LncRNAMEG8影響結(jié)腸癌細(xì)胞惡性進(jìn)展

徐王彥 劉忠臣

摘 要：目的 探究lncRNA MEG8對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的作用，闡明其作用機(jī)制。方法 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real Time-Quantitative PCR，RT-qPCR）檢測(cè)MEG8和miR-1827表達(dá);Western blotting和CCK-8檢測(cè)蛋白表達(dá)和細(xì)胞增殖;Transwell和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞侵襲和凋亡;雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)和RNA免疫沉淀反應(yīng)（RNA Immunoprecipitation，RIP）驗(yàn)證MEG8與miR-1827結(jié)合。結(jié)果 MEG8通過(guò)結(jié)合miR-1827負(fù)調(diào)控miR-1827表達(dá)。與人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞相比，MEG8在結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，而miR-1827表達(dá)上調(diào)。過(guò)表達(dá)MEG8或干擾miR-1827抑制HT29細(xì)胞增殖和侵襲，促進(jìn)凋亡。沉默miR-1827逆轉(zhuǎn)干擾MEG8誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和侵襲上升，凋亡和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）/ c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）通路活性下降。結(jié)論 LncRNA MEG8通過(guò)下調(diào)miR-1827，促進(jìn)ERK/JNK通路活性，阻礙結(jié)腸癌細(xì)胞HT29增殖和侵襲，促進(jìn)凋亡。

關(guān)鍵詞：結(jié)腸癌;lncRNA MEG8;miR-1827;增殖;凋亡;侵襲

Abstract：Objective To explore the role of lncRNA MEG8 in the proliferation， invasion and apoptosis of colon cancer cells and the possible molecular mechanisms involved. Methods Real Time-Quantitative PCR （RT-qPCR）was used to detect the expression of MEG8 and miR-1827. Western blotting and CCK-8 assays were used to detect protein levels and cell proliferation. Transwell assay and flow cytometry were performed to measure cell invasion and apoptosis. Dual luciferase reporter gene and RNA Immunoprecipitation （RIP）assays were used to verify the relationship between MEG8 and miR-1827. Results MEG8 negatively regulated miR-1827 expression by binding with miR-1827. MEG8 was down-regulated in colon cancer cells， while miR-1827 was up-regulated， compared with their expression in normal human colon epithelial cells. The overexpression of MEG8 or interference to miR-1827 inhibited HT29 cells proliferation and invasion and promoted their apoptosis，while the silence of miR-1827 would reverse such MEG8-induced effects and decrease the pathway activity of ERK （extracellular regulated protein kinases）/JNK （c-Jun N-terminal kinase）. Conclusion LncRNA MEG8 will increase the activity of ERK/JNK pathway with miR-1827 down-regulaed， thereby inhibiting the proliferation and invasion of the HT29 colon cancer cells， and promoting their apoptosis.

Key words：colon cancer; LncRNA MEG8; miR-1827; proliferation; apoptosis; invasion

結(jié)直腸癌是世界上第三種最常見的癌癥，占人類癌癥相關(guān)死亡人數(shù)的1/10。由于其發(fā)展迅速且隱蔽，每年新增結(jié)腸癌人數(shù)超過(guò)12萬(wàn)，死亡率超過(guò)33%[1-2]。盡管診斷和治療策略不斷進(jìn)步，但結(jié)腸癌患者的預(yù)后在過(guò)去十年間未發(fā)生顯著變化[3]。目前只有少數(shù)生物標(biāo)記物可用于結(jié)腸癌的預(yù)防，因此，鑒定早期診斷結(jié)腸癌的分子標(biāo)志物具有重要意義。

長(zhǎng)非編碼RNA（LncRNA）是長(zhǎng)度超過(guò)200nt但沒有蛋白質(zhì)編碼能力的RNA分子。LncRNA可以作為腫瘤中的癌基因或抑癌基因，參與腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移、自噬和凋亡等調(diào)控[4]5 752。多種lncRNA異常與結(jié)腸癌進(jìn)展密切相關(guān)。據(jù)報(bào)道，與正常結(jié)腸組織相比，母系表達(dá)基因8（matemally expressed gene 8，MEG8）在結(jié)腸癌組織中表達(dá)下調(diào)，但其參與結(jié)腸癌發(fā)病的潛在機(jī)制尚不清楚[5]。MicroRNA（miRNAs）是一類約22個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，其失調(diào)與多種生物學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞增殖，分化和凋亡相關(guān)。前人研究表明，miR-1827在結(jié)腸癌組織中上調(diào)[6]5 107，但其對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡的作用還有待探究。

本研究主要探討lncRNA MEG8對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響，并闡明其涉及的主要分子機(jī)制。

1 材料方法

（1）細(xì)胞與試劑 NCM460、HT29、CACO2、SW480、HCT116、HEK293T細(xì)胞均購(gòu)自上海生命科學(xué)研究院;Magna RIP試劑盒購(gòu)自美國(guó)Millipore公司;NC siRNA、MEG8 siRNA、miR-1827mimic、NC mimic、miR-1827 inhibitor、NC inhibitor均由上海吉瑪公司合成;細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自中國(guó)上海聯(lián)科生物公司;CCK-8試劑盒購(gòu)自美國(guó)Abcam公司;TRIzol試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄和RT-qPCR試劑盒購(gòu)自中國(guó)大連Takara公司; 總的和磷酸化的細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（t-ERK1/2 和p-ERK1/2）、 總的和磷酸化的c-Jun氨基末端激酶（t-JNK和p-JNK）抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司;流式細(xì)胞儀和酶標(biāo)儀購(gòu)自德國(guó)Thermo Fisher和美國(guó)Bio-Rad公司;凝膠成像儀和CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)CARESTREAM Gel Logic和德國(guó)Thermo scientific公司。

（2）細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將NCM460、HT29、CACO2、SW480、HCT116、HEK293T細(xì)胞置于含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，并于37℃，含5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞接種于6孔板，待密度達(dá)到60%，使用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑按照說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

（3）RNA免疫沉淀反應(yīng)（RNA Immunoprecipitation，RIP）將HT29細(xì)胞裂解液與包含磁珠（磁珠與anti-Ago2或IgG的抗體偶聯(lián)）的RIP緩沖液在4℃下孵育過(guò)夜。用蛋白酶K消化免疫沉淀物以純化沉淀的RNA，再用qPCR分析免疫沉淀的RNA。

（4）雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn) 使用StarBase v2.0預(yù)測(cè)MEG8與miR-1827的結(jié)合位點(diǎn)。使用psiCHECK-2載體構(gòu)建野生型和突變型psiCHECK-2-MEG8（MEG8-Wt、MEG8-Mut）載體。將HEK293T細(xì)胞接種于24孔板，并將MEG8-Wt（或MEG8-Mut）分別與miR-1827mimic或NC mimic共轉(zhuǎn)染。24h后，按照說(shuō)明書的操作檢測(cè)熒光素酶活性。

（5）細(xì)胞凋亡 使用Annexin V-FITC /碘化丙啶（PI）凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行凋亡分析。簡(jiǎn)言之，細(xì)胞處理完成后收集細(xì)胞，用PBS洗滌并重懸細(xì)胞，隨后依次添加5μLAnnexin V-FITC和5μLPI。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

（6）細(xì)胞增殖 將處理后的細(xì)胞接種于96孔板，并分別培養(yǎng)24、48或72h。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)添加10μL CCK-8溶液，并將細(xì)胞繼續(xù)孵育2h。使用酶標(biāo)儀測(cè)量450nm處的吸光度值。

（7）細(xì)胞侵襲 將人工基底膜涂于Transwell室底膜上腔表面，并置于37℃放置30min。將細(xì)胞（2×105個(gè)）懸浮于500μL無(wú)血清培養(yǎng)基中，并添加到上腔室中。在下腔室中添加含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。溫育36h后，將下腔室中的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定并用結(jié)晶紫染色。選擇5個(gè)隨機(jī)區(qū)域計(jì)算侵襲細(xì)胞數(shù)量并計(jì)算平均值。

（8）Western blotting 使用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，使用BCA試劑盒測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。通過(guò)10%SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)樣品，然后電轉(zhuǎn)至PVDF膜。將膜在室溫用5%脫脂奶粉封閉

2h后，與稀釋后的一抗在4℃孵育過(guò)夜。隨后將膜與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗在室溫孵育1h。在ChemiDoc XRS成像系統(tǒng)中檢測(cè)蛋白質(zhì)條帶。使用Image J軟件進(jìn)行條帶灰度分析。

（9）實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real Time-Quantitative PCR，RT-qPCR）采用TRIzol提取細(xì)胞總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用SYBR PrimeScript RT-PCR試劑盒檢測(cè)mRNA表達(dá)。反應(yīng)條件設(shè)計(jì)如下：95℃，3min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，94℃，15s;55℃，25s;72℃，30s。mRNA相對(duì)表達(dá)通過(guò)2-ΔΔCT方法計(jì)算。

（10）統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。測(cè)量的數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，組間數(shù)據(jù)比較采用學(xué)生t檢驗(yàn)和雙向方差分析。P<0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

（1）過(guò)表達(dá)MEG8抑制HT29細(xì)胞惡性進(jìn)展。如圖1所示。與人正常腸上皮細(xì)胞（NCM460）相比，結(jié)腸癌細(xì)胞系（HT29，CACO2，SW480，HCT116）中MEG8表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05），如圖1（a）所示。與轉(zhuǎn)染Vector相比，在HT29細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Ad-MEG8后，MEG8的表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.01），如圖1（b）所示，顯示過(guò)表達(dá)效率較高。與Vector組相比，過(guò)表達(dá)MEG8后細(xì)胞增殖和侵襲顯著下降（P<0.05）， 如圖1（c）～（e）所示，而細(xì)胞凋亡顯著上升（P<0.05）， 如圖1（f）～（g）所示。

（2）MEG8與miR-1827結(jié)合并下調(diào)其表達(dá)如圖2所示。 與轉(zhuǎn)染NC mimic相比，轉(zhuǎn)染miR- 1827mimic后，MEG8-Wt報(bào)告載體熒光素酶活性顯著下降（P<0.05），如圖1（b）所示，而MEG8-Mut報(bào)告載體熒光素酶活性無(wú)顯著變化。RIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，分別過(guò)表達(dá)miR-1827和MEG8后，與IgG抗體組相比，Ago2抗體組的MEG8和miR-1827顯著富集（P<0.05），如圖1（c）所示。與轉(zhuǎn)染Vector相比，在HT29細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Ad-MEG8顯著抑制miR-1827表達(dá)（P<0.05），如圖1（d）所示。而與轉(zhuǎn)染NC siRNA相比，轉(zhuǎn)染MEG8 siRNA顯著促進(jìn)miR-1827表達(dá)（P<0.05），如圖1（d）所示。

（3）干擾miR-1827抑制HT29細(xì)胞惡性進(jìn)展如圖3所示。與人正常腸上皮細(xì)胞（NCM460）相比，結(jié)腸癌細(xì)胞系（HT29，CACO2，SW480，HCT116）中miR-1827表達(dá)顯著上調(diào)（P<0.05），如圖3（a）所示。與轉(zhuǎn)染NC inhibitor相比，在HT29細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-1827 inhibitor顯著抑制miR-1827表達(dá)（P<0.05），如圖3（b）所示，顯示干擾效率較高。與NC inhibitor組相比，干擾miR-1827組的細(xì)胞增殖和侵襲顯著下降（P<0.05），如圖3（c）～（e）所示，而細(xì)胞凋亡顯著上升（P<0.05），如圖3（f）～（g）所示。

（4）MEG8通過(guò)抑制miR-1827調(diào)控HT29細(xì)胞進(jìn)展如圖4所示。與轉(zhuǎn)染NC siRNA相比，在HT29細(xì)胞中轉(zhuǎn)染MEG8 siRNA顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲（P<0.05），如圖4（a）～（c）所示，抑制凋亡（P<0.05），如圖4（d）～（e）所示。而與轉(zhuǎn)染MEG8 siRNA+NC inhibitor相比，共轉(zhuǎn)染MEG8 siRNA和miR-1827 inhibitor，細(xì)胞增殖和侵襲顯著下降（P<0.05），如圖4（a）～（c）所示，而凋亡顯著上升（P<0.05），如圖4（d）～（e）所示。

（5）MEG8通過(guò)抑制miR-1827調(diào)節(jié)ERK/JNK通路活性如圖5所示。與轉(zhuǎn)染NC siRNA相比，在HT29細(xì)胞中轉(zhuǎn)染MEG8 siRNA顯著抑制p-ERK1/2和p-JNK的蛋白質(zhì)表達(dá)（P<0.05），如圖5（a）～（c）所示，而t-ERK1/2和t-JNK的蛋白質(zhì)表達(dá)不變。與轉(zhuǎn)染MEG8 siRNA+NC inhibitor相比，共轉(zhuǎn)染MEG8 siRNA和miR1827 inhibitor，p-ERK1/2和p-JNK蛋白質(zhì)表達(dá)顯著上升（P<0.05），如圖5（a）～（c）所示，而t-ERK1/2和t-JNK的蛋白質(zhì)表達(dá)不變。

3 討論

結(jié)腸癌是一種常見的消化系統(tǒng)癌癥，在全球與癌癥相關(guān)死亡中排名第四[7]。癌細(xì)胞的無(wú)限增殖和高轉(zhuǎn)移特性導(dǎo)致結(jié)腸癌的高死亡率。在2014a和2015a，結(jié)腸癌導(dǎo)致約70萬(wàn)人死亡[8]2 007。結(jié)腸癌的早期治療結(jié)果通常令人滿意，并且大于95%的患者在積極治療后生存率超過(guò)5a[8]2 007。然而，由于其隱蔽和發(fā)展迅速的特征，大多數(shù)患者在首次診斷時(shí)就處于晚期[4]5 752，導(dǎo)致多數(shù)患者生存結(jié)果較差。結(jié)腸癌發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜過(guò)程，包括遺傳和表觀遺傳學(xué)變化。因此，闡明腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制，為早期診斷，預(yù)后和治療評(píng)估尋找新的分子標(biāo)志物意義重大[9]。

LncRNA通過(guò)多種機(jī)制介導(dǎo)基因表達(dá)，包括lncRNA-miRNA相互作用，lncRNA-蛋白質(zhì)相互作用和lncRNA-mRNA相互作用。前人研究表明，lncRNAs參與各種生物過(guò)程調(diào)控，包括細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、癌變和癌癥進(jìn)展[10]。多種lncRNA失調(diào)與結(jié)腸癌進(jìn)展相關(guān)。LncRNA BCAR4通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)途徑促進(jìn)結(jié)腸癌腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[11]。LncRNA HOTAIR在結(jié)腸癌中表達(dá)上調(diào)，與結(jié)腸癌遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后有關(guān)[4]5 754。LncRNA MALAT1通過(guò)海綿miR-129-5p調(diào)控HMGB1促進(jìn)結(jié)腸癌發(fā)展[12]。本研究表明，與人正常腸上皮細(xì)胞相比，MEG8在結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。過(guò)表達(dá)MEG8顯著抑制結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29增殖和侵襲，促進(jìn)凋亡，顯示MEG8在結(jié)腸癌中作為腫瘤抑制基因，可能作為結(jié)腸癌的預(yù)測(cè)指標(biāo)。研究還發(fā)現(xiàn)，MEG8與miR-1827直接結(jié)合，負(fù)調(diào)控miR-1827的表達(dá)，表明MEG8可能通過(guò)抑制miR-1827發(fā)揮腫瘤抑制作用。

MiRNA通過(guò)與mRNAs的3非翻譯區(qū)結(jié)合，在基因表達(dá)中發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用，導(dǎo)致翻譯抑制或基因沉默。MiRNA基因只代表人類基因組一小部分，但它們調(diào)控幾乎1/3的人類基因。研究表明，miRNAs與多種生理病理過(guò)程相關(guān)， 包括細(xì)胞分化、 凋亡、 增殖、 胰島素分泌、 膽固醇合成和腫瘤生成。MiRNAs與結(jié)腸癌進(jìn)展緊密相關(guān)。MiR-144通過(guò)下調(diào)SMAD4抑制結(jié)腸癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[13];MiR-192在結(jié)腸癌中發(fā)揮抑癌作用，辛伐他汀通過(guò)激活miR-192抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)[14];MiR-215抑制低氧誘導(dǎo)的結(jié)腸癌干細(xì)胞活性[15]。文獻(xiàn)[16]報(bào)道，MiR-1827通過(guò)靶向MYC在肺腺癌中發(fā)揮抑癌作用。文獻(xiàn)[6]5 108報(bào)道，miR-1827通過(guò)調(diào)控Wnt信號(hào)通路，在結(jié)腸癌中發(fā)揮致癌作用。本研究結(jié)果顯示，與人正常腸上皮細(xì)胞相比，miR-1827在結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，與前人研究結(jié)果吻合。在HT29細(xì)胞中干擾miR-1827，細(xì)胞增殖和侵襲下降，而凋亡上升。此外，轉(zhuǎn)染miR-1827 inhibitor逆轉(zhuǎn)沉默MEG8誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和侵襲上調(diào)，凋亡下降。

越來(lái)越多證據(jù)表明，ERK/JNK信號(hào)通路在結(jié)腸癌細(xì)胞進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。據(jù)報(bào)道，ERK-JNK信號(hào)通路上調(diào)通過(guò)CC趨化因子配體7和CC趨化因子受體3之間的串?dāng)_促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。衣霉素通過(guò)下調(diào)ERK-JNK信號(hào)通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[17]。Mahalingam等人證明，在結(jié)腸癌中，舒尼替尼通過(guò)增強(qiáng)JNK活性，降低凋亡抑制蛋白質(zhì)水平，促進(jìn)TRAIL介導(dǎo)的凋亡[18]。本研究數(shù)據(jù)顯示，干擾MEG8顯著抑制HT29細(xì)胞中p-ERK1/2、p-JNK蛋白質(zhì)水平。而干擾miR-1827反轉(zhuǎn)MEG8對(duì)ERK/JNK通路的作用，表明MEG8和miR-1827對(duì)HT29細(xì)胞增殖和凋亡的影響很可能通過(guò)調(diào)控ERK/JNK通路實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，與正常腸上皮細(xì)胞相比，MEG8在結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá) MEG8抑制HT29細(xì)胞增殖和侵襲，促進(jìn)凋亡。機(jī)制研究顯示，MEG8可能通過(guò)負(fù)調(diào)控miR-1827，激活ERK/JNK通路，進(jìn)而調(diào)控HT29結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡。此項(xiàng)研究，一定程度上補(bǔ)充了影響結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的免疫學(xué)理論，也為結(jié)腸癌免疫治療方面提供一條潛在的方法。

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（責(zé)任編輯：丁 寒）