基于生物信息學(xué)方法分析LAYN在甲狀腺癌中臨床預(yù)后價值及對免疫細(xì)胞浸潤的影響

余幼林 余軍林 胡超華 沈雄山 李衛(wèi)民 盧婷 楊峰 楊青青 劉程浩

近年來，甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌腫瘤，發(fā)病率不斷升高[1-2]。其分子機(jī)制研究仍在探索。關(guān)于基因與腫瘤免疫共同影響甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展的研究備受關(guān)注[3-5]。LAYN(Layilin)是位于11號染色體上的一種蛋白質(zhì)編碼基因，在多種類型的細(xì)胞和器官中均有表達(dá)[6-8]。LAYN蛋白作為透明質(zhì)酸(HA)的表面受體，在細(xì)胞粘附和遷移等方面發(fā)揮重要作用[9]，同時協(xié)同機(jī)體抗腫瘤免疫[10]。既往研究顯示，LAYN調(diào)節(jié)結(jié)腸癌和胃癌組織中的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞、突狀細(xì)胞，和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞間的腫瘤免疫平衡，影響腫瘤進(jìn)展。LAYN在結(jié)直腸癌和肺癌組織中高表達(dá)的患者預(yù)后不佳[8，11]。本研究通過Oncomine和GEPIA數(shù)據(jù)庫研究LAYN在甲狀腺癌組織中的表達(dá)水平，與患者臨床分期和預(yù)后關(guān)系，并通過RT-PCR進(jìn)一步驗證檢測甲狀腺癌組織及癌旁組織，甲狀腺癌細(xì)胞系SW579，TPC-1及甲狀腺上皮細(xì)胞TEC中LAYN的表達(dá)水平。結(jié)合ImmucellAI及TIMER2.0工具分析LAYN基因表達(dá)與甲狀腺癌CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的浸潤豐度的關(guān)系。探索其潛在的作用機(jī)理。

1 資料與方法

1.1 Oncomine數(shù)據(jù)庫提取數(shù)據(jù)

從Ocomine(https：//www.oncomine.org/resource/)數(shù)據(jù)庫中獲取LAYN的表達(dá)數(shù)據(jù)，篩選條件：(1)gene：LAYN；(2)cancer type：thyroid cancer；(3)analysis type：cancer vs.normal analysis；(4)data type：mRNA；(5)臨界值設(shè)定條件：fold chang >2，P<0.05。

1.2 TIMER2.0工具分析LAYN表達(dá)差異及與CD+4/CD8+T細(xì)胞的相關(guān)性分析

利用TIMER2.0(http：//timer.comp-genomics.org/)工具中的TIMER和EPIC算法在線分析LAYN在不同腫瘤中的表達(dá)差異與CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞關(guān)系。篩選條件：Gene Expression：LAYN；Immune Infiltrates：CD4+T cells及CD8+T cells。

1.3 GEPIA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分期及預(yù)后相關(guān)性分析

在線分析GEPIA數(shù)據(jù)庫(http：//gepia.cancer-pku.cn/)的THCA數(shù)據(jù)集。預(yù)后篩選條件：(1)gene：LAYN；(2)methods：OS or RFS；(3)group cutoff：Quartile；(4)hazards ratio(HR)：yes；(5)95% confidence interval：yes；(6)axis units：months；(7)datasets selection：THCA。分期篩選條件：(1)gene：LAYN；(2)Use major stage：yes；(3)Datasets Selection：THCA；(4)LogScale：yes(log2(TPM +1)for log-scale)。

1.3 甲狀腺癌組織及細(xì)胞系中LAYN的表達(dá)

1.3.1 組織及細(xì)胞來源 20例甲狀腺癌組織及癌旁組織來自武漢科技大學(xué)附屬孝感醫(yī)院(孝感市中心醫(yī)院，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，且研究對象均知情同意并簽署知情同意書)。甲狀腺癌細(xì)胞系SW579、PC-1及甲狀腺上皮細(xì)胞TEC均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.3.2 試劑及內(nèi)參 DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素及鏈霉素均購自美國Gibco公司；Trizol試劑及逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑購自日本TARAKA公司；SYBR熒光定量PCR試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司。目的基因LAYN F：5′-CACAGCCTGCCAGGACCTTTA-3′，R：5′-TGCACCGGTCATCATTCCA-3′。內(nèi)參GADPH F：5-ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC-3′，R：5′-CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3′。

1.3.3 LAYN的表達(dá) 提取組織及對數(shù)期細(xì)胞總RNA，Nanodrop2000微量分光光度計測細(xì)胞濃度及純度，取適量的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。經(jīng)SYBR Green熒光染料染色，充分混勻后至RT-PCR儀上檢測。設(shè)置反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火、延伸30 s，共設(shè)置40個循環(huán)。加樣過程設(shè)置三個復(fù)孔，反應(yīng)結(jié)束后將所得的CT值取平均數(shù)作為一次結(jié)果，進(jìn)行三次獨立實驗得出三次獨立結(jié)果，將三次實驗結(jié)果取平均值用于后續(xù)計算。LAYN的相對表達(dá)水平用2-△△CT表示，△CT=CTLAYN-CTGAPDH，△△CT=△CT實驗組-△CT對照組。其中，甲狀腺癌組織及細(xì)胞系SW579、PC-1為實驗組，癌旁組織及甲狀腺上皮細(xì)胞TEC為對照組。

1.4 ImmucellAI工具分析CD4+/CD8+T細(xì)胞浸潤豐度

利用ImmucellAI工具(http：//bioinfo.life.hust.edu.cn/ImmuCellAI#!/)在線分析甲狀腺癌組織CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞浸潤豐度。篩選條件：CD4+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞。

1.5 String數(shù)據(jù)庫分析與LAYN相互作用蛋白

利用String數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/cgi/network)在線分析與LAYN相互作用的蛋白。篩選條件：(1)Protein name：LAYN；(2)Organism：Homo sapiens。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

利用Graphpad prim 7軟件進(jìn)行t檢驗，分析LAYN在甲狀腺癌組織與癌旁組織之間的差異表達(dá)。對Oncomine數(shù)據(jù)庫中符合條件(fold chang >2，P<0.05)的LAYN在甲狀腺癌組織差異表達(dá)研究進(jìn)行Meta分析。利用GEPIA數(shù)據(jù)庫中THCA數(shù)據(jù)集進(jìn)行單因素方差分析LAYN與腫瘤分期的相關(guān)性及Cox風(fēng)險比例模型預(yù)后的相關(guān)性。采用ImmucellAI數(shù)據(jù)庫中的“Wilcoxon test”在線分析甲狀腺癌及癌旁組織中CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞浸潤豐度的差異。采用TIMER2.0中的Spearman分析LAYN與甲狀腺癌組織中CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞浸潤豐度的相關(guān)性。采用String數(shù)據(jù)庫在線分析與LAYN相互作用的蛋白，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LAYN在腫瘤組織及正常組織中的差異表達(dá)

本研究從TIMER2.0數(shù)據(jù)庫在線分析了腫瘤組織和正常組織中LAYN的差異表達(dá)情況，結(jié)果表明，LAYN在15種腫瘤中存在差異表達(dá)，分別為膀胱尿路上皮癌(BLCA)、浸潤性乳腺癌(BRCA)、宮頸鱗癌和腺癌(CESC)、膽管癌(CHOL)、結(jié)腸癌(COAD)、頭頸鱗狀細(xì)胞癌(HNSC)、腎嫌色細(xì)胞癌(KICH)、腎透明細(xì)胞癌(KIRC)、肝細(xì)胞肝癌(LIHC)、肺腺癌(LUAD)、嗜鉻細(xì)胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤(PCPG)、前列腺癌(PRAD)、直腸腺癌(READ)、甲狀腺癌(THCA)、子宮內(nèi)膜癌(UCEC)(P<0.05)。與甲狀腺癌旁組織比，LAYN在甲狀腺癌組織中低表達(dá)(P<0.05)(圖1)。

圖1 所有腫瘤組織及癌旁組織中的LAYN的表達(dá)水平Figure 1 The expression of gene LAYN in cancer and adjacent tissuesNote：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001，when compared with the adjacent tissues.

2.2 LAYN在甲狀腺癌組織及細(xì)胞系中的差異表達(dá)

分析Oncomine數(shù)據(jù)庫中LAYN在甲狀腺癌組織及正常組織間差異表達(dá)，研究結(jié)果表明，相比正常甲狀腺組織，LAYN在甲狀腺腫瘤組織中低表達(dá)(P<0.001，F(xiàn)C=-2.905；P=0.035，F(xiàn)C=-2.042)(圖2a，b)。Meta分析研究結(jié)果顯示，LAYN在所有差異表達(dá)基因中，其中位數(shù)值排名為939(P=0.018)(圖3)。GEPIA數(shù)據(jù)庫中也顯示相同的結(jié)果：LAYN在甲狀腺癌組織低表達(dá)(P<0.05)(圖2c)。

RT-PCR的驗證結(jié)果表明，與甲狀腺正常組織和甲狀腺上皮細(xì)胞株TEC比較，LAYN分別在甲狀腺癌組織中及甲狀腺癌細(xì)胞系SW579，TPC-1中低表達(dá)(P<0.05)(圖2d，e)。

圖2 LAYN在甲狀腺癌組織和癌旁組織，及甲狀腺癌細(xì)胞系及甲狀腺上皮細(xì)胞表達(dá)情況Figure 2 Figure 2 Analysis of LAYN expression between thyroid cancer tissues and adjacent tissues as well as thyroid cancer cell lines and thyroid epithelial cellsNote：*P<0.05，when compared with the adjacent tissues or thyroid epithelial cells.

圖3 基于Oncomine數(shù)據(jù)庫中的Meta分析LAYN在THCA中的表達(dá)情況Figure 3 Meta analysis of LAYN expression in THCA based on Oncomine database

2.3 LAYN表達(dá)水平與臨床TNM分期的相關(guān)性

LAYN的表達(dá)水平在腫瘤不同分期中的表達(dá)存在差異，Ⅲ/Ⅳ期中LAYN的表達(dá)量低于Ⅱ/Ⅰ期(P=0.00462)(圖4)。

圖4 LAYN表達(dá)水平與腫瘤臨床TNM分期的相關(guān)性分析Figure 4 The relationship between the expression of LAYN and the clinical TNM stage in the THCA

2.4 LAYN表達(dá)水平與甲狀腺癌患者總生存期(OS)和無病生存期(DFS)的相關(guān)性

通過LAYN的TPM(Transcripts per million)將LAYN分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，以TMP的四分位值作為分界線，75%TPM作為高表達(dá)組，25%TPM作為低表達(dá)組。K-M生存曲線表明(圖5)，LAYN可能與甲狀腺癌患者OS和DFS相關(guān)，LAYN高表達(dá)組的OS明顯小于低表達(dá)組(P=0.035)，而LAYN高表達(dá)組的DFS明顯高于低表達(dá)組(P=0.016)，這些結(jié)果提示，LAYN高表達(dá)可能預(yù)示不良OS，而LAYN低表達(dá)可能預(yù)示不良DFS。

圖5 LAYN表達(dá)水平與甲狀腺癌患者總生存期(OS)和無病生存期(DFS)的關(guān)系Figure 5 The relationship between the expression of LAYN，OS and DFS of patients with THCA Note：A：OS；B：DFS.

2.5 甲狀腺癌組織及癌旁組織中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞浸潤豐度的差異

ImmucellAI數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果表明，相比甲狀腺癌旁組織，甲狀腺癌組織中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞浸潤豐度較低(P<0.001)(圖6)。

圖6 甲狀腺癌組織及癌旁組織中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的浸潤水平Figure 6 Analysis of infiltrating abundance of CD4+T cells and CD8+T cells in thyroid cancer tissues and adjacent tissuesNote：***P<0.001，when compared with the adjacent tissues.

2.6 LAYN表達(dá)水平與CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞浸潤豐度的相關(guān)性

TIMER2.0數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果表明，兩種算法中LAYN的表達(dá)水平與甲狀腺癌組織CD8+T細(xì)胞的浸潤豐度呈正相關(guān)(P<0.05)，TIMER算法中LAYN的表達(dá)水平與甲狀腺癌組織CD4+T細(xì)胞的浸潤豐度呈正相關(guān)(P<0.05)，而EPIC算法無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(圖7)。

圖7 甲狀腺癌組織LAYN基因表達(dá)水平與CD8+T細(xì)胞(圖a)和CD4+T細(xì)胞(圖b)的浸潤水平的相關(guān)性分析Figure 7 The relationship between infiltrating level of CD8+T cells(Picture a)and CD4+T cells(Picture b)and LAYN expression in thyroid cancer tissues

2.7 與LAYN相互作用的蛋白

String數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，10個LAYN相互作用的蛋白分別是PNRC1、MAGEH1、HAPLN1、SMOC1、PRSS12、HMMR、NF2、TLN2、TLN1、TLE2(圖8)。

圖8 與LAYN相互作用的蛋白網(wǎng)絡(luò)Figure 8 Protein network interacting with LAYN

3 討論

基因在甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，其與腫瘤免疫內(nèi)在關(guān)系仍在探索。LAYN(Layilin)屬C型凝集素家族成員，是一種蛋白質(zhì)編碼基因，LAYN蛋白是細(xì)胞表面透明質(zhì)酸(HA)受體，與細(xì)胞骨架元件相連接，介導(dǎo)透明質(zhì)酸誘導(dǎo)產(chǎn)生腸上皮緊密連接蛋白ZO-1[12]，在細(xì)胞粘附和遷移等方面發(fā)揮重要作用[9]。也影響了細(xì)胞免疫。有研究表明，LAYN通過下調(diào)MTA3及上調(diào)SNAI1的表達(dá)，增強(qiáng)了惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力[13]。在肺癌，肝癌組織中，LAYN能夠抑制CD8+T細(xì)胞的功能[11，14]。在結(jié)直腸癌和胃癌組織中高表達(dá)LAYN患者OS，PFS較差[8]。

在本研究中，通過Oncomine、TIMER2.0及GEPIA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)LAYN在甲狀腺癌等16種腫瘤組織中均存在差異性表達(dá)。相比正常組織，甲狀腺癌組織中LAYN低表達(dá)，與既往的研究結(jié)果相一致[15-16]。同時，利用RT-PCR技術(shù)進(jìn)一步證實了LAYN在甲狀腺癌組織及甲狀腺癌細(xì)胞系中低表達(dá)。值得關(guān)注的是，本研究比較了LAYN的表達(dá)水平與臨床分期和患者預(yù)后的關(guān)系。相比I/II期甲狀腺癌患者，Ⅲ/Ⅳ期甲狀腺癌患者腫瘤組織中LAYN低表達(dá)。而LAYN高表達(dá)的患者DFS相對較長，而OS較短，與結(jié)直腸癌在OS的研究結(jié)果一致[8]，提示LAYN的高表達(dá)可以作為甲狀腺癌患者OS差的預(yù)后分子標(biāo)志物。HA是廣泛存在于細(xì)胞外間質(zhì)中的一類糖胺多糖。在腫瘤組織中，HA由腫瘤細(xì)胞合成并積聚在腫瘤基質(zhì)中[17]。LAYN作為HA受體的配體，與HA寡糖結(jié)合后被激活參與細(xì)胞的黏附、運動和遷移行為[9，18]。在腫瘤淋巴管浸潤和轉(zhuǎn)移中常出現(xiàn)了HA寡糖的聚集[19]。LAYN也參與腫瘤細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移。腫瘤組織中過表達(dá)LAYN可促進(jìn)諸多炎癥因子分泌，如白介素-8(IL-8)、趨化因子CCL5以及可溶性細(xì)胞間粘附分子(sICAM)，這些因子參與腫瘤的免疫調(diào)節(jié)和腫瘤治療抵抗[20-23]。在本研究中，LAYN高表達(dá)的甲狀腺癌患者DFS較長，OS較短，這可能與腫瘤微環(huán)境中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的浸潤豐度相關(guān)。在甲狀腺癌組織中，CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的浸潤豐度較低，并且，CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的浸潤豐度與LAYN的表達(dá)水平呈正相關(guān)。LAYN與CD4+T細(xì)胞浸潤豐度線性相關(guān)性較低，可能與CD4+T細(xì)胞本身浸潤豐度較低，或間接作用CD4+T細(xì)胞相關(guān)，其具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步的實驗驗證。Ⅰ/Ⅱ期甲狀腺癌患者的腫瘤中高表達(dá)LAYN，可提高CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞在腫瘤中的浸潤豐度發(fā)揮抗腫瘤作用，延緩腫瘤進(jìn)展。晚期甲狀腺癌，由于抗腫瘤相關(guān)治療重塑了腫瘤微環(huán)境，一些促腫瘤生長因子和炎性因子大量釋放，包括免疫抑制性因子，導(dǎo)致腫瘤抑制性免疫細(xì)胞的減少及功能降低。HA具有親水性，引起腫瘤組織局部滲透壓改變，組織膨脹，通透性增強(qiáng)，有利于腫瘤細(xì)胞的遷移。腫瘤細(xì)胞表達(dá)LAYN可能無法逆轉(zhuǎn)免疫細(xì)胞對腫瘤的殺傷作用，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展，OS縮短。由此，在腫瘤發(fā)展的不同階段，LAYN的表達(dá)及功能存在差異，其具體的作用機(jī)制有待進(jìn)一步的探索。

在本研究中，通過STRING數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)與LAYN表達(dá)相關(guān)的10個基因，包括PNRC1、MAGEH1、HAPLN1、SMOC1、PRSS12、HMMR、NF2、TLN2、TLN1和TLE2。這些基因與LAYN可能共同影響腫瘤的生物學(xué)特性，具體的調(diào)控有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，LAYN基因在甲狀腺癌組織低表達(dá)。LAYN與腫瘤TNM分期及臨床預(yù)后相關(guān)。Ⅲ/Ⅳ期甲狀腺癌患者腫瘤組織中LAYN低表達(dá)。而LAYN高表達(dá)的患者DFS較好，而OS較差。LAYN基因的表達(dá)影響患者的預(yù)后可能通過影響免疫細(xì)胞浸潤豐度和免疫細(xì)胞功能發(fā)揮作用。LAYN基因與多種蛋白相互作用也影響腫瘤的生物學(xué)行為。