豬偽狂犬病毒體外誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型的建立

任春芝 謝映紅 王秋華 韋英益 胡庭俊

摘要：【目的】探討豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）感染對(duì)小鼠單核巨噬細(xì)胞（RAW264.7）炎癥反應(yīng)的影響，確定PRV的最佳感染劑量和感染時(shí)間，為建立RAW264.7細(xì)胞體外病毒感染炎癥反應(yīng)模型打下基礎(chǔ)。【方法】PRV按10倍遞增稀釋成10-5～10-1 PRV稀釋液，感染RAW264.7細(xì)胞并孵育1.5 h，棄病毒液后加入含5%胎牛血清的DMEM維持培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，分別于繼續(xù)培養(yǎng)2、4、8、12、24和48 h時(shí)收集細(xì)胞上清液，采用ELISA測(cè)定IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α、MCP-1和IFN-γ分泌水平及環(huán)氧合酶（COX-1和COX-2）活性，并以CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活性?！窘Y(jié)果】以PRV感染RAW264.7細(xì)胞4～48 h后均能通過PCR擴(kuò)增獲得PRV核酸的特異性條帶，故選擇4～48 h作為后續(xù)研究的PRV感染時(shí)間范圍;10-2 PRV～10-1 PRV感染可顯著降低RAW264.7細(xì)胞活性（P<0.05，下同），10-3 PRV組僅在培養(yǎng)48 h時(shí)出現(xiàn)下降趨勢(shì)，而10-5 PRV～10-4 PRV感染對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性無顯著影響。PRV感染RAW264.7細(xì)胞后，其胞內(nèi)炎癥因子IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-1β和MCP-1的分泌水平整體上呈升高趨勢(shì)，其中10-3 PRV感染RAW264.7細(xì)胞12 h能顯著或極顯著（P<0.01）提高IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-1β和MCP-1的分泌水平;10-4 PRV～10-1 PRV感染組的IL-10分泌水平均呈升高趨勢(shì)，而10-5 PRV感染組在感染8和24 h時(shí)IL-10分泌水平明顯低于空白對(duì)照組，至感染48 h所有病毒感染組的IL-10分泌水平均降低;10-3 PRV～10-1 PRV感染8～24 h能有效提高RAW264.7細(xì)胞的COX-2活性，但對(duì)COX-1活性的影響不明顯?！窘Y(jié)論】PRV感染能誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，其中10-3 PRV體外感染RAW264.7細(xì)胞8～12 h是建立RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型的最佳條件。該模型可應(yīng)用于PRV感染與RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)相關(guān)干預(yù)藥物的研究，為進(jìn)一步揭示PRV感染機(jī)理及開發(fā)抗病毒感染藥物提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 豬偽狂犬病毒（PRV）;RAW264.7細(xì)胞;體外誘導(dǎo);炎癥反應(yīng);炎癥因子;環(huán)氧合酶

中圖分類號(hào)： S852.659.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2021）05-1370-08

Abstract：【Objective】The effect of inflammatory reaction on RAW264.7 cells infected with pseudorabies virus（PRV）was investigated to establish the inflammatory response model in vitro by screening the best infective dose and infective time， and provide reference for establishing RAW264.7 in vitro virus infection inflammation model. 【Method】RAW264.7 cells were infected with five different concentrations of PRV which were diluted by serial 10 times to the concentration from 1×10-5 to 1×10-1 for 1.5 h. Then the virus liquids were discarded. Subsequently， the cells were plated in DMEM with 5% calf serum and then cell supernatants were collected after cultured for 2， 4， 8， 12， 24 and 48 h respectively. The le-vels of interleukin 6（IL-6）， interleukin 10（IL-10）， interleukin 1β（IL-1β）， tumor necrosis factor Alpha（TNF-α）， monocyte chemoattractant protein-1（MCP-1），interferon-γ（IFN-γ） and the activities of both cyclooxygenase 1（COX-1） and cyclooxygenase 2（COX-2） were determined by ELISA kits. The activities of cells were detected by CCK-8 method. 【Result】The specific bands of PRV nucleic acid were obtained by PCR amplification at 4-48 h post PRV infection in RAW264.7 cells， so 4-48 h was selected as the time range of PRV infection in the subsequent studies. The activities of RAW264.7 cells were significantly decreased in 10-2 PRV-10-1 PRV groups and only trended to decrease at 48 h in 10-3 PRV group（P<0.05， the same below）， however， there was no significant influence on the RAW264.7 cells activities in 10-5 -10-4 PRV groups. The secretion of inflammatory factors such as IL-6， IFN-γ， TNF-α， IL-1β and MCP-1 were increased in general after PRV infected RAW264.7 cells. 10-3 PRV infected RAW264.7 cells 12 h could significantly or extremely significantly（P<0.01） increase secretion levels of IL-6， IFN-γ， TNF-α， IL-1β and MCP-1. The secretion level of IL-10 was increased in 10-1 PRV-10-4 PRV groups， while notably lower than that in the blank control group at 8 and 24 h after infection in 10-5 PRV group， and the level was decreased at 48 h in all of the PRV infected groups. The secretion level of COX-2 was? increased for 8-24 h post infection in 10-3 PRV-10-1 PRV group， but there had no obvious effect on the secretion level of COX-1. 【Conclusion】PRV infection induces inflammatory reaction in RAW264.7 cells. 10-3 PRV infection in RAW264.7 cells in vitro for 8-12 h is considered as the optimal condition for the establishment of the inflammatory response model. This model can be applied to the study of PRV infection and inflammatory response in RAW264.7 cell which relates to the intervention action of drugs， and the results provide theoretical basis for reveal the mechanism of PRV infection and the development of anti-viral infection drugs.

Key words： pseudorabies virus （PRV）; RAW264.7 cell; in vitro induction; inflammatory response; inflammatory factor; cyclooxygenase

Foundation item： National Natural Science Foundation of China（32072907，31560708）

0 引言

【研究意義】豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）可引起多種家畜和野生動(dòng)物發(fā)病，豬是該病毒的唯一自然宿主，仔豬感染死亡率接近100%，給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來重大經(jīng)濟(jì)損失（Pontes et al.，2016;梁祺英等，2017）。PRV感染新生仔豬可導(dǎo)致其神經(jīng)系統(tǒng)紊亂甚至死亡，感染懷孕母豬可造成流產(chǎn)，感染成年豬則引發(fā)呼吸系統(tǒng)疾病，且急性感染存活的豬群將終生帶毒（Zhang et al.，2019）。感染PRV的豬群通過分泌物和排泄物傳播病毒，主要通過直接接觸傳播，也可通過水和污染物傳播。PRV疫苗免疫是預(yù)防豬偽狂犬病最有效的方法，Bartha-K61疫苗可有效控制PRV傳播（華濤等，2019），但無法防治PRV變異毒株引起的感染。自2011年以來，我國(guó)部分接種Bartha-K61疫苗的養(yǎng)豬場(chǎng)仍然暴發(fā)豬偽狂犬?。ˋn et al.，2013;Freuling et al.，2017），因此急需加強(qiáng)PRV感染致病機(jī)理研究，以尋找理想的抗病毒感染藥物?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】PRV屬于皰疹病毒科α-皰疹病毒亞科，為雙鏈DNA病毒，可在幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞（BHK-21）、胚胎成纖維細(xì)胞（CEF）、豬腎細(xì)胞（PK-15）及小鼠單核巨噬細(xì)胞（RAW264.7）等細(xì)胞中擴(kuò)增，且研究發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增PRV最有效的細(xì)胞是PK-15細(xì)胞（彭麗英等，2011;李小靜和唐滿華，2015;程璇等，2020）。臧素芳等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，PRV感染會(huì)減輕小鼠體重，并引起被毛凌亂及神經(jīng)亢奮等癥狀，其腦組織有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。肖熹玉等（2016）發(fā)現(xiàn)PK-15細(xì)胞的增殖在PRV感染24 h后受到顯著抑制，且與感染時(shí)間顯著相關(guān)，與感染劑量不相關(guān)，同時(shí)觀察到細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。安娜等（2018）研究表明，人工感染PRV后豬體內(nèi)免疫器官和下丘腦中的IL-1β表達(dá)水平顯著升高，并對(duì)豬的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響。病毒感染后通常引起明顯的細(xì)胞病變，并刺激腫瘤壞死因子（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）、干擾素（IFN）、趨化因子和集落刺激因子（CSF）等細(xì)胞因子過量分泌。李飛等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）感染后，小鼠脾臟勻漿中的細(xì)胞因子分泌水平明顯升高;譚紅連等（2017）研究證實(shí)，以豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）感染3D4/2細(xì)胞后，其TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和MCP-1等炎癥因子水平均明顯升高。另有研究發(fā)現(xiàn)，乙型腦炎病毒感染小膠質(zhì)細(xì)胞后可引起TNF-α、IL-6和MCP-1等促炎細(xì)胞因子過量釋放，流感病毒感染宿主后則引起肺部發(fā)生急性炎癥反應(yīng)，炎癥因子水平升高（莊忻雨等，2018;Dai et al.，2018）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】可見，部分病毒感染可導(dǎo)致體內(nèi)或體外的炎癥反應(yīng)發(fā)生，且目前已成功建立了多種病毒感染細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型（張玲等，2016;譚紅連等，2017;羅文涓等，2018），但有關(guān)PRV體外感染RAW264.7細(xì)胞引起炎癥反應(yīng)的研究尚無報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用PRV體外感染RAW264.7細(xì)胞，測(cè)定IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α、MCP-1和IFN-γ分泌水平及COX-1和COX-2活性的變化，探討PRV感染量和感染時(shí)間與RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子水平的關(guān)聯(lián)性，為建立RAW264.7細(xì)胞體外病毒感染炎癥反應(yīng)模型打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

PRV-GXLB-2013毒株由廣西大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，經(jīng)PK-15細(xì)胞擴(kuò)增，通過Reed-Muench法測(cè)定病毒滴度為107.2 TCID50/0.1 mL;PRV特異性擴(kuò)增引物（上游引物5'-CGGCTTCCACTCGCAGCT CTTCTC-3'，下游引物5'-TGTGGGTCATCACGAG CACGTACAGC-3'）委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成;PK-15細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞由廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院獸醫(yī)藥理與毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存提供。胎牛血清（FBS）和DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;病毒基因組DNA提取試劑盒及PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α、MCP-1、IFN-γ、COX-1和COX-2等ELISA試劑盒均購(gòu)自武漢云克隆科技股份有限公司。主要儀器設(shè)備有TS100-F倒置顯微鏡、Multimode Plate Reader多功能酶標(biāo)儀、S1000梯度PCR儀和C150細(xì)胞培養(yǎng)箱等。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 篩選病毒感染時(shí)間 將8.0 mL含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液加入細(xì)胞瓶，在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中擴(kuò)增RAW264.7細(xì)胞。待細(xì)胞鋪滿瓶底70%～80%后用細(xì)胞刮刀刮下RAW264.7細(xì)胞，按1∶3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到一定數(shù)量后，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至1×105 Cells/mL，然后接種至24孔板（1 mL/孔），37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，棄上清液，PBS洗3遍，分別加入PRV（200 μL/孔），繼續(xù)孵育1.5 h，用PBS洗去殘留病毒液，加入含5%胎牛血清的DMEM維持培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。繼續(xù)培養(yǎng)2、4、8、12、24和48 h后棄上清液，PBS洗2～3遍，分別收集細(xì)胞反復(fù)凍融，按照DNA抽提試劑盒說明提取DNA，并利用PRV特異性引物進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)，以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1. 2. 2 試驗(yàn)分組及處理 試驗(yàn)設(shè)10-5～10-1 PRV稀釋濃度感染組，設(shè)未感染細(xì)胞為陰性（空白）對(duì)照。用細(xì)胞刮刀刮下培養(yǎng)瓶中的RAW264.7細(xì)胞，1000 r/min離心5 min，棄上清液，加入DMEM完全培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）輕輕吹打均勻，調(diào)整細(xì)胞終濃度為1×105 Cells/mL，接種至24孔板（1 mL/孔），37 ℃、5% CO2培養(yǎng)過夜后棄上清液，PBS洗3遍。空白對(duì)照組加入無血清的DMEM完全培養(yǎng)液（200 μL/孔），病毒組則分別加入不同濃度的病毒稀釋液（200 μL/孔），繼續(xù)孵育1.5 h，期間可晃動(dòng)培養(yǎng)瓶使病毒液充分接觸細(xì)胞。孵育結(jié)束后棄病毒液，PBS清洗殘留病毒液，加入DMEM維持培養(yǎng)液（含5%胎牛血清）繼續(xù)培養(yǎng)。分別于繼續(xù)培養(yǎng)2、4、8、12、24和48 h時(shí)收集上清液用于測(cè)定細(xì)胞炎癥反應(yīng)指標(biāo)，收集上清液后剩余的細(xì)胞則用于測(cè)定細(xì)胞活性。

1. 2. 3 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活性 新鮮配制含10% CCK-8試劑的無血清DMEM完全培養(yǎng)液，按100 μL/孔的劑量加入無上清液的24孔板中，繼續(xù)孵育1.0 h，然后在酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)定OD值。

1. 2. 4 ELISA測(cè)定炎性反應(yīng)指標(biāo) 根據(jù)ELISA試劑盒說明分別檢測(cè)細(xì)胞上清液中的IL-6、IL-1β、IL-10、MCP-1、IFN-γ和TNF-α含量及環(huán)氧合酶（COX-1和COX-2）活性。

1. 2. 5 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 23.0對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），并以Excel 2010制圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 PRV感染RAW264.7細(xì)胞時(shí)間的確定

RAW264.7細(xì)胞在PRV感染后繼續(xù)培養(yǎng)4、8、12、24和48 h，抽提病毒DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增及1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，均獲得大小約388 bp的特異性條帶，而感染后繼續(xù)培養(yǎng)2 h的細(xì)胞未擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)的特異性條帶（圖1）。說明PRV能成功感染RAW264.7細(xì)胞，并選擇感染4～48 h的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2. 2 PRV感染對(duì)RAW 264.7細(xì)胞活性的影響

如圖2所示，PRV感染RAW264.7細(xì)胞后，10-3 PRV感染組的細(xì)胞活性在感染48 h時(shí)與空白對(duì)照組相比差異顯著（P<0.05，下同）;10-2 PRV感染組的細(xì)胞活性在感染4、8和48 h時(shí)與空白對(duì)照組相比差異極顯著（P<0.01，下同），在感染24 h時(shí)與空白對(duì)照組相比差異顯著;10-1 PRV感染組的細(xì)胞活性除了在感染12 h時(shí)與空白對(duì)照組相比無顯著差異（P>0.05，下同）外，其他時(shí)間點(diǎn)均極顯著低于空白對(duì)照組?？梢?，10-2～10-1 PRV感染可顯著降低RAW264.7細(xì)胞活性，10-3 PRV感染僅在培養(yǎng)48 h時(shí)出現(xiàn)下降趨勢(shì)，而10-5～10-4 PRV感染對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性無顯著影響。

2. 3 PRV感染對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌IL-6的影響

如圖3所示，PRV感染RAW264.7細(xì)胞后，僅10-1 PRV感染24 h、10-3 PRV感染8和12 h及10-4 PRV感染12 h的細(xì)胞內(nèi)IL-6水平較空白對(duì)照組顯著升高。說明10-3 PRV感染RAW264.7細(xì)胞8～12 h能顯著提高其分泌IL-6的能力。

2. 4 PRV感染對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌IL-10的影響

如圖4所示，與空白對(duì)照組相比，10-1 PRV感染RAW264.7細(xì)胞8 h其胞內(nèi)IL-10水平極顯著升高，但至感染48 h時(shí)IL-10水平極顯著降低;10-2 PRV感染RAW264.7細(xì)胞8 h及10-3 PRV感染RAW264.7細(xì)胞8和24 h，其細(xì)胞內(nèi)IL-10水平顯著高于空白對(duì)照組;10-5 PRV感染RAW264.7細(xì)胞48 h后，細(xì)胞分泌IL-10的水平極顯著低于空白對(duì)照組?？梢姡?0-3 PRV感染RAW264.7細(xì)胞8～24 h能有效提高其分泌IL-10的能力。

2. 5 PRV感染對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌IFN-γ的影響

如圖5所示，與空白對(duì)照組相比，10-1 PRV感染RAW264.7細(xì)胞8 h其胞內(nèi)IFN-γ水平顯著升高，感染24 h極顯著升高;10-2 PRV感染4和12 h時(shí)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)的IFN-γ水平極顯著升高，感染8 h時(shí)IFN-γ水平顯著升高;10-3 PRV感染4 h時(shí)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)的IFN-γ水平呈下降趨勢(shì)，但與空白對(duì)照組相比無顯著差異，感染8和12 h時(shí)呈顯著或極顯著升高趨勢(shì);10-4 PRV感染RAW264.7細(xì)胞12 h其胞內(nèi)IFN-γ水平顯著升高?？梢?，10-2 PRV感染4～12 h及10-3 PRV感染8～12 h均能有效提高RAW264.7細(xì)胞分泌IFN-γ的能力。

2. 6 PRV感染對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α的影響

如圖6所示，PRV感染RAW264.7細(xì)胞后，在各時(shí)間點(diǎn)其胞內(nèi)TNF-α水平均高于空白對(duì)照組。其中，10-1 PRV感染RAW264.7細(xì)胞8 h時(shí)其胞內(nèi)TNF-α水平極顯著高于空白對(duì)照組;10-2 PRV感染RAW264.7細(xì)胞12 h及10-3 PRV感染RAW264.7細(xì)胞8和12 h時(shí)其胞內(nèi)TNF-α水平也極顯著高于空白對(duì)照組;10-4 PRV感染RAW264.7細(xì)胞24 h時(shí)其胞內(nèi)TNF-α水平顯著高于空白對(duì)照組。即10-3 PRV感染8～12 h能有效提高RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α的能力。

2. 7 PRV感染對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌IL-1β的影響

如圖7所示，以10-3 PRV～10-1 PRV感染RAW264.7細(xì)胞能有效提高其胞內(nèi)IL-1β的分泌水平。與空白對(duì)照組相比，10-1 PRV感染RAW264.7細(xì)胞4和8 h時(shí)其胞內(nèi)IL-1β水平極顯著升高，感染24 h時(shí)顯著升高;10-2 PRV感染RAW264.7細(xì)胞4和12 h時(shí)其胞內(nèi)IL-1β水平顯著升高;10-3 PRV感染RAW264.7細(xì)胞12 h時(shí)其胞內(nèi)IL-1β水平極顯著升高。以10-5 PRV和10-4 PRV感染RAW264.7細(xì)胞，其胞內(nèi)IL-1β水平的變化趨勢(shì)與空白對(duì)照組相比均無顯著差異。

2. 8 PRV感染對(duì)RAW264.7細(xì)胞COX-1活性的影響

如圖8所示，以PRV感染RAW264.7細(xì)胞，僅有10-1 PRV感染4 h及10-2 PRV感染24 h的胞內(nèi)COX-1活性顯著高于空白對(duì)照組外，其他PRV濃度感染組對(duì)RAW264.7細(xì)胞COX-1活性均無顯著影響。

2. 9 PRV感染對(duì)RAW264.7細(xì)胞COX-2活性的影響

如圖9所示，以不同濃度PRV感染RAW264.7細(xì)胞4 h，其胞內(nèi)COX-2活性均無顯著變化。10-1 PRV感染RAW264.7細(xì)胞8 h其胞內(nèi)COX-2活性極顯著高于空白對(duì)照組，10-2 PRV感染8和24 h其胞內(nèi)COX-2活性顯著或極顯著高于空白對(duì)照組，10-3 PRV感染8和24 h其胞內(nèi)COX-2活性顯著高于空白對(duì)照組，而10-4 PRV感染12 h其胞內(nèi)COX-2活性顯著降低?？梢?，10-3 PRV和10-2 PRV感染8或24 h均能有效提高RAW264.7細(xì)胞COX-2的活性。

2. 10 PRV感染對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌MCP-1的影響

如圖10所示，10-3 PRV～10-1 PRV感染RAW264.7細(xì)胞4、12和24 h其胞內(nèi)MCP-1水平均極顯著高于空白對(duì)照組;10-4 PRV感染RAW264.7細(xì)胞4和12 h其胞內(nèi)MCP-1水平也極顯著高于空白對(duì)照組?？梢?，10-3 PRV～10-1 PRV感染4、12或24 h均能有效提高RAW264.7細(xì)胞分泌MCP-1的能力。

3 討論

炎癥是機(jī)體對(duì)病毒或細(xì)菌感染及組織損傷等刺激的一種防御反應(yīng)，但過度的炎癥反應(yīng)會(huì)損傷機(jī)體，引起實(shí)質(zhì)器官變性、壞死及功能衰竭。RAW264.7細(xì)胞是建立體外炎癥反應(yīng)模型的常用細(xì)胞，細(xì)菌和病毒等致病因素均可誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生多種細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)及趨化因子等（Lin et al.，2012;Liao et al.，2018;Tebakari et al.，2018）。本研究以RAW264.7細(xì)胞為體外炎癥反應(yīng)模型細(xì)胞，通過探究病毒感染RAW264.7細(xì)胞后炎性因子的分泌水平及環(huán)氧合酶活性的變化，建立PRV感染RAW264.7細(xì)胞體外炎癥反應(yīng)模型，為進(jìn)一步揭示PRV感染機(jī)理及研發(fā)抗病毒感染藥物提供理論依據(jù)。

炎癥前期細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8和MCP-1等具有免疫作用，可導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，在細(xì)胞免疫及其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用（Lin et al.，2017;首姣琴等，2019）。TNF-α是重要的早期炎癥因子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化及凋亡等過程，在造血和抗病毒方面具有重要意義，同時(shí)可刺激活化IL-6和IL-1β。IL-6具有抗炎和促炎的雙向功能，參與機(jī)體的免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)，IL-6在正常水平下有利于機(jī)體的防御作用，但產(chǎn)生過多會(huì)引起炎性損傷，在多種炎癥相關(guān)疾病中均伴有IL-6水平的升高，且對(duì)單核巨噬細(xì)胞具有趨化作用（張海等，2014;Saiki et al.，2018）。IL-1β是內(nèi)皮細(xì)胞活化因子，在病毒感染機(jī)體后調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，常與TNF-α產(chǎn)生協(xié)同作用。MCP-1是由單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及B細(xì)胞等分泌的小分子蛋白，是重要的促炎因子，通過吸引炎性細(xì)胞遷移至損傷部位而特異性激活單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)（鄒莉等，2018）。張玲等（2016）研究發(fā)現(xiàn)，以PRRSV體外感染RAW264.7細(xì)胞，其細(xì)胞存活率明顯降低，而胞內(nèi)TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1和IFN-γ等炎癥因子的分泌水平極顯著升高。張曉音等（2017）采用ELISA和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)脂多糖（LPS）刺激后的巨噬細(xì)胞，結(jié)果表明其胞內(nèi)IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子的分泌水平顯著升高，即巨噬細(xì)胞發(fā)生了炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果表明，以PRV感染RAW264.7細(xì)胞4～48 h后均能通過PCR擴(kuò)增獲得PRV的特異性條帶，故選擇4～48 h作為后續(xù)研究的PRV感染時(shí)間范圍;10-5 PRV～10-3 PRV稀釋濃度對(duì)RAW264.7細(xì)胞無明顯毒性影響，可作為試驗(yàn)用的安全濃度范圍。此外，PRV感染RAW264.7細(xì)胞后，其胞內(nèi)炎癥因子IL-6、IFN-γ、TNF-α、IL-1β和MCP-1的分泌水平整體上呈升高趨勢(shì)，即這些炎癥介質(zhì)已參與病毒感染所致的炎癥反應(yīng)過程，與張玲等（2016）的研究結(jié)果一致。

IL-10作為一種抗炎因子，能抑制單核巨噬細(xì)胞釋放IL-6、IL-1β、TNF-α和IFN-γ等多種炎癥因子，并降低細(xì)菌或病毒誘導(dǎo)所造成的損害（Villela-Castrejón et al.，2017）。有研究表明，IL-10能降低LPS誘導(dǎo)內(nèi)毒素血癥小鼠血清TNF水平，并減輕實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型關(guān)節(jié)腫脹、細(xì)胞浸潤(rùn)及細(xì)胞因子合成（濮海平，2004）。機(jī)體發(fā)生炎癥損害時(shí)，巨噬細(xì)胞在釋放促炎因子的同時(shí)釋放抗炎因子，使機(jī)體免疫應(yīng)答趨于平衡，當(dāng)這種平衡失調(diào)就會(huì)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加重，器官功能障礙甚至衰竭。因此，一定范圍內(nèi)促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生IL-10有利于治療炎癥疾?。ü鶄?qiáng)等，2008;張麗娜，2012）。本研究發(fā)現(xiàn)，PRV感染RAW264.7細(xì)胞24 h內(nèi)，10-4 PRV～10-1 PRV感染組的IL-10分泌水平均呈升高趨勢(shì)，而10-5 PRV感染組在感染8和24 h時(shí)IL-10分泌水平明顯低于空白對(duì)照組，至感染48 h所有病毒感染組的IL-10分泌水平均降低。該結(jié)論揭示了炎癥反應(yīng)的復(fù)雜性及IL-10的多重調(diào)節(jié)功能。環(huán)氧合酶分為COX-1和COX-2，能將花生四烯酸催化為具有活性的前列腺素，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，在病毒感染及LPS等刺激因子的作用下高表達(dá)，其中COX-2與炎癥發(fā)生密切相關(guān)（吳磊等，2012）。本研究中，10-3 PRV～10-1 PRV感染8～24 h能有效提高RAW264.7細(xì)胞COX-2活性，但對(duì)COX-1活性的影響不明顯。

4 結(jié)論

PRV感染能誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，其中10-3 PRV稀釋濃度體外感染RAW264.7細(xì)胞8～12 h是建立RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型的最佳條件。該模型可應(yīng)用于PRV感染與RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)相關(guān)干預(yù)藥物的研究，為進(jìn)一步揭示PRV感染機(jī)理及開發(fā)抗病毒感染藥物提供理論依據(jù)。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）