三斑海馬骨骼染色方法改進(jìn)及骨骼結(jié)構(gòu)特點(diǎn)研究

周勝杰 胡靜 楊其彬 楊蕊 于剛 馬振華

摘要：【目的】明確三斑海馬（Hippocampus trimaculatus）的骨骼特點(diǎn)，為三斑海馬的種類鑒定提供技術(shù)支持，同時(shí)為海馬的基礎(chǔ)生物學(xué)積累數(shù)據(jù)?！痉椒ā吭谕该骰趋廊旧ǖ幕A(chǔ)上，進(jìn)一步改進(jìn)三斑海馬骨骼染色方法，并對三斑海馬的骨骼特點(diǎn)進(jìn)行細(xì)節(jié)性描述。【結(jié)果】相對于傳統(tǒng)的透明化骨骼染色法，改進(jìn)后的透明化骨骼染色法在再脫色與透明環(huán)節(jié)中，通過添加少量H2O2有效去除組織中殘留的染色劑，同時(shí)添加少量2% KOH促使組織更加透明，且在裝瓶步驟中正向直立放置三斑海馬骨骼標(biāo)本。三斑海馬的背鰭鰭條數(shù)為19～21條，胸鰭鰭條數(shù)為18～19條;其頭部有獨(dú)特結(jié)構(gòu)：有多個(gè)凸出的棘，頜骨部分構(gòu)成管狀結(jié)構(gòu)，鰓蓋后緣無鰓孔，鰓孔開口在鰓蓋后緣正上方頭頂位置;三斑海馬自頭部以下至尾端體表均由菱形骨片構(gòu)成的骨環(huán)包被，胸腹部共有12節(jié)骨環(huán)，除第11和12節(jié)骨環(huán)外，每節(jié)骨環(huán)均由7片不規(guī)則的菱形骨骼構(gòu)成，骨環(huán)內(nèi)部及骨環(huán)間存在滑道結(jié)構(gòu)，為運(yùn)動和攝食提供立體空間;尾部共有40～41節(jié)骨環(huán)，每節(jié)骨環(huán)均由4片菱形骨片構(gòu)成，骨環(huán)向尾末端逐漸縮小，骨環(huán)間也存在滑道結(jié)構(gòu)，具攀附功能?！窘Y(jié)論】改進(jìn)后的透明化骨骼染色法更適合于三斑海馬骨骼染色，操作便捷，骨骼標(biāo)本質(zhì)量高。三斑海馬具有獨(dú)特的頭部骨骼結(jié)構(gòu)與攝食方式，自頭部以下全身包被骨骼，外骨骼主要由菱形骨片構(gòu)成，但構(gòu)成不同部位骨環(huán)的菱形骨片數(shù)量不同;骨環(huán)內(nèi)部及骨環(huán)間存在滑道結(jié)構(gòu)，為三斑海馬的運(yùn)動和攝食提供立體空間，因此可通過胸腹部膨脹圍度判斷三斑海馬的營養(yǎng)狀況及雌性三斑海馬的性腺發(fā)育情況。

關(guān)鍵詞： 三斑海馬;骨骼結(jié)構(gòu);骨環(huán);菱形骨片;透明化骨骼染色法

中圖分類號： S965.399? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）05-1387-08

Abstract：【Objective】Explored the detailed characteristics of Hippocampus trimaculatus skeletons， provided technical support for the type identification of H. trimaculatus， and accumulated data for the basic biology of H. trimaculatus. 【Method】On the basis of the transparent skeleton dyeing method， a special staining method for H. trimaculatus was improved to describe its skeleton characteristics， and the skeleton characteristics of H. trimaculatus were described in detail.【Result】Compared with the traditional transparent skeleton staining method， at decolorization and transparency procedures， the improved transparent skeleton staining method effectively removed the tissue residue with the addition of a small amount of H2O2， and a small amount of 2% KOH to make the tissue more transparent， and the placement of H. trimaculatus skeleton samples upright in the bottling step. The number of dorsal fins in H. trimaculatus was 19-21， and the number of pectoral fins was 18-19. The head of H. trimaculatus had its unique structure： many salient apines， the jaw ske-leton formed a tubular structure， and there was no gill hole at the trailing edge of the gill cover. The opening of the gill hole was directly above the head of the gill. H. trimaculatus was covered by a ring of diamond-shaped skeletons from head to tail body surface to provide protection and support for it. There were 12 bone rings in the chest and abdomen. Except for the 11th and 12th section， each ring of the thorax and abdomen is composed of 7 irregular diamond-shaped skeletons. There was a unique sliding structure inside and between the skeleton rings， which provided a three-dimensional space for movement and feeding. Each ring of the tail skeleton was composed of 4 diamond-shaped skeletons. There were 40-41 bone rings in the tail， each ring is composed of 4 diamond-shaped skeletons， and the skeleton pieces shrink toward the tail gra-dually form a square skeleton ring and there was a sliding structure between the skeleton rings to provide activity space for the climbing action. 【Conclusion】The improved transparent skeleton staining method is more suitable for H. trimaculatus skeleton dyeing， with convenient operation and high quality of skeleton specimens. H. trimaculatus has a unique head skeleton structure and feeding mode. The whole body below the head is surrounded by the skeleton， and the exoskeleton is mainly composed of rhomboid skeleton. However， the number of rhomboid skeletons constitute different rings in diffe-rent parts; there is a sliding structure inside and between the bone ring to provide stereoscopic space for the movement and feeding of H. trimaculatus， so the nutrition status of H. trimaculatus and the gonadal development of the female H. trima-culatus can be determined through the chest and abdominal expansion circumference.

Key words： Hippocampus trimaculatus; skeleton structure; skeleton ring; diamond-shaped skeleton; transparent skeleton staining method

Foundation item： Hainan Natural Science Foundation（319QN340）; Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund of Chinese Academy of Fishery Sciences（2020TD55）; Guangxi Innovation Driven Development Special Project（Guike AA18242031）

0 引言

【研究意義】三斑海馬（Hippocampus trimaculatus）俗名龍落子，也稱水馬或馬頭魚，隸屬于硬骨魚綱（Osteichthyes）海龍目（Syngnathiformes）海龍科（Syngnathidae），因其第1、4和7節(jié)各具一塊黑斑而得名，是珍稀的海洋藥源性和觀賞性動物。海馬具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在我國素有“南方人參”之稱（林強(qiáng)等，2007）。三斑海馬主要分布于中國、印度、新加坡及印度尼西亞等國家的沿海地區(qū)。在我國東海和南海分布較廣，福建、廣東和海南的沿海地區(qū)均有分布（駱大鵬等，2016）。骨骼研究可為魚類的生長發(fā)育、營養(yǎng)狀況及生理構(gòu)成等提供有利佐證，從而推導(dǎo)出其發(fā)育狀況及不同物種間的差異，對揭示魚類的早期形態(tài)、結(jié)構(gòu)、攝食和運(yùn)動具有重要參考價(jià)值（周勝杰等，2018b;曹曉穎等，2019）。因此，加強(qiáng)魚類骨骼研究不僅能豐富其生物學(xué)資料，還能為制定科學(xué)養(yǎng)殖方案提供重要的科學(xué)依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】骨骼標(biāo)本的制作通常采用蒸煮剔骨法和透明化骨骼染色法，其中透明骨骼標(biāo)本因具有直觀、真實(shí)的特點(diǎn)，在動物學(xué)、生物學(xué)及影像學(xué)等專業(yè)領(lǐng)域已有廣泛應(yīng)用，同時(shí)為骨骼發(fā)育研究提供了直接而有效的形態(tài)學(xué)觀察方法（劉萬祥等，2002）。至今，有關(guān)魚類骨骼的研究已普遍開展，涉及種類有黃尾鰤（Seriola lalandi）（Andrades et al.，1996）、歐洲鱸魚（Dicentrarchus labrax）（Abdel et al.，2004;Georgakopoulou et al.，2007）、紅羅非魚（Oreochromis niloticus×O. mossambicus）（楊凡，2007）、齊口裂腹魚（Schizothorax prenanti）（楊世勇等，2012）、卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）（Prestinicola et al.，2013;鄭攀龍等，2014）、紅鰭笛鯛（Lutjanus erythopterus）（程大川等，2017）、鞍帶石斑魚（Epinephelus lanceolatus）（呂雪嬌等，2018）、尖吻鱸（Lates calcarifer）（周勝杰等，2018a，2018b）及西伯利亞鱘（Acipenser baeri）（劉釗等，2019）等。鑒于海馬固有的特殊營養(yǎng)價(jià)值及藥用價(jià)值，針對海馬種苗培育（鄧鋼等，2005;駱大鵬等，2016）、養(yǎng)殖技術(shù)（牟金婷等，2017）、藥用價(jià)值（吳靖娜等，2017;于曼曼，2018）、病害防治（楊求華等，2017）及營養(yǎng)成分（王清蓉等，2018;閆珍珍等，2019）的研究已有較多報(bào)道，有關(guān)三斑海馬的研究主要集中在生理生化、成分提取純化、開發(fā)利用及人工繁育技術(shù)等方面（李蓉等，2009;袁根軍和陳再忠，2011;姜展志等，2013;陳莉萍等，2016;駱大鵬等，2016），但對于海馬骨骼方面的研究相對較匱乏。梁亮堂（2019）通過透明化骨骼染色法成功鑒定出海馬種類，但制作的海馬標(biāo)本透明度不高，骨骼細(xì)節(jié)模糊，說明海馬透明化骨骼標(biāo)本制作方法仍然有待進(jìn)一步改進(jìn)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】為了適應(yīng)生存環(huán)境，海馬已進(jìn)化出獨(dú)特的骨骼構(gòu)造，不同海馬種類的骨骼構(gòu)造也有所差異（郭文場等，2016），因此急需探索出一種簡單有效的方法進(jìn)行種類鑒別，但至今鮮見針對三斑海馬骨骼染色方法及相關(guān)骨骼細(xì)節(jié)性描述的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】在透明化骨骼染色法的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步改進(jìn)三斑海馬骨骼染色方法，并對三斑海馬的骨骼特點(diǎn)進(jìn)行細(xì)節(jié)性描述，為三斑海馬的種類鑒定提供技術(shù)支持，同時(shí)為海馬的基礎(chǔ)生物學(xué)積累數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

三斑海馬采自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所熱帶水產(chǎn)研究開發(fā)中心基地的育苗與養(yǎng)殖車間。三斑海馬樣品用5%丁香酚麻醉后直接置于45%中性福爾馬林中固定，確保體型不變形，常溫保存;也可采用死亡的海馬尸體進(jìn)行制作。茜素紅（Alizarin redmonohydrate）購自天津市大茂化學(xué)試劑廠，無水乙醇、硼砂及氫氧化鉀等試驗(yàn)試劑購自廣州普博欣生物科技有限責(zé)任公司。脫水液：95%乙醇（無水乙醇∶去離子水=95∶5）;漂洗液：1%氫氧化鉀（15 mL）和3%雙氧水（85 mL）;茜素紅染色液：將0.06 g茜素紅粉末溶于100 mL的0.8%氫氧化鉀溶液中。

1. 2 試驗(yàn)方法

參照劉萬祥等（2002）、李文等（2008）、梁亮堂（2019）的方法，三斑海馬骨骼染色的主要步驟包括：（1）固定與脫水;（2）脫脂;（3）復(fù)水;（4）染色;（5）脫浮色;（6）脫色;（7）再脫色與透明;（8）去氣泡;（9）梯度透明;（10）裝瓶。

2 結(jié)果與分析

2. 1 三斑海馬骨骼染色方法的改進(jìn)效果

三斑海馬具有外骨骼，但其表皮與外骨骼連接緊密，無法在固定與脫水時(shí)去除表皮或表皮顏色，因此需在脫色環(huán)節(jié)去除;同時(shí)增加脫脂環(huán)節(jié)，減少標(biāo)本中黃色脂肪對標(biāo)本透明度的影響。在再脫色與透明環(huán)節(jié)中，通過添加少量H2O2有效去除組織中殘留的染色劑，同時(shí)添加少量2% KOH促使組織更加透明。在最后的裝瓶步驟中，可正向直立放置三斑海馬骨骼標(biāo)本（表1）。透明骨骼染色標(biāo)本制作完成后，骨架堅(jiān)硬結(jié)實(shí)不易散架，骨骼清晰，色澤鮮艷，透明度高，便于觀察三斑海馬骨骼形態(tài)（圖1）。

2. 2 三斑海馬骨骼詳細(xì)描述

2. 2. 1 三斑海馬的鰭條數(shù)量 海馬鰭條數(shù)量是鑒別海馬種類的重要依據(jù)之一。通過骨骼染色可知，三斑海馬的背鰭鰭條數(shù)量為19～21條，胸鰭鰭條數(shù)量為18～19條，臀鰭鰭條數(shù)量為4～5條（成年雄性三斑海馬無臀鰭），與已報(bào)道的刺海馬胸鰭鰭條數(shù)量相似，因此無法通過鰭條數(shù)量區(qū)分這2種海馬。三斑海馬背鰭和胸鰭的鰭條數(shù)量與其他海馬存在明顯差異（表2），可有效區(qū)分開來，為海馬種類的骨骼鑒定法提供了有利依據(jù)。

2. 2. 2 三斑海馬的頭部骨骼 三斑海馬頭部骨骼（圖2）與通常意義下的魚類頭部骨骼存在明顯差異，其下頜骨與上頜骨向前延長，吻長占整個(gè)頭長的50%左右，吻前端向上呈45°開口，屬上口位，通常狀態(tài)下吻端略低于眼睛，便于捕食;鰓被鰓蓋包被，胸鰭基部緊貼著鰓蓋后緣，鰓蓋后緣無開口，但在頭頂腦后左右兩側(cè)各有1個(gè)出水孔，呼吸時(shí)海水由此孔噴出[出水孔類似于海洋哺乳動物（鯨魚）可向上噴水]。

2. 2. 3 三斑海馬的胸腹部骨骼 三斑海馬具有外骨骼和脊柱，其頭部以下至背鰭末端為胸腹部，內(nèi)臟位于此區(qū)域內(nèi)（圖3）。構(gòu)成胸腹部輪廓的為菱形或類菱形骨骼（片），每片菱形骨骼均有2條對角線骨棱，且2條骨棱相互垂直向外突起，骨棱交點(diǎn)處具有1個(gè)向外凸出的棘，不同部位的棘長有所差異。菱形骨片相互連接構(gòu)成骨環(huán)。胸腹部共有12節(jié)骨環(huán)，自頸部向下第1～10節(jié)骨環(huán)均由7片不規(guī)則的菱形骨片構(gòu)成，骨片大小隨身體結(jié)構(gòu)變化而改變;第11節(jié)骨環(huán)有8片菱形骨片，臀鰭固定于此處（性成熟雄性三斑海馬腹部有育兒囊，無臀鰭）;第12節(jié)骨環(huán)有6片菱形骨片，且腹面2片菱形骨片未連接在一起，形成泄殖孔。三斑海馬背鰭固定于第10、11和12節(jié)骨環(huán)背面的2片菱形骨片之間。第1、4、7和11節(jié)骨環(huán)的棘較長，明顯長于相鄰的骨環(huán)。相鄰骨環(huán)間由可滑動的滑道結(jié)構(gòu)相連，上一骨環(huán)菱形骨片下角延長伸入下一骨環(huán)菱形骨片下方，為三斑海馬運(yùn)動或攝食提供活動空間。每節(jié)骨環(huán)中，菱形骨片朝向腹面的角均向腹面延長至下一菱形骨片下方（背部2片菱形骨片及正腹部菱形骨片除外），構(gòu)成可滑動的結(jié)合點(diǎn)，為三斑海馬進(jìn)食或發(fā)育提供伸縮空間。泄殖孔位于第10和11節(jié)骨環(huán)間的腹面，5片菱形骨片圍繞著泄殖孔，是三斑海馬極少無骨骼覆蓋的區(qū)域。

2. 2. 4 三斑海馬的尾部骨骼 三斑海馬尾部共有40～41節(jié)骨環(huán)（圖4），每節(jié)骨環(huán)均由4片菱形骨片構(gòu)成，骨環(huán)向尾末端逐漸縮小，最終凝聚為一點(diǎn)。第16、21、25、29和33節(jié)骨環(huán)菱形骨片上的棘凸出較多，明顯高于相鄰的骨環(huán)。相鄰骨環(huán)間由可滑動的滑道結(jié)構(gòu)相連，上一骨環(huán)菱形骨片下角延長伸入下一骨環(huán)菱形骨片下方，為三斑海馬提供尾部彎曲及攀附功能。

3 討論

三斑海馬體色可隨環(huán)境的變化而改變，其體色最主要的特點(diǎn)是體側(cè)背方第1、4、7節(jié)各具一塊黑斑，但在不同時(shí)間或地點(diǎn)這3塊黑斑可能會消失。由于海馬體色可變，且不同海馬種類間外觀近似，給海馬種類的直觀鑒定帶來很大困擾，現(xiàn)階段海馬種類較準(zhǔn)確的鑒定方法為分子鑒定（董世雄等，2017），但分子鑒定效率低、成本高，不適宜作為廣譜性鑒定方法。目前常用的魚類骨骼觀察及描述方法有阿利新藍(lán)—茜素紅雙染色法（Darias et al.，2010a，2010b;馬慧等，2011;Cobcroft and Battaglene，2013）、micro CT掃描技術(shù)（張寧等，2012）及透明化骨骼染色法（梁亮堂，2019）等。其中，透明化骨骼染色法具有可直接觀察標(biāo)本空間結(jié)構(gòu)、成本低、操作簡單及不易褪色等優(yōu)點(diǎn)，已成為最常用的魚類骨骼染色方法。三斑海馬的骨骼構(gòu)造與傳統(tǒng)魚類存在明顯差異，采用傳統(tǒng)的透明化骨骼標(biāo)本制作方法不能制作出高質(zhì)量的三斑海馬骨骼標(biāo)本。為此，本研究對透明化骨骼標(biāo)本的制作方法進(jìn)行改進(jìn)，利用茜素紅的特點(diǎn)對三斑海馬進(jìn)行骨骼染色并制作透明化骨骼標(biāo)本。針對三斑海馬具有堅(jiān)固的外骨骼，且其表皮緊帖在骨環(huán)及骨間組織上的特點(diǎn)，本研究縮減了固定環(huán)節(jié)中的剝皮工序，體表顏色通過在脫色環(huán)節(jié)中去除;并增加脫脂環(huán)節(jié)，減少標(biāo)本中黃色脂肪對標(biāo)本透明度的影響。在脫色與透明環(huán)節(jié)，通過添加少量H2O2有效去除組織中殘留的染色劑，添加少量2% KOH促使組織更加透明。此外，在裝瓶步驟中，可正向直立放置三斑海馬骨骼標(biāo)本。改進(jìn)后的透明化骨骼染色法具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）骨架堅(jiān)硬結(jié)實(shí)不易散架;（2）透明度高，易觀察骨骼形態(tài);（3）骨骼結(jié)構(gòu)更清晰，色澤鮮艷;（4）可在再脫色與透明環(huán)節(jié)進(jìn)行微調(diào)與修正等。

魚類骨骼系統(tǒng)包括外骨骼和內(nèi)骨骼，外骨骼主要由鱗片構(gòu)成，內(nèi)骨骼包括肋骨、中軸骨與跗肢骨骼（曹曉穎，2019）。魚類的骨骼特征與其生長發(fā)育和生態(tài)適應(yīng)性密切相關(guān)（王永梅和唐文喬，2014），因此，開展三斑海馬骨骼特征研究有助于了解其發(fā)育特征及生態(tài)適應(yīng)性，同時(shí)為海馬的分類鑒定提供參考依據(jù)。三斑海馬外骨骼與傳統(tǒng)意義上的魚類存在明顯差異，三斑海馬具有菱形骨片構(gòu)成的外骨骼，沒有肋骨和鱗片，菱形骨片間緊密相連，幾乎包被了除頭部以外的所有區(qū)域，相鄰4片菱形骨片間有間隙，泄殖孔處無骨骼包被。鰭條數(shù)量是現(xiàn)階段快速鑒定海馬種類的重要方法之一（梁亮堂，2019）。本研究結(jié)果表明，三斑海馬的背鰭鰭條數(shù)為19～21條，胸鰭鰭條數(shù)為18～19條，與郭文場等（2016）的研究結(jié)論基本一致，即與其他海馬種類（刺海馬除外）存在明顯差異。三斑海馬的臀鰭鰭條數(shù)為4～5條，但由于成年雄性海馬會在其腹部下方發(fā)育形成育兒袋，而臀鰭退化，因此一般不會將臀鰭鰭條數(shù)量作為鑒定海馬種類的指標(biāo)。

魚類的頭部骨骼具有重要功能，包括捕食、呼吸、保護(hù)大腦及提供支撐等，因此頭部骨骼構(gòu)造的特點(diǎn)能反映該物種的攝食方式及呼吸特征等（楊世勇等，2012;黃永彬等，2019）。三斑海馬頭部骨骼較特殊，與普通魚類不同，其最具特點(diǎn)的部位是具有堅(jiān)硬的棘、管狀吻和頭頂鰓孔。三斑海馬頭部具有多個(gè)堅(jiān)硬的棘，頂端鋒利，在野生狀態(tài)下起保護(hù)作用;上、下頜骨延長并結(jié)合形成一根管狀通道，吻端開口向上方傾斜，與頜骨形成45°夾角，吻前端下頜骨可自由打開或閉合，配合攝食與呼吸;吻長占整個(gè)頭長的50%左右，三斑海馬攝食的餌料必須經(jīng)過吻部中間管狀部位的狹窄通道，因此限制了三斑海馬攝食餌料的規(guī)格。三斑海馬屬于機(jī)會性捕食者，2只眼睛可獨(dú)立轉(zhuǎn)動，視野寬闊，通常會將自身纏繞于大型藻類或繩索等條狀固體上（郭文場等，2016），有適合口徑的餌料經(jīng)過時(shí)調(diào)整頭部位置，使餌料處于吻端正前方，雙眼視線重合判斷并調(diào)整餌料與吻端距離，后頭部突然前伸并吸水，通過細(xì)管狀結(jié)構(gòu)近距離產(chǎn)生較大壓力差而將餌料吸入口中。三斑海馬頭部骨骼的另一特點(diǎn)是鰓蓋后緣沒有開裂，吻端吸入的水通過頭頂出水孔噴出。這種出水方式可有效減少呼吸運(yùn)動對胸鰭的干擾，防止伴隨呼吸運(yùn)動不自主向前游動。

魚類的胸腹部骨骼通常是由脊椎骨和肋骨等構(gòu)成，但三斑海馬主要由脊椎骨和菱形骨片構(gòu)成。菱形骨片緊密連接構(gòu)成骨環(huán)，骨環(huán)相互連接構(gòu)成胸腔和腹腔，為胸腹部提供支撐與保護(hù)。本研究發(fā)現(xiàn)，三斑海馬胸腹部共有11節(jié)骨環(huán)，與郭文場等（2016）研究發(fā)現(xiàn)的數(shù)目一致。骨環(huán)間具有滑道結(jié)構(gòu)（下方菱形骨片上角形成V字結(jié)構(gòu)扣在上方菱形骨片下角的骨棱上，菱形骨片下角輕微延長，構(gòu)成可短距離移動的滑道），可實(shí)現(xiàn)小范圍滑動，為三斑海馬提供胸腹部彎曲的空間;骨環(huán)內(nèi)部同樣具有滑道結(jié)構(gòu)，骨環(huán)中的菱形骨片朝向腹面的角均向腹面延長至下一菱形骨片下方（背部2片菱形骨片及正腹部菱形骨片除外），構(gòu)成可滑動的結(jié)合點(diǎn)，為三斑海馬橫向圍度提供伸縮空間。因此，可通過胸腹部膨脹圍度判斷三斑海馬的營養(yǎng)狀況及雌性三斑海馬的性腺發(fā)育情況。此外，第1、4、7和11節(jié)骨環(huán)菱形骨片的棘較長，明顯長于相鄰的骨環(huán)，可能與三斑海馬的早期發(fā)育有關(guān)。

魚類尾部骨骼一般由脊椎骨、鱗片和尾鰭等構(gòu)成，但三斑海馬與之不同，其尾鰭退化，脊椎骨在尾部中央靠背面，外部由菱形骨片包被提供保護(hù)與支撐，尾部可向腹面卷曲或左右擺動，可在水中攀附于大型藻類或繩索等條狀固體上。三斑海馬尾部共有40～41節(jié)骨環(huán)，每片菱形骨片均沿著較短的對角線向內(nèi)彎曲，形成90°角，4片菱形骨骼構(gòu)成1節(jié)骨環(huán)。骨環(huán)間也存在滑道結(jié)構(gòu)（與胸腹部骨環(huán)間結(jié)構(gòu)相同），允許小范圍滑動，促使腹面的活動范圍更大，因此三斑海馬可卷曲尾部，且具有攀附功能。

4 結(jié)論

改進(jìn)后的透明化骨骼染色法更適合于三斑海馬骨骼染色，操作便捷，骨骼標(biāo)本質(zhì)量高。三斑海馬具有獨(dú)特的頭部骨骼結(jié)構(gòu)與攝食方式，自頭部以下全身包被骨骼，外骨骼主要由菱形骨片構(gòu)成，但構(gòu)成不同部位骨環(huán)的菱形骨片數(shù)量不同;骨環(huán)內(nèi)部及骨環(huán)間存在滑道結(jié)構(gòu)，為三斑海馬的運(yùn)動和攝食提供立體空間，因此可通過胸腹部膨脹圍度判斷三斑海馬的營養(yǎng)狀況及雌性三斑海馬的性腺發(fā)育情況。

參考文獻(xiàn)：

曹曉穎. 2019. 鱖魚骨骼結(jié)構(gòu)、骨化發(fā)育及頜骨重塑的初步研究[D]. 上海：上海海洋大學(xué). doi：10.27314/d.cnki.gsscu. 2019.000300. [Cao X Y. 2019. A preliminary study on the skeletal structure，ossification development and jaw remodeling of Mandarin fish[D]. Shanghai： Shanghai Ocean University.]

陳莉萍，申鉉日，陳國華，孫菲菲，金美娜. 2016. 三斑海馬水提物抗氧化活性研究[J]. 食品工業(yè)科技，37（3）：114-118. doi：10.13386/j.issn1002-0306.2016.03.015. [Chen L P，Shen X R，Chen G H，Sun F F，Jin M N. 2016. Antio-xidant activity of aqueous extract from three-spot hippocampus[J]. Science and Technology of Food Industry，37（3）：114-118.]

程大川，馬振華，江世貴. 2017. 紅鰭笛鯛仔、稚魚異速生長[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，41（1）：206-213. doi：10.7541/2017. 26. [Cheng D C，Ma Z H，Jiang S G. 2017. Allometric growth in larval and juvenile crimson snapper Lutjanus erythopterus[J]. Acta Hydrobiologica Sinica，41（1）：206-213.]

鄧鋼，呂軍儀，林強(qiáng). 2005. 大海馬育苗池水華發(fā)生期間細(xì)菌動態(tài)及相關(guān)理化參數(shù)[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué)，12（4）：477-482. doi：10.3321/j.issn：1005-8737.2005.04.018. [Deng G，Lü J Y，Lin Q. 2005. Effects of water-bloom on environmental factors in breeding water for juvenile seahorse，Hippocamppus kuda Bleeker[J]. Journal of Fishery Sciences of China，12（4）：477-482.]

董世雄，李衛(wèi)東，王沛政，姜芳燕，武耀廷. 2017. 海馬種類鑒定及群體遺傳多樣性分析[J]. 技術(shù)與市場，24（12）：126-128. doi：10.3969/j.issn.1006-8554.2017.11.065. [Dong S X，Li W D，Wang P Z，Jiang F Y，Wu Y T. 2017. Species identification of hippocampus and analysis of population genetic diversity[J]. Technology and Market，24（12）：126-128.]

郭文場，劉佳賀，李宏偉. 2016. 中國產(chǎn)海馬的種類、養(yǎng)殖與利用（1）[J]. 特種經(jīng)濟(jì)動植物，19（12）：14-16. doi：10.3969/j.issn.1001-4713.2016.12.005. [Guo W C，Liu J H，Li H W. 2016. Types，breeding and utilization of seahorses in China（1）[J]. Special Economic Animal and Plant，19（12）：14-16.]

黃永彬，張財(cái)文，焦?jié)櫧埽芎Ｑ?，王? 2019. 大圓顎針魚骨骼標(biāo)本的制作[J]. 生物學(xué)教學(xué)，44（1）：35-36. [Huang Y S，Zhang C W，Jiao R J，Zhou H Y，Wang S. 2019. Ma-king of skeleton specimen of Tylosurus giganteus[J]. Bio-logy Teaching，44（1）：35-36.]

姜展志，徐永健，宿宇婷. 2013. 超臨界萃取海馬骨粉脂肪工藝及其脂肪酸組成分析[J]. 中國海洋藥物，32（2）：47-52. doi：10.13400/j.cnki.cjmd.2013.02.009. [Jiang Z Z，Xu Y J，Su Y T. 2013. The extraction technology of fat from bone power of sea horse by SFE and the analysis acid composition[J]. Chinese Journal of Marine Drugs，32（2）：47-52.]

李蓉，唐旭利，李國強(qiáng)，張敏，王長云，管華詩. 2009. 海洋藥用生物系列HPLC化學(xué)指紋圖譜研究Ⅱ. 三斑海馬HPLC化學(xué)指紋圖譜研究[J]. 中國海洋大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），39（4）：729-734. doi：10.16441/j.cnki.hdxb.2009.04.028. [Li R，Tang X L，Li G Q，Zhang M，Wang C Y，Guan H S. 2009. Study on series of HPLC fingerprintⅡ：Hippocampus trimaculatus[J]. Periodical of Ocean University of China，39（4）：729-734.]

李文，黃飛，王利民，趙冬梅，劉希偉，劉洪付，孫毅，張璐萍. 2008. 大鼠骨骼染色透明標(biāo)本的研究[J]. 濱州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，31（1）：14-15. doi：10.3969/j.issn.1001-9510.2008.01. 005. [Li W，Huang F，Wang L M，Zhao D M，Liu X W，Liu H F，Sun Y，Zhang L P. 2008. The study of rat bone specimens of transparent stain[J]. Journal of Binzhou Medical University，31（1）：14-15.]

梁亮堂. 2019. 透明化骨骼染色鑒定海馬種類的方法[J]. 中國水產(chǎn)，（5）：88-90. [Liang L T. 2019. Method for identifying seahorse species by transparent skeleton staining[J]. Chinese Fisheries，（5）：88-90.]

林強(qiáng)，呂軍儀，張彬，儲霞玲，高永利. 2007. 大海馬消化系統(tǒng)胚后發(fā)育的形態(tài)學(xué)及組織學(xué)研究[J]. 熱帶海洋學(xué)報(bào)，26（6）：46-51. doi：10.3969/j.issn.1009-5470.2007.06.008. [Lin Q，Lü J Y，Zhang B，Chu X L，Gao Y L. 2007. Histological studies on post-embryonic development of digestive system of seahorse Hippocampus kuda[J]. Journal of Tropical Oceanography，26（6）：46-51.]

劉萬祥，蔡瀅，王長月. 2002. 骨骼透明標(biāo)本制作及應(yīng)用[J]. 天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，8（3）：377-378. doi：10.3969/j.issn. 1006-8147.2002.03.040. [Liu W X，Cai Y，Wang C Y. 2002. Making and application of bone transparent specimen[J]. Journal of Tianjin Medical University，8（3）：377-378.]

劉釗，趙仲孟，楊世勇，黃小麗，陸穎，馮楊，段靖，杜宗君. 2019. 西伯利亞鱘幼魚骨骼系統(tǒng)解剖研究[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，43（1）：117-122. doi：10.7541/2019.015. [Liu Z，Zhao Z M，Yang S Y，Huang X L，Lu Y，F(xiàn)eng Y，Duan J，Du Z J. 2019. The anatomy of the skeletal system of Acipen-ser baeri juvenile[J]. Acta Hydrobiologica Sinica，43（1）：117-122.]

駱大鵬，劉慶明，邱名毅，趙志英，周海珠. 2016. 三斑海馬的馴化與苗種培育研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，44（31）：147-149. doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2016.31.054. [Luo D P，Liu Q M，Qiu M Y，Zhao Z Y，Zhou H Z. 2016. Study on artificial domestication and seedling cultivation of Hippocampus trimaculatus[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences，44（31）：147-149.]

呂雪嬌，王雨濃，劉清華，翟介明，李軍. 2018. 鞍帶石斑魚仔稚幼魚骨骼發(fā)育與生長特性研究[J]. 海洋科學(xué)，42（5）：116-121. doi：10.11759//hykx20180308002. [Lü X J，Wang Y N，Liu Q H，Zhai J M，Li J. 2018. Research on skeletal development and allometric growth in larval and juvenile Epinephelus lanceolatus[J]. Marine Sciences，42（5）：116-121.]

馬慧，莊志猛，柳淑芳，馬騫，王秀利. 2011. 養(yǎng)殖半滑舌鰨仔稚魚骨骼畸形的發(fā)生過程[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué)，18（6）：1399-1405. doi：10.3724/SP.J.1118.2011.01399. [Ma H，Zhuang Z M，Liu S F，Ma Q，Wang X L. 2011. Skeletal deformities in the larvae and juveniles of cultured tongue sole（Cynoglossus semilaevis）[J]. Journal of Fishery Scien-ces of China，18（6）：1399-1405.]

牟金婷，謝尚端，雍朋政，孫金輝，徐永健，李景. 2017. 溫度對大海馬攝食行為及生長速率的影響[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué)，24（2）：355-361. doi：10.3724/SP.J.1118.2017.16315. [Mu J T，Xie S D，Yong P Z，Sun J H，Xu Y J，Li J. 2017. Effect of temperature on feeding behavior and growth rate of the yellow seahorse，Hippocampus kuda Bleeker[J]. Journal of Fishery Sciences of China，24（2）：355-361.]

王清蓉，萬德光，國錦琳，陳璐. 2018. 三斑海馬蛋白質(zhì)組學(xué)雙向電泳技術(shù)的建立與優(yōu)化[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，24（5）：50-54. doi：10.13422/j.cnki.syfjx.2018050050. [Wang Q R，Wan D G，Guo J L，Chen L. 2018. Establishment and optimization of two-dimensional electrophoresis technique for proteomics of Hippocampus trimaculatus[J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae，24（5）：50-54.]

王永梅，唐文喬. 2014. 中國鯉形目魚類的脊椎骨數(shù)及其生態(tài)適應(yīng)性[J]. 動物學(xué)雜志，49（1）：1-12. doi：10.13859/j.cjz. 2014.01.001. [Wang Y M，Tang W Q. 2014. The number of vertebrae from Chinese species of the Cypriniformes and its ecological adaptation[J]. Chinese Journal of Zoo-logy，49（1）：1-12.]

吳靖娜，陳曉婷，蘇捷，廖登遠(yuǎn)，劉智禹，陳由強(qiáng). 2017. 海馬抗氧化活性肽制備工藝研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，33（32）：127-134. [Wu J N，Chen X T，Su J，Liao D Y，Liu Z Y，Chen Y Q. 2017. Enzymatic preparation of antioxidant peptides from Hippocampus trimaculatus[J]. Chinese Agri-cultural Science Bulletin，33（32）：127-134.]

閆珍珍，張東，林聽聽，劉鑫，肖冬雪，郭全友. 2019. 雌雄灰海馬和三斑海馬營養(yǎng)價(jià)值與功能性成分對比分析[J]. 食品科學(xué)，40（16）：206-212. doi：10.7506/spkx1002-6630-20180920-234. [Yan Z Z，Zhang D，Lin T T，Liu X，Xiao D X，Guo Q Y. 2019. A comparative analysis of functio-nal components and nutritional values of female and male Hippocampus erectus and H. trimaculatus[J]. Food Scien-ce，40（16）：206-212.]

楊凡，郭明蘭，蘇永全，王軍. 2007. 紅羅非魚的骨骼系統(tǒng)[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），46（S1）：161-166. doi：10. 3321/j.issn：0438-0479.2007.z1.034. [Yang F. 2007. The skeletal system of Oreochromis niloticus×O.mossambicus[J]. Journal of Xiamen University （Natural Science），46（S1）：161-166.]

楊求華，鄭樂云，黃種持，林琪，陸振，周宸. 2017. 線紋海馬尾部潰爛癥病原輪蟲弧菌的分離鑒定及特性分析[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué)，24（5）：1131-1140. doi：10.3724/SP.J.1118. 2017.16310. [Yang Q H，Zheng L Y，Huang Z C，Lin Q，Lu Z，Zhou C. 2017. Identification and characterization of pathogen Vibrio rotiferianus，a pathogen isolated from Hippocampus erectus with tail-rot disease[J]. Journal of Fishery Sciences of China，24（5）：1131-1140.]

楊世勇，廖宇峰，楊坤，嚴(yán)太明，杜宗君. 2012. 齊口裂腹魚頭骨系統(tǒng)解剖[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，25（4）：1478-1482. doi：10.3969/j.issn.1001-4829.2012.04.072. [Yang S Y，Liao Y F，Yang K，Yan T M，Du Z J. 2012. Skull system of Schizothorax prenanti[J]. Southwest China Journal of Agri-cultural Sciences，25（4）：1478-1482.]

于曼曼. 2018. 三斑海馬長鏈堿的制備及體外抗腫瘤作用的研究[D]. ?？冢汉Ｄ洗髮W(xué). [Yu M M. 2018. Study on pre-paration and anti-tumor activity of sphingoid bases from Hippocampus trimaculatus Leach[D]. Haikou：Hainan Univeristy.]

袁根軍，陳再忠. 2011. 光照時(shí)間對三斑海馬幼苗成活率和生長速度的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，39（2）：347-349. doi：10.3969/j.issn.1002-1302.2011.02.123. [Yuan G J，Chen Z Z. 2011. Effects of sunlight hours on seedling survival and growth rate of Hippocampus trimaculatus Leach[J]. Jiangsu Agricultural Sciences，39（2）：347-349.]

張寧，蘇勝彥，董在杰，馬慶男，袁新華. 2012. 基于micro CT掃描技術(shù)的鯉骨骼和顯微結(jié)構(gòu)分析[J]. 南方水產(chǎn)科學(xué)，8（6）：44-49. doi：10.3969/j.issn.2095-0780.2012.06.007. [Zhang N，Su S Y，Dong Z J，Ma Q N，Yuan X H. 2012. Study on bone and microstructure of common carp using micro CT scanning[J]. South China Fisheries Science，8（6）：44-49.]

鄭攀龍，馬振華，郭華陽，李有寧，張殿昌，江世貴. 2014. 卵形鯧鲹尾部骨骼胚后發(fā)育研究[J]. 南方水產(chǎn)科學(xué)，10（5）：45-50. doi：10.3969/j.issn.2095-0780.2014.05.007. [Zheng P L，Ma Z H，Guo H Y，Li Y N，Zhang D C，Jiang S G. 2014. Ontogenetic development of caudal skeletons in Trachinotus ovatus larvae[J]. South China Fisheries Scien-ce，10（5）：45-50.]

周勝杰，胡靜，馬振華，陳旭，楊其彬，楊蕊，劉亞娟，孟祥君. 2018a. 尖吻鱸尾部骨骼胚后發(fā)育研究[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，37（3）：342-347. doi：10.16378/j.cnki.1003-1111.2018.03.009. [Zhou S J，Hu J，Ma Z H，Chen X，Yang Q B，Yang R，Liu Y J，Meng X J. 2018a. Ontogenetic development of caudal skeletons in silver sea perch Lates calcarifer[J]. Fisheries Science，37（3）：342-347.]

周勝杰，馬婷，胡靜，馬振華，楊其彬，陳旭，楊蕊，劉亞娟，孟祥君. 2018b. 尖吻鱸仔魚骨骼發(fā)育觀察[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，49（3）：592-598. doi：10.3969/j.issn.2095-1191.2018. 03.27. [Zhou S J，Ma T，Hu J，Ma Z H，Yang Q B，Chen X，Yang R，Liu Y J，Meng X J. 2018b. Skeleton development observation of Lates calcarifer larva fish[J]. Journal of Southern Agriculture，49（3）：592-598.]

Abdel I，Abellán E，López-Albors O，Valdés P，Nortes M J，García-Alcázar A. 2004. Abnormalities in the juvenile stage of sea bass（Dicentrarchus labrax L.） reared at diffe-rent temperatures：Types，prevalence and effect on growth[J]. Aquaculture International，12（6）：523-538. doi：10. 1007/s10499-004-0349-9.

Andrades J A，Becerra J，F(xiàn)ernández-Llebrez P. 1996. Skeletal deformities in larval，juvenile and adult stages of cultured gilthead sea bream（Sparus aurata L.）[J]. Aquaculture，141（1-2）：1-11. doi：10.1016/0044-8486（95）01226-5.

Cobcroft J M，Battaglene S C. 2013. Skeletal malformations in Australian marine finfish hatcheries[J]. Aquaculture，396-399：51-58. doi：10.1016/j.aquaculture.2013.02.027.

Darias M J，Mazurais D，Koumoundouros G，Glynatsi N， Christodoulopoulou S，Huelvan C，Desbruyeres E，Le Gall M M，Quazuguel P，Cahu C，Zambonino-Infante J L. 2010a. Dietary vitamin D3 affects digestive system ontogenesis and ossification in European sea bass（Dicentrachus labrax，Linnaeus，1758）[J]. Aquaculture，298（3）：300-307. doi：10.1016/j.aquaculture. 2009.11.002.

Darias M J，Wing O L C，Cahu C，Zambonino-Infante J L，Mazurais D. 2010b. Double staining protocol for develo-ping European sea bass（Dicentrarchus labrax）larvae[J]. Journal of Applied Ichthyology，26（2）：280-285. doi：10. 1111/j.1439-0426.2010.01421.x.

Georgakopoulou E，Angelopoulou A，Kaspiris P，Divanach P，Koumoundouros G. 2007. Temperature effects on cranial deformities in European sea bass，Dicentrachus labrax （L.）[J]. Journal of Applied Ichthyology，23（1）：99-103. doi：10.1111/j.1439-0426.2006.00810.x

Prestinicola L，Boglione C，Makridis P，Spanò A，Rimatori V，Palamara E，Scardi M，Cataudella S. 2013. Environmental conditioning of skeletal anomalies typology and frequency in gilthead seabream（Sparus aurata L.，1758） juveniles[J]. PLoS One，8（2）：e55736. doi：10.1371/journal.pone.0055736.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）