千屈菜無(wú)菌苗對(duì)重金屬銅和鉻的生理生化響應(yīng)

張?jiān)婗?劉暢子 母丹丹 吳志剛 李 濤

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430072; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049;3. 水生藻安生物科技(武漢)有限公司, 武漢 430075)

水體重金屬污染是全球主要的環(huán)境問(wèn)題之一[1]。隨著工業(yè)和農(nóng)業(yè)的不斷發(fā)展以及城市化進(jìn)程的持續(xù)推進(jìn), 工農(nóng)業(yè)廢水、固體廢棄物和生活廢水等污染物的排放量日趨增加, 導(dǎo)致水體重金屬污染越來(lái)越嚴(yán)重。水體重金屬污染會(huì)影響水生植物和動(dòng)物的生存, 還會(huì)通過(guò)直接或間接的作用危害人類生命健康。銅是植物生長(zhǎng)必需的微量元素, 但水體中高濃度的銅離子(Cu2+)會(huì)嚴(yán)重影響水生生物的生存,對(duì)植物具有高毒性[2], 影響植物的光合作用、膜系統(tǒng)、酶系統(tǒng)等。因此銅也被認(rèn)為是生態(tài)系統(tǒng)中毒性最大的重金屬之一[3]。鉻是現(xiàn)代工業(yè)如電鍍、橡膠、印染、油漆和機(jī)械制造等行業(yè)的重要金屬元素。但其也是地殼中發(fā)現(xiàn)的毒性最大的重金屬之一[4]。當(dāng)其隨工業(yè)廢渣排入環(huán)境中后, 會(huì)嚴(yán)重污染土壤和水體, 危害植物的各項(xiàng)生理活動(dòng)[4]。在水體中, 鉻主要以三價(jià)鉻離子(Cr3+)和六價(jià)鉻離子(Cr6+)的形式存在。其中六價(jià)鉻離子易溶于水, 其毒性約為三價(jià)鉻離子的100倍。

千屈菜(Lythrum salicariaLinnaeus)屬于桃金娘目千屈菜科千屈菜屬, 多年生草本, 分布于全國(guó)各地。千屈菜能夠有效去除水體中的總氮和總磷[5],具有較強(qiáng)的重金屬抗性, 對(duì)土壤中的金屬鎘[6]、鎳[1]、銅、鉻、鋅、錳和砷等[7,8]具有良好的富集能力。在含有銅和鉻等多種重金屬的廢水中, 千屈菜長(zhǎng)勢(shì)良好, 具有較強(qiáng)的重金屬抗性[9]。此外, 千屈菜為花卉植物, 外形優(yōu)美, 花朵繁茂且花期長(zhǎng)。因此, 千屈菜十分適用于修復(fù)污染水體, 尤其是重金屬污染水體。但目前關(guān)于千屈菜的研究主要集中在其富集效果和凈化效率方面, 對(duì)其生理響應(yīng)機(jī)制的研究還十分缺乏。本研究以千屈菜無(wú)菌苗為實(shí)驗(yàn)材料, 可以盡量排除植株個(gè)體差異和水體其他生物(尤其是微生物)的影響。實(shí)驗(yàn)從光合色素、膜脂系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)等方面研究千屈菜對(duì)銅(Cu2+)和鉻(Cr6+)的耐性機(jī)理, 為其在重金屬污染水體修復(fù)中的應(yīng)用提供理論依據(jù), 也為其他植物的抗重金屬研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)以千屈菜無(wú)菌苗為植物材料。千屈菜無(wú)菌苗培養(yǎng)方法: 選取生長(zhǎng)健壯的千屈菜, 用自來(lái)水沖洗干凈后再于流水下沖洗0.5h。隨后在紫外超凈臺(tái)中, 將千屈菜先用無(wú)菌水反復(fù)沖洗3次, 再用0.1%的氯化汞滅菌8—10min, 最后用無(wú)菌水反復(fù)沖洗5次。將滅菌后的千屈菜切成5—10 mm長(zhǎng)的莖段, 辨認(rèn)形態(tài)學(xué)上端后, 置于MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基(青島海博HB8469)中。其中, 培養(yǎng)基含6-芐氨基嘌呤(6-BA)1 mg/L和萘乙酸(NAA)0.1 mg/L, pH 5.8—6.0。待千屈菜莖段萌芽后, 將其轉(zhuǎn)入新的MS培養(yǎng)基中(激素和酸堿度同上), 待其繼續(xù)生長(zhǎng)和生根, 最終成長(zhǎng)為完整植株。

選擇長(zhǎng)勢(shì)良好的千屈菜無(wú)菌苗, 取約10 cm左右長(zhǎng)度的植株, 置于1/10 無(wú)菌Hoagland培養(yǎng)液(pH 5.8—6.0)中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。每隔2天更換1次培養(yǎng)液,預(yù)培養(yǎng)2周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程在全封閉培養(yǎng)箱中進(jìn)行, 培養(yǎng)條件為平均光照40 μE/(m2·s), 光照周期為12h﹕12h光暗循環(huán), 溫度25℃。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取長(zhǎng)勢(shì)一致的千屈菜無(wú)菌苗，分別置于添加了0(對(duì)照)、5、10、20和40 mg/L Cu2+(CuSO4·5H2O)與添加了0(對(duì)照)、5、10、20和40 mg/L Cr6+(K2Cr2O7)的1/10無(wú)菌 Hoagland 培養(yǎng)液中。整個(gè)實(shí)驗(yàn)均在全封閉培養(yǎng)箱中完成, 培養(yǎng)條件與預(yù)培養(yǎng)時(shí)一致, 全程處理4d。待處理結(jié)束后, 在相同的時(shí)間段內(nèi)取出千屈菜無(wú)菌苗, 用去離子水洗凈、揩干, 隨后測(cè)定各項(xiàng)生理生化指標(biāo), 每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

葉綠素含量的測(cè)定采用丙酮乙醇(1﹕1)浸提法[10]。取植株葉片剪碎后于暗光條件下浸提, 分別在645和663 nm處測(cè)定吸光度, 用Arnon公式計(jì)算葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素的含量。

丙二醛含量的測(cè)定: 取植株葉片置于玻璃勻漿器中, 加入適量0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.2),于冰水浴條件下研磨成10%的植物勻漿。離心后取上清液, 應(yīng)用硫代巴比妥酸法原理[11], 采用南京建成生物工程研究所試劑盒(A003-1)進(jìn)行測(cè)定。

可溶性糖含量的測(cè)定: 取植株葉片置于玻璃研磨器中, 加入適量蒸餾水研磨成10%的植物勻漿,沸水浴后離心并取上清, 應(yīng)用蒽酮比色法原理[11],采用南京建成生物工程研究所試劑盒(A145-1-1)進(jìn)行測(cè)定。

可溶性蛋白含量的測(cè)定: 取植株葉片置于玻璃勻漿器中, 加入適量生理鹽水在冰水浴條件下研磨成10%的植物勻漿, 離心后取上清, 應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)G-250法原理[11], 采用南京建成生物工程研究所試劑盒(A045-2)進(jìn)行測(cè)定。

抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性的測(cè)定: 取植株葉片置于玻璃勻漿器中, 加入適量0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.2), 于冰水浴條件下研磨成10%的植物勻漿。3500 r/min, 離心10min, 取上清液進(jìn)行測(cè)定。其中SOD、POD和CAT酶活分別應(yīng)用黃嘌呤氧化酶-羥胺法[12]、愈創(chuàng)木酚法[11]和鉬酸銨法[13]原理, 采用南京建成生物工程研究所試劑盒(A001-1、A084-3-1和A007-1 -1)進(jìn)行測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)Microsoft Excel 2017進(jìn)行整理并作圖分析, 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有指標(biāo)與Cu2+和Cr6+濃度進(jìn)行單因素方差分析和鄧肯檢驗(yàn),P＜0.05表示差異顯著。圖中不同字母表示差異水平為P＜0.05, 相同字母表示差異水平為P＞0.05。

2 結(jié)果

2.1 銅離子和鉻離子對(duì)千屈菜葉綠素含量的影響

隨著Cu2+濃度的升高, 葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量均呈“升-降-升”趨勢(shì)(圖 1a)。在Cu2+濃度為5 mg/L時(shí), 葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量均顯著升高(P＜0.05), 達(dá)到最高值。隨后, 葉綠素a逐漸下降, 并在Cu2+濃度為20 mg/L時(shí)相對(duì)對(duì)照組顯著減少, 而在最高濃度(40 mg/L)時(shí)又有所上升。葉綠素b整體變化趨勢(shì)與葉綠素a相同, 且在Cu2+濃度為40 mg/L時(shí)顯著上升。葉綠素總量變化趨勢(shì)與葉綠素a相同, 在Cu2+濃度為5 mg/L時(shí)達(dá)到最高含量為1.26 mg/g,后逐漸下降至0.93 mg/g。當(dāng)Cu2+濃度升高至40 mg/L時(shí), 葉綠素總量又顯著回升。

隨著Cr6+濃度的升高, 葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量也呈現(xiàn)“升-降-升”趨勢(shì)(圖 1b), 在Cr6+濃度為10 mg/L時(shí)三者含量均達(dá)到最高。在0—10 mg/L Cr6+濃度條件下, 千屈菜葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量不斷上升, 其中葉綠素總量達(dá)到1.34 mg/g。當(dāng)Cr6+濃度繼續(xù)升高至20 mg/L時(shí), 三者均有所下降, 其中葉綠素總量下降至1.18 mg/g。在此過(guò)程中, 葉綠素a和葉綠素總量變化顯著。在最高Cr6+濃度(40 mg/L)條件下, 千屈菜葉綠素含量有所回升,其中葉綠素總量上升至1.30 mg/g, 但未超過(guò)10 mg/L時(shí)的葉綠素總量。

圖1 不同濃度Cu2+和Cr6+對(duì)千屈菜無(wú)菌苗葉綠素含量的影響Fig. 1 The effects of different concentrations of Cu2+ and Cr6+on chlorophyll contents of Lythrum salicaria

2.2 銅離子和鉻離子對(duì)千屈菜丙二醛含量的影響

在不同濃度銅離子培養(yǎng)條件下, 千屈菜無(wú)菌苗的丙二醛(MDA)含量均高于對(duì)照組(圖 2), 整體呈上升趨勢(shì)。其中Cu2+濃度為10和40 mg/L時(shí), 千屈菜MDA含量顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。

在不同濃度鉻離子培養(yǎng)條件下, 千屈菜無(wú)菌苗的MDA含量先降后升(圖 2)。在Cr6+濃度為0—20 mg/L時(shí), 千屈菜無(wú)菌苗MDA含量變化不顯著。當(dāng)Cr6+濃度增加至40 mg/L時(shí), 千屈菜無(wú)菌苗MDA含量達(dá)到最大值0.95 nmol/mg prot, 顯著高于其余所有處理組。

圖2 不同濃度Cu2+和Cr6+對(duì)千屈菜無(wú)菌苗丙二醛含量的影響Fig. 2 The effects of different concentrations of Cu2+ and Cr6+ on malonaldehyde contents of Lythrum salicaria

2.3 銅離子和鉻離子對(duì)千屈菜可溶性糖含量的影響

在不同濃度銅離子培養(yǎng)條件下, 千屈菜無(wú)菌苗的可溶性糖含量整體呈先升后降趨勢(shì)(圖 3)。在Cu2+濃度為10 mg/L時(shí), 千屈菜無(wú)菌苗可溶性糖含量達(dá)到最高值5.02 mg/g, 顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。當(dāng)Cu2+濃度從10增加至20 mg/L時(shí), 可溶性糖含量降至2.18 mg/g, 降幅達(dá)56.61%。當(dāng)Cu2+濃度繼續(xù)增加至40 mg/L后, 可溶性糖含量有所上升, 但仍低于對(duì)照組。

在不同濃度鉻離子培養(yǎng)條件下, 千屈菜無(wú)菌苗的可溶性糖含量變化趨勢(shì)與銅處理下相反(圖 3)。在Cr6+濃度為0—10 mg/L, 千屈菜無(wú)菌苗的可溶性糖含量逐漸下降。在Cr6+濃度為10 mg/L時(shí)可溶性糖含量降至最低為2.41 mg/g, 顯著低于對(duì)照組。當(dāng)Cr6+濃度增加至20—40 mg/L, 可溶性糖含量又顯著上升至對(duì)照組水平。

圖3 不同濃度Cu2+和Cr6+對(duì)千屈菜無(wú)菌苗可溶性糖含量的影響Fig. 3 The effects of different concentrations of Cu2+ and Cr6+ on soluble sugar contents of Lythrum salicaria

2.4 銅離子和鉻離子對(duì)千屈菜可溶性蛋白含量的影響

在不同濃度銅離子培養(yǎng)條件下, 千屈菜無(wú)菌苗的可溶性蛋白含量整體呈先升后降趨勢(shì)(圖 4)。千屈菜無(wú)菌苗可溶性蛋白含量在Cu2+濃度為5 mg/L時(shí)達(dá)到最大值為4.02 g prot/L, 顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。在Cu2+濃度為10 mg/L時(shí), 可溶性蛋白含量顯著下降了39.28%。在Cu2+濃度為40 mg/L時(shí), 可溶性蛋白濃度已降為對(duì)照組的60.86%。

在不同濃度鉻離子培養(yǎng)條件下, 千屈菜無(wú)菌苗可溶性蛋白含量表現(xiàn)為“降-升-降”趨勢(shì)(圖 4)。當(dāng)Cr6+濃度為5 mg/L時(shí), 千屈菜無(wú)菌苗可溶性蛋白含量顯著下降。隨后在Cr6+濃度為10 mg/L時(shí), 可溶性蛋白濃度上升。在Cr6+濃度為10—40 mg/L, 可溶性蛋白含量持續(xù)下降。在Cr6+濃度為40 mg/L時(shí), 可溶性蛋白含量下降至1.10 g prot/L, 顯著低于其余所有處理組。

圖4 不同濃度Cu2+ 和Cr6+ 對(duì)千屈菜無(wú)菌苗可溶性蛋白含量的影響Fig. 4 The effects of different concentrations of Cu2+ and Cr6+ on soluble protein contents of Lythrum salicaria

2.5 銅離子和鉻離子對(duì)千屈菜抗氧化酶活性的影響

銅離子和鉻離子對(duì)千屈菜SOD活性的影響 隨著銅離子濃度的上升, 千屈菜無(wú)菌苗的超氧化物歧化酶(SOD)活性呈持續(xù)上升趨勢(shì)(圖 5)。在Cu2+濃度為5、10、20和40 mg/L條件下, SOD分別比對(duì)照組上升了8.37%、41.13%、74.17%和100.04%。在Cu2+濃度為40 mg/L時(shí), SOD活性達(dá)到最大值為14.96 U/mg prot。

隨著鉻離子濃度的上升, 千屈菜無(wú)菌苗的SOD活性也呈持續(xù)上升趨勢(shì), 且均顯著高于對(duì)照組(P＜0.05;圖 5)。在Cr6+濃度為5和20 mg/L時(shí), 千屈菜無(wú)菌苗SOD活性分別上升41.77%和44.7%。當(dāng)Cr6+濃度增加至40 mg/L時(shí), SOD活性則上升了138.18%。

圖5 不同濃度Cu2+和Cr6+對(duì)千屈菜無(wú)菌苗SOD活性的影響Fig. 5 The effects of different concentrations of Cu2+ and Cr6+ on SOD activity of Lythrum salicaria

銅離子和鉻離子對(duì)千屈菜POD活性的影響 隨著銅離子濃度的上升, 千屈菜無(wú)菌苗的過(guò)氧化物酶(POD)活性整體呈先升后降趨勢(shì)(圖 6)。當(dāng)Cu2+濃度為20 mg/L時(shí), 千屈菜無(wú)菌苗POD活性達(dá)到最大值11.76 U/mg prot, 顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。當(dāng)Cu2+濃度繼續(xù)增至40 mg/L時(shí), POD活性則顯著下降為6.87 U/mg prot, 低于對(duì)照組。

圖6 不同濃度Cu2+和Cr6+對(duì)千屈菜無(wú)菌苗POD活性的影響Fig. 6 The effects of different concentrations of Cu2+ and Cr6+ on POD activity of Lythrum salicaria

千屈菜無(wú)菌苗在鉻離子培養(yǎng)條件下的POD活性整體高于在銅離子培養(yǎng)條件下的(圖 6)。在Cr6+濃度為0—10 mg/L, 千屈菜無(wú)菌苗的POD活性隨Cr6+濃度的增加而升高。當(dāng)Cr6+濃度為20 mg/L時(shí),POD活性略有下降, 但仍高于對(duì)照組。當(dāng)Cr6+濃度增加至最高40 mg/L時(shí), POD活性顯著上升至最大值26.33 U/mg prot, 顯著高于其余任何處理組。

銅離子和鉻離子對(duì)千屈菜CAT活性的影響 千屈菜無(wú)菌苗的過(guò)氧化氫酶(CAT)活性隨著銅離子濃度的增加呈持續(xù)上升趨勢(shì)(圖 7), 且其整體活性遠(yuǎn)高于鉻離子培養(yǎng)條件下的活性。CAT活性在各Cu2+濃度處理組間變化顯著(P＜0.05)。當(dāng)Cu2+濃度在10 mg/L時(shí), CAT活性已顯著高于對(duì)照組。當(dāng)Cu2+濃度為40 mg/L時(shí), CAT活性達(dá)到最大值12.10 U/mg prot,是對(duì)照組的2.7倍。

圖7 不同濃度Cu2+和Cr6+對(duì)千屈菜無(wú)菌苗CAT活性的影響Fig. 7 The effects of different concentrations of Cu2+ and Cr6+ on CAT activity of Lythrum salicaria

在鉻離子培養(yǎng)條件下, 千屈菜無(wú)菌苗CAT活性整體水平均低于對(duì)照組(圖 7)。在最低Cr6+濃度5 mg/L條件下, CAT活性即顯著低于對(duì)照組。在Cr6+濃度為5—20 mg/L, CAT活性變化不大。當(dāng)Cr6+濃度增加至40 mg/L時(shí), CAT活性顯著上升至3.73 U/mg prot, 但仍低于對(duì)照組。

3 討論

3.1 銅和鉻離子對(duì)千屈菜葉綠素含量的影響

葉綠素廣泛存在于植物的綠色組織中, 是植物進(jìn)行光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。葉綠素的含量與植物的光合作用和營(yíng)養(yǎng)狀況密切相關(guān), 能夠反映植物的生長(zhǎng)狀況。重金屬對(duì)植物葉綠素的影響主要是破壞葉綠體膜和類囊體膜, 抑制葉綠素的合成[14]。

在本研究中, 千屈菜無(wú)菌苗在鉻離子培養(yǎng)條件下的葉綠素含量顯著高于銅離子。在2種離子培養(yǎng)條件下, 千屈菜無(wú)菌苗葉綠素含量均呈“升-降-升”的趨勢(shì)。在低濃度銅處理中千屈菜葉綠素含量呈上升趨勢(shì), 其原因可能是Cu2+是葉綠體質(zhì)體藍(lán)素的組成成分, 還是葉綠素合成過(guò)程中酶促反應(yīng)的輔因子[15]。因此, 低濃度Cu2+能促進(jìn)葉綠素的合成。但隨著Cu2+濃度的升高, 大量Cu2+進(jìn)入植物體內(nèi), 破壞了葉綠素的結(jié)構(gòu)或使得葉綠素加速分解。

在低濃度的Cr6+培養(yǎng)條件下, 千屈菜葉綠素含量顯著上升, 這可能是千屈菜受到低濃度Cr6+刺激,促進(jìn)了葉綠素的合成。但隨著Cr6+濃度在千屈菜細(xì)胞內(nèi)的大量積累, 取代了葉綠體所需要的鐵和鎂元素, Cr6+與蛋白質(zhì)上的SH基結(jié)合[16,17], 損害了葉綠體的結(jié)構(gòu)和功能。此外, 千屈菜在銅和鉻離子培養(yǎng)條件下葉綠素a/b值逐漸降低, 說(shuō)明葉綠素a受到的影響更大, 植株對(duì)光能的捕獲能力降低?？嗖菰阢~處理下的響應(yīng)也是如此[18]。

重金屬常通過(guò)直接或間接損傷葉綠體結(jié)構(gòu)或與相關(guān)酶作用干擾葉綠素合成途徑來(lái)降低植物體內(nèi)的葉綠素濃度。植物在重金屬條件下葉綠素含量常表現(xiàn)為逐漸降低或低促高抑現(xiàn)象。此外也有研究發(fā)現(xiàn)一些植物在高濃度重金屬處理下, 其葉綠素含量會(huì)增加。例如美人蕉在高濃度(40 mg/L)鉻脅迫下, 葉綠素含量有所升高[19]。再力花 (Thalia dealbata)[20]、江蘺 (Gracilaria verrucosa)[21]和線葉眼子菜 (Potamogeton pusillus)[22]等在重金屬處理下, 葉綠素含量呈“升-降-升”趨勢(shì)。但出現(xiàn)該現(xiàn)象的機(jī)理尚不清楚, 在本實(shí)驗(yàn)中, 千屈菜在40 mg/L銅和鉻處理下, 葉綠素含量也有所上升, 可能與特定濃度造成的抗性機(jī)制或應(yīng)答有關(guān)[20,23]。

3.2 銅和鉻離子對(duì)千屈菜丙二醛含量的影響

細(xì)胞膜具有調(diào)節(jié)和控制物質(zhì)進(jìn)出細(xì)胞的重要生理功能。植物在脅迫條件下, 酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生氧自由基, 導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化[2], 形成脂質(zhì)過(guò)氧化物, 損害細(xì)胞膜穩(wěn)定性, 影響植物的正常代謝。其中MDA是膜脂過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物之一, 其含量可反映植物脂質(zhì)過(guò)氧化程度和細(xì)胞損傷程度。在本實(shí)驗(yàn)中, 千屈菜無(wú)菌苗在不同濃度Cu2+培養(yǎng)條件下MDA含量整體呈上升趨勢(shì), 各Cu2+濃度處理組MDA含量均高于對(duì)照組。在Cu2+濃度為20 mg/L時(shí)膜脂化程度略有緩解, 說(shuō)明千屈菜細(xì)胞保護(hù)機(jī)制起了一定作用, 但其含量依然高于對(duì)照組。這說(shuō)明千屈菜細(xì)胞膜在各濃度銅處理下均受到損害。菹草無(wú)菌苗在銅處理下也表現(xiàn)出類似的機(jī)制[24]。

在本實(shí)驗(yàn)中, 千屈菜無(wú)菌苗MDA含量整體隨Cr6+濃度的增加而升高。黑藻和綠蘿[25]在鉻脅迫下其MDA含量也隨Cr6+濃度的升高而升高, 但上升幅度明顯。而千屈菜在Cr6+濃度為0—20 mg/L時(shí),MDA含量上升幅度較小, 與對(duì)照組的差異均不顯著, 表明其受到的影響較小。在Cr6+濃度為10 mg/L時(shí), 千屈菜MDA含量甚至略有下降, 說(shuō)明其保護(hù)機(jī)制產(chǎn)生了一定的作用。但當(dāng)Cr6+濃度增加至40 mg/L時(shí), 千屈菜MDA含量驟增, 顯著高于其余所有處理組。這表明此時(shí)其保護(hù)機(jī)制可能已經(jīng)無(wú)法及時(shí)清除過(guò)多的氧自由基, 導(dǎo)致細(xì)胞膜脂化程度快速加重。綜上, 千屈菜細(xì)胞膜脂化程度受銅離子損害較大, 而低濃度Cr6+(≤20 mg/L)對(duì)千屈菜細(xì)胞膜脂化程度影響很小。

3.3 銅和鉻離子對(duì)千屈菜滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

可溶性糖和可溶性蛋白是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。在重金屬脅迫下, 植物可以通過(guò)積累可溶性糖和可溶性蛋白來(lái)維持細(xì)胞滲透勢(shì), 保證水分供應(yīng)和生理代謝。可溶性糖在植物體內(nèi)分布廣泛, 可在脅迫條件下提高植物保水力和吸水力, 提高原生質(zhì)的彈性[26]。在本實(shí)驗(yàn)中, 千屈菜無(wú)菌苗可溶性糖含量在銅處理下呈先升后降趨勢(shì), 與千屈菜在Cd和Pb脅迫下的變化一致[27], 表現(xiàn)為低促高抑現(xiàn)象。當(dāng)Cu2+濃度為5和10 mg/L時(shí), 千屈菜可溶性糖含量高于對(duì)照組, 說(shuō)明其可通過(guò)提高可溶性糖含量來(lái)維持細(xì)胞滲透勢(shì)。而高濃度的Cu2+對(duì)千屈菜可溶性糖有抑制作用, 但當(dāng)Cu2+濃度為40 mg/L時(shí)可溶性糖含量又有所回升, 且與對(duì)照組差異不顯著。在鉻處理下, 千屈菜可溶性糖含量變化趨勢(shì)則與Cu2+相反, 表現(xiàn)為先降后升趨勢(shì), 與菹草在鉻脅迫下的響應(yīng)一致[28]。這可能是由于低濃度Cr6+不足以引起千屈菜滲透系統(tǒng)的防御反應(yīng), 反而刺激了千屈菜的某些生理活動(dòng)如光合產(chǎn)物合成, 使得可溶性糖的利用效率增加。但可溶性糖含量除在Cr6+濃度為10 mg/L時(shí)顯著下降外, 其余處理組變化均不顯著。這表明千屈菜可溶性糖含量在鉻處理下所受影響可能不是很大, 具有較好的鉻抵抗能力。

可溶性蛋白也是植物體內(nèi)分布廣泛的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[26], 可維持細(xì)胞滲透勢(shì), 調(diào)節(jié)代謝, 提高植物抗脅迫的能力。在本研究中, 千屈菜無(wú)菌苗可溶性蛋白在銅處理下呈先升后降趨勢(shì)。這與菹草(Potamogeton crispus)在銅脅迫下可溶性蛋白的變化趨勢(shì)一致[24]。三葉草(Trifolium pretense)的銅污染研究也表明低濃度Cu2+可誘導(dǎo)可溶性蛋白的含量, 而高濃度Cu2+則有抑制作用[29]。這說(shuō)明低濃度Cu2+對(duì)千屈菜可溶性蛋白含量具有激活作用。此外, 可溶性蛋白含量在10、20和40 mg/L之間下降幅度不顯著, 說(shuō)明千屈菜可能對(duì)Cu2+具有一定抗性。在鉻處理下, 千屈菜可溶性蛋白含量則整體呈下降趨勢(shì), 這與苦草在鉻處理下的響應(yīng)一致[30]。但較低濃度的Cr6+對(duì)其影響不大, 在Cr6+濃度20 mg/L時(shí), 千屈菜可溶性蛋白含量依然與對(duì)照組無(wú)顯著差異。而當(dāng)Cr6+濃度進(jìn)一步升高為40 mg/L時(shí), 可溶性蛋白含量才發(fā)生顯著下降。綜上, 千屈菜在銅和鉻處理下均具有一定的滲透調(diào)節(jié)抗性, 其中鉻處理對(duì)千屈菜滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響相對(duì)較小。

3.4 銅和鉻離子對(duì)千屈菜抗氧化酶活性的影響

在重金屬脅迫下, 植物會(huì)產(chǎn)生大量活性氧(ROS), 這些活性氧在細(xì)胞中大量積累后會(huì)損傷細(xì)胞膜、大分子蛋白質(zhì)、DNA和RNA等。為抵御活性氧帶來(lái)的毒性作用, 植物會(huì)激活抗氧化酶機(jī)制來(lái)清除過(guò)多的活性氧。SOD、POD和CAT是植物體內(nèi)重要的清除活性氧的酶類。SOD可以將O2-轉(zhuǎn)化為毒性相對(duì)較弱的H2O2, 而CAT和POD則可以把H2O2進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為H2O和O2[31]。在銅脅迫下, 輪葉黑藻 (Hydrilla verticillata) 的SOD和POD活性持續(xù)升高[32], 魚(yú)草(Cabomba caroliniana)的POD和CAT活性也逐漸增強(qiáng)[33], 以緩解銅離子的脅迫作用。在鉻脅迫下, 2種莧屬植物的SOD、POD和CAT活性不斷增強(qiáng)[16], 超富集植物李氏禾(Leersia hexandra)在Cr6+濃度20 mg/L以內(nèi)抗氧化酶活性也逐漸升高[31],以抵御氧化脅迫。

在本實(shí)驗(yàn)中, 千屈菜SOD活性在銅和鉻處理下均呈持續(xù)上升趨勢(shì), 且在鉻處理下千屈菜的SOD活性整體顯著高于銅。這表明千屈菜在銅和鉻處理下能良好地激發(fā)SOD活性, 清除過(guò)多的自由基, 降低氧化損傷。并且相對(duì)于銅處理而言, 千屈菜SOD對(duì)鉻處理反應(yīng)更加敏感。千屈菜POD活性在銅處理下表現(xiàn)為先升后降, 表明低濃度Cu2+能激發(fā)POD活性, 而高濃度Cu2+會(huì)抑制POD活性。在鉻處理下, 千屈菜POD活性則整體呈上升趨勢(shì), POD活性隨Cr6+濃度的增加不斷上升, 以清除機(jī)體內(nèi)的過(guò)氧化氫, 且其POD響應(yīng)機(jī)制相對(duì)于銅處理下更為積極。千屈菜在銅處理下, CAT活性隨Cu2+濃度增加而不斷升高, 表明CAT在銅處理下發(fā)揮了重要作用,與伊樂(lè)藻(Elodea canadensis)的響應(yīng)一致[34]。而鉻處理則對(duì)千屈菜CAT活性表現(xiàn)為在所有濃度范圍內(nèi)的持續(xù)抑制效應(yīng), 這與Halimione portulacoides根系對(duì)鉻的響應(yīng)相似[35]。綜上, 千屈菜抗氧化酶系統(tǒng)在銅和鉻處理下響應(yīng)積極。在銅處理下千屈菜體內(nèi)活性氧的清除由SOD、POD和CAT三種酶共同參與, 而在鉻處理下參與活性氧清除的酶主要是SOD和POD。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定了銅(Cu2+)和鉻(Cr6+)培養(yǎng)條件下千屈菜無(wú)菌苗的葉綠素、丙二醛、可溶性糖、可溶性蛋白含量和SOD、POD、CAT活性。結(jié)果表明千屈菜對(duì)Cu2+和Cr6+具有一定的抗性, 在2種離子處理下千屈菜葉綠素含量基本未受影響,抗氧化酶活性上升, 且具有一定的滲透調(diào)節(jié)能力。千屈菜在Cu2+濃度低于5 mg/L時(shí)生理生化指標(biāo)所受影響相對(duì)較小, 表明其具有修復(fù)水體低濃度銅污染的潛力; 而千屈菜在Cr6+濃度低于20 mg/L時(shí)其生理生化指標(biāo)所受影響相對(duì)較小, 與一些鉻超富集植物的耐受能力相近, 表明其在鉻污染水體修復(fù)方面具有較高的應(yīng)用潛力。但千屈菜無(wú)菌苗在水體修復(fù)中的實(shí)際應(yīng)用還需要更深入的研究。