鍵結(jié)合形成穩(wěn)定態(tài)，可以長(zhǎng)期保持穩(wěn)定[6-7]。因此，檢測(cè)4種硝基呋喃類代謝物殘留可以更準(zhǔn)確、直觀的反映硝基呋喃類抗生素的使用情況。

目前硝基呋喃類代謝藥物殘留的主要檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫法(ELISA)[8-9]、膠體金免疫層析法(GICA)[10-11]、高效液相色譜法(HPLC)[12-13]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[14-18]等。ELISA雖特異性強(qiáng)，但反應(yīng)耗時(shí)長(zhǎng)，操作過程中易受溫度干擾。HPLC、LC-MS/MS具有靈敏度高、檢出限低、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，但存在儀器昂貴、前處理時(shí)間較長(zhǎng)、操作方法復(fù)雜的缺點(diǎn)。GICA的原理是以硝酸纖維素膜為固相載體，以膠體金作為示蹤標(biāo)記物，與抗體結(jié)合，在微孔膜的滲濾作用或毛細(xì)管作用下，利用抗原抗體反應(yīng)的高度特異性和膠體金特有的顏色對(duì)金標(biāo)抗體與抗原或二抗的結(jié)合進(jìn)行示蹤，顯示肉眼可見的紅色條帶或斑點(diǎn)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物的定性分析[19]。因此膠體金技術(shù)具有方便快捷、不需要特殊設(shè)備和結(jié)果判斷直觀等優(yōu)點(diǎn)。但同時(shí)該方法受抗原和膠體金的穩(wěn)定性及靈敏度的影響，易被不同樣本基質(zhì)和檢測(cè)溶液中雜質(zhì)干擾，從而影響結(jié)果的判斷。針對(duì)硝基呋喃類代謝物的快速檢測(cè)方法存在的缺陷，有必要對(duì)硝基呋喃類代謝物GICA方法進(jìn)行優(yōu)化。

硝基呋喃類代謝物樣本基質(zhì)差異明顯，實(shí)際陽性樣本中硝基呋喃類代謝物以結(jié)合態(tài)形式存在，而陰性加標(biāo)樣品以游離態(tài)形式存在，所以2種基質(zhì)樣本在同一前處理?xiàng)l件下結(jié)果相差較大。針對(duì)硝基呋喃類代謝物的GICA的檢測(cè)方法存在的缺陷，本實(shí)驗(yàn)選擇不同基質(zhì)樣品進(jìn)行水解和衍生化，采用外標(biāo)法，由LC-MS/MS準(zhǔn)確定量，同時(shí)采用原農(nóng)業(yè)部783公告方法測(cè)定樣本含量，2種數(shù)據(jù)換算以回收率作為參考指標(biāo)，優(yōu)化GICA的前處理，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確率。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器與試劑

ACQUITY高效液相色譜-質(zhì)譜儀 Quattro Premier XE(美國Waters公司)；T18勻漿機(jī)、MS2漩渦混合器(德國IKA公司)；N-EVAP-112氮吹儀(美國Organomation公司)；Centrifuge 5810高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；HH-S11數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市精達(dá)儀器制造公司)。

鹽酸、磷酸氫二鉀(分析純，上海國藥集團(tuán))；甲醇、二甲基亞砜、2-硝基苯甲醛、醋酸乙酯等(色譜純，美國Sigma公司)，硝基呋喃類代謝物標(biāo)準(zhǔn)品及其內(nèi)標(biāo)物：AOZ、SEM-HC1、AHD-HC1、AMOZ、AOZ-D4、SCA-HCL-13C-15N2、AHD-HCL-13C3、AMOZ-D5(純度均≥98%，美國Sigma公司)；呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因及呋喃西林代謝物膠體金快速檢測(cè)試紙條(江蘇美正生物科技有限公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及不同樣品的制備

準(zhǔn)確稱取(5.00± 0.01)mg AOZ、SEM、AHD、AMOZ(SEM和AHD的質(zhì)量為SEM-HC1和AHD-HC1去除鹽酸后換算的質(zhì)量)用甲醇溶解定容于50 mL容量瓶，4 ℃避光保存，保存期限為6個(gè)月；使用時(shí)逐級(jí)稀釋至100 ng/mL。

陽性樣品：經(jīng)原農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告—1—2006方法確證的兩份鯽(Carassiusauratus)樣本，其中一份AOZ含量為2.82 μg/kg，另一份SEM含量為2.32 μg/kg。

模擬陽性樣品：經(jīng)原農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告方法確證的陰性鯽樣本，稱取250 g樣本2份，分別添加1 μg/mL AOZ 600 μL和1 μg/mL SEM 600 μL，充分渦旋攪拌均勻，隨機(jī)從兩份樣本中取3份樣品采用原農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告方法檢測(cè)其濃度。冷凍48 h，取出后充分解凍，重復(fù)抽取兩份樣本各3份樣品采用原農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告方法檢測(cè)其濃度。最終確定AOZ為2.28 μg/kg、SEM為2.07 μg/kg。

1.3 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；色譜柱溫度：40 ℃；樣品室溫度：10 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速：0.2 mL/min；流動(dòng)相A：含0.1%甲酸的2 mmol/L醋酸銨溶液，B：甲醇；梯度洗脫條件如下：0～3 min,90%～40% A;3～5 min,40%～90% A;5～6 min,A保持90%不變。

1.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源(Electorspray ionization，ESI)，正離子模式掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(Multiple reaction monitoring，MRM)；毛細(xì)管電壓：3.0 kV；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑氣溫度：380 ℃；脫溶劑氣流量：600 L/h；錐孔氣流量：50 L/h；錐孔電壓和碰撞能量等質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)條件見表1。

表1 硝基呋喃類代謝物的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)Tab.1 Mass spectrometric detection parameters of nitrofuran metabolites

1.5 樣品處理

準(zhǔn)確稱取樣品2.00 g(精確到0.01 g)于50 mL離心管中，再加入5 mL 0.35 mol/L 鹽酸溶液和0.35 mL 0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液，渦旋振蕩50 s后，置于90 ℃水浴鍋衍生120 min。取出冷卻恢復(fù)至常溫后加入磷酸氫二鉀溶液使pH至7.0左右，加入8 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩120 s，6 000 r/min離心5 min，取上層清液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管；上清液于60 ℃氮?dú)獯蹈?。添? mL初始流動(dòng)相(復(fù)溶液)和2 mL正己烷渦旋振蕩溶解殘留物，取下層(過膜)待測(cè)。

1.6 UPLC-MS/MS方法測(cè)定

取下層溶液過濾0.22 μm尼龍微孔濾膜，按照上述實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行儀器定量檢測(cè)分析。

1.7 GICA方法判定

將所需數(shù)量的試劑條和微孔試劑恢復(fù)至常溫(20～25 ℃)并做好標(biāo)記；用微量移液器移取下層澄清待測(cè)液100 μL于微孔試劑中混合均勻，室溫下孵育2 min；將試劑條浸潤(rùn)微孔試劑混合液，室溫下反應(yīng)3 min后且在5 min之內(nèi)判定結(jié)果。

1.8 方法優(yōu)化和樣品驗(yàn)證

對(duì)于膠體金免疫層析法來說，其結(jié)果定性判定為陽性、陰性或無效，在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中無法準(zhǔn)確定量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。4種硝基呋喃類代謝物中最常見的檢出物質(zhì)為AOZ和SEM，AMOZ和AHD在日常實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中幾乎均未檢出，因此本實(shí)驗(yàn)選擇AOZ、SEM做為主要考察對(duì)象。實(shí)驗(yàn)首先將實(shí)際陽性樣品和模擬陽性樣品采用原農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告方法進(jìn)行定量分析，其次選擇不同的實(shí)驗(yàn)條件對(duì)兩種不同基質(zhì)樣品進(jìn)行比對(duì)分析，采用LC-MS/MS檢測(cè)，外標(biāo)法定量，每組進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，最后將2種方法的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以AOZ、SEM的回收率為參考指標(biāo)，進(jìn)行優(yōu)化分析。

圖1 GICA結(jié)果判定示意圖陰性(-)：T線(Test線)與C線(Control線)顏色一致或者較淺，表明樣品中的待檢測(cè)物質(zhì)低于檢測(cè)限量或者不含待檢測(cè)物質(zhì)。陽性(+)：T線比C線顏色較淺或T線不顯色，表明樣品中待檢測(cè)物質(zhì)高于檢測(cè)限量。無效：僅T線顯色或者T線、C線均不顯色，表明實(shí)驗(yàn)失敗或試劑條失效，需重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。Fig.1 Schematic diagram of GICA result judgmentNegative (-):the color of T line and C line is consistent or lighter,indicating that the substance to be detected in the sample is lower than the detection limit or does not contain the substance to be detected.Positive (+):the color of T-line is lighter than that of c-line or T-line does not show color,indicating that the substance to be detected in the sample is higher than the detection limit.Invalid:only t line develops color or T line and C line do not develop color,indicating that the experiment fails or the reagent strip is invalid,so it is necessary to conduct the experiment again.

1.8.1 樣品水解濃度的選擇

目前國標(biāo)[20-21]和原農(nóng)業(yè)部[22]的實(shí)驗(yàn)方法均是在酸性條件下進(jìn)行水解，實(shí)驗(yàn)選擇不同濃度的鹽酸比較不同樣品水解程度。研究了鹽酸濃度分別為 0.20、0.25、0.30、0.35及0.40 mol/L對(duì)AOZ和SEM回收率的影響。

1.8.2 衍生化試劑體積的選擇

不同的衍生試劑及其使用量會(huì)影響衍生反應(yīng)的速度。在未使用同位素內(nèi)標(biāo)的情況下，綜合比較參考文獻(xiàn)[15-16]，選取不同體積的0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛為衍生試劑，在酸性條件下，可對(duì)4種硝基呋喃類代謝物進(jìn)行快速衍生化。

1.8.3 衍生溫度和時(shí)間的優(yōu)化

衍生溫度和時(shí)間在衍生化反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用，實(shí)驗(yàn)考察了衍生溫度分別在40、50、60、70、80及90 ℃條件下衍生時(shí)間為30、60、90、120及180 min時(shí)不同基質(zhì)樣本的回收率。

1.8.4 檢出限的確定

從市場(chǎng)上采集的鯽、草魚(Ctenopharyngodonidella)、南美白對(duì)蝦(LitopenaeusVannamei)、三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)按照SC/T 3016—2004《水產(chǎn)品抽樣方法》的規(guī)定處理后于-18 ℃密封保存。魚肉去皮，蝦、蟹去殼，切成不大于0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小塊后混勻，充分勻漿，使用前充分解凍。

稱取鯽、草魚、南美白對(duì)蝦、三疣梭子蟹樣本2.00 g，分別添加0.25、0.50、1.00 μg/kg 4種硝基呋喃類代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)品，每組進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，樣品經(jīng)過最佳條件下的前處理后，分別對(duì)4種硝基呋喃類代謝物的試紙條進(jìn)行測(cè)定分析。

1.8.5 實(shí)際樣品分析

本實(shí)驗(yàn)采購浙江省金華市日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)20批次，浙江省舟山市鯽20批次，浙江省溫州市泥蚶(Tegillarcagranosa)20批次，江蘇省淮安市克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)20批次、海南省南美白對(duì)蝦20批次，山西省草魚20批次，浙江舟山東河市場(chǎng)大菱鲆(Scophthalmusmaximus)、海參(Stichopusjaponicus)、烏鱧(Channaargus)、鰻魚(Anguillaanguilla)各5批次共計(jì)140批次樣本進(jìn)行實(shí)際水產(chǎn)品中4種硝基呋喃類代謝物的測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品水解濃度的選擇

從圖2中可以看出，2種基質(zhì)樣品在不同鹽酸濃度條件下回收率的變化，實(shí)際陽性樣本的回收率在0.20～0.35 mol/L的鹽酸濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的升高而升高，在0.35～0.40 mol/L的濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的升高回收率出現(xiàn)較小波動(dòng)，變化差異不明顯。陰性加標(biāo)樣品的回收率在0.20～0.40 mol/L的鹽酸濃度范圍內(nèi)，AOZ和SEM的回收率均在75.00%～80.00%，且無顯著變化。通過對(duì)不同樣品的回收率分析，在0.20～0.40 mol/L的鹽酸濃度范圍內(nèi)，當(dāng)鹽酸濃度為0.35 mol/L時(shí)，AOZ、SEM的回收率最高。

圖2 不同濃度鹽酸水解對(duì)不同基質(zhì)樣品AOZ(A)和SEM(B)回收率的影響Fig.2 Effect of hydrochloric acid hydrolysis concentrations on the recoveries of different matrix samples AOZ(A)and SEM(B)

2.2 衍生化試劑體積選擇

實(shí)驗(yàn)考察了4種不同體積的2-硝基苯甲醛溶液對(duì)不同基質(zhì)樣本的影響，結(jié)果如圖3所示。隨著衍生化試劑體積的逐漸增加，陽性樣品的回收率先升高后趨于穩(wěn)定，當(dāng)衍生化試劑體積為0.35 mL時(shí)，回收率達(dá)到最高。而陰性加標(biāo)樣品的回收率在不同衍生試劑體積范圍內(nèi)，無明顯差異變化。

圖3 不同體積的衍生化試劑對(duì)不同基質(zhì)樣本AOZ(A)和SEM(B)回收率的影響Fig.3 Effect of derivatization reagents with different volumes on the recoveries of different matrix samples AOZ(A)and SEM(B)

2.3 衍生溫度和時(shí)間的優(yōu)化

不同衍生溫度和時(shí)間對(duì)模擬陽性樣本和實(shí)際陽性樣本回收率的影響結(jié)果如圖4、圖5所示。

圖4 不同衍生溫度和時(shí)間對(duì)模擬陽性樣品(A)AOZ和(B)SEM回收率的影響Fig.4 Effect of different derivatization temperature and time on the recoveries of AOZ (A)and SEM (B)in simulated positive samples

對(duì)陰性加標(biāo)樣品實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同的衍生溫度和時(shí)間條件下，回收率不隨著溫度和時(shí)間的變化而變化。

從圖5可以看出，實(shí)際陽性樣本的回收率在不同衍生溫度和時(shí)間的變化。在40～70 ℃的衍生溫度范圍內(nèi)，對(duì)于同一溫度來說，在30～180 min的衍生時(shí)間內(nèi)，回收率隨著時(shí)間的增加而增加。在80～90 ℃的衍生溫度范圍內(nèi)，對(duì)于同一溫度來說，回收率在30～120 min的衍生時(shí)間內(nèi)，隨著時(shí)間的增加而增加；回收率在120～180 min的衍生時(shí)間內(nèi)，回收率無明顯改變。通過對(duì)實(shí)際陽性樣本回收率的分析，考慮前處理操作時(shí)間，最終選擇衍生溫度和時(shí)間分別為90 ℃和120 min。

圖5 不同衍生溫度和時(shí)間對(duì)實(shí)際陽性樣品(A)AOZ和(B)SEM回收率的影響Fig.5 Effect of different derivatization temperature and time on the recoveries of AOZ (A)and SEM (B)in real positive samples

實(shí)驗(yàn)以不同基質(zhì)的樣品為研究對(duì)象，使用LC-MS/MS對(duì)反應(yīng)結(jié)果精準(zhǔn)定量，得到最佳的反應(yīng)條件：鹽酸濃度0.35 mol/L，0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛0.35 mL，水浴溫度90 ℃，時(shí)間120 min。

2.4 檢出限的確定

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，4種代謝物檢出限均為0.50 μg/kg，且重復(fù)性好，能夠滿足日?？焖俸Y查要求。

表2 不同基質(zhì)樣品的加標(biāo)驗(yàn)證Tab.2 Validation of different matrix samples n=5

2.5 實(shí)際樣品驗(yàn)證

實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示有12批次陽性樣品，其中10個(gè)呋喃西林代謝物膠體金試條顯示陽性，另外2個(gè)呋喃唑酮代謝物膠體金試紙條顯示陽性。將140批次樣本通過原農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告—1—2006方法進(jìn)行確證，具體結(jié)果如表3所示。其中12批次樣本經(jīng)儀器確證均分別含有呋喃西林代謝物、呋喃唑酮代謝物，檢測(cè)結(jié)果與快速檢測(cè)方法的結(jié)果相符合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法假陽性和假陰性率均為0，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。

表3 實(shí)際樣品驗(yàn)證的檢測(cè)結(jié)果Tab.3 Test results of real samples n=5

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過LC-MS/MS精準(zhǔn)定量的優(yōu)勢(shì)優(yōu)化GICA前處理方法，得到最佳反應(yīng)條件：鹽酸濃度0.35 mol/L，0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛0.35 mL，水浴溫度90 ℃，水浴時(shí)間120 min。本方法能夠滿足膠體金快速檢測(cè)需要，4種硝基呋喃類代謝物檢出限均為0.50 μg/kg，靈敏度高，前處理簡(jiǎn)便快捷，并且通過LC-MS/MS方法的驗(yàn)證，確保了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時(shí)利用本方法對(duì)140批次不同基質(zhì)的實(shí)際樣品進(jìn)行GICA檢測(cè)，實(shí)際結(jié)果檢測(cè)得出12批次陽性樣品，用原農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告的方法對(duì)140批次樣品進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與GICA檢測(cè)結(jié)果相符合。本方法大幅縮短前處理損耗的時(shí)間，準(zhǔn)確性高，適合于企業(yè)和檢測(cè)機(jī)構(gòu)大批量的初步篩查。