魴鲌雜交魚染色體減數(shù)分裂特征及相關(guān)基因分析

湯陳宸,吳 昌,李 健,陳 乾,陶 敏,張 純,覃欽博,羅凱坤,劉少軍*

（1.湖南師范大學(xué)省部共建淡水魚類發(fā)育生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中國湖南 長沙 410081;2.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院多倍體魚繁殖與育種技術(shù)教育部工程研究中心,中國湖南 長沙 410081）

遠(yuǎn)緣雜交能將不同物種基因組整合到雜交子代中[1]。因此,雜交子代中往往包含了兩個(gè)及以上的亞基因組,而亞基因組間的相互作用是雜交優(yōu)勢的基礎(chǔ)。在植物中,遠(yuǎn)緣雜交是一種常用的育種方法,如雜交水稻[2]、雜交小麥[3]和雜交菊花[4]等。越來越多的研究表明,很多大自然中現(xiàn)存的植物都來源于物種間的雜交,如花生[5]、棉花[6]等。在高等脊椎動(dòng)物中,雖然有過一些雜交的報(bào)道,但雜交獲得兩性可育后代的報(bào)道甚少。在低等脊椎動(dòng)物的魚類中,目前人們已通過基因組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)并認(rèn)為,一些自然界的魚類如紅鯽[7]、鯉[8]等為雜交起源的異源多倍體;但是,通過人工的方式進(jìn)行亞科間、屬間、種間遠(yuǎn)緣雜交,獲得兩性可育的后代并建立雜交品系的雜交組合相對較少[9]。

減數(shù)分裂是有性生殖生物配子產(chǎn)生的必需過程[10]。目前的研究表明,雜交種不育的主要原因在于其減數(shù)分裂過程中異源染色體配對和分離發(fā)生紊亂。在馬（2n=64）和驢（2n=62）的雜交后代騾中,因其63條染色體在減數(shù)分裂過程中不能進(jìn)行正常的聯(lián)會(huì),所以敗育[11];在不育的異源三倍體湘云鯽的減數(shù)分裂中,人們同時(shí)發(fā)現(xiàn)了單價(jià)體和二價(jià)體的存在,說明同源染色體在配對和分離過程發(fā)生紊亂[12];此外,在人工三倍體水晶彩鯽發(fā)育阻滯的卵巢中,研究人員也發(fā)現(xiàn)減數(shù)分裂粗線期的細(xì)胞中含有單價(jià)體、二價(jià)體、三價(jià)體和其他多價(jià)體[13]。因此,是否能跨越減數(shù)分裂阻滯是可育個(gè)體形成的重要條件,而雜交物種中來源于不同物種的異源染色體在減數(shù)分裂中的相互識別、聯(lián)會(huì)配對和分離尤為困難,更具研究價(jià)值。

Dmc1（DNA meiotic recombinase 1）和Rec8（meiotic recombination protein）是減數(shù)分裂過程中與同源染色體配對和分離相關(guān)的重要蛋白質(zhì)。Dmc1基因在減數(shù)分裂前期Ⅰ特異性表達(dá),其產(chǎn)物Dmc1蛋白和RAD51蛋白共同定位于偶線期,在同源染色體配對過程中起到重要作用[14]。Rec8蛋白作用于染色體的著絲粒,在減數(shù)第一次分裂后期,受Sgo1蛋白保護(hù),確保同源染色體分離時(shí)姐妹染色單體不分離;在第二次減數(shù)分裂時(shí),Rec8蛋白降解,姐妹染色單體順利分離[15]。在酵母中,Rec8基因作用于減數(shù)分裂過程中的染色體配對和姐妹染色單體的凝集[16]。

團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala,2n=48）隸屬于鲌亞科中的魴屬,而翹嘴鲌（Culter alburnus,2n=48）隸屬于鲌亞科中的鲌屬。本課題組以團(tuán)頭魴和翹嘴鲌為親本,進(jìn)行屬間正反交,獲得了兩種兩性可育的雜交子一代[17],并通過其自交分別建立了魴鲌雜交品系（BTF1-BTF6）和鲌魴雜交品系（F1-F3）[18～19]。兩性可育雜交子代的形成以及雜交品系的建立在魚類種質(zhì)資源創(chuàng)建方面具有重要的意義。本文在魴鲌雜交品系建立的基礎(chǔ)上,以可育的魴鲌F(tuán)1為材料,通過對減數(shù)分裂過程中染色體特征、相關(guān)基因序列和表達(dá)水平的研究,初步揭示了異源二倍體雜交魚可育的細(xì)胞學(xué)和遺傳學(xué)機(jī)制,在魚類遺傳育種方面具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

團(tuán)頭魴、翹嘴鲌和魴鲌F(tuán)1均取自湖南師范大學(xué)淡水魚類發(fā)育生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。由于雌性個(gè)體減數(shù)分裂的不連續(xù)性,即成熟卵子處于減數(shù)第二次分裂中期,受精后才刺激第二次減數(shù)分裂完成,所以本研究選取雄性魴鲌F(tuán)1作為實(shí)驗(yàn)材料,進(jìn)行性腺染色體制備;同時(shí),取同一時(shí)期的團(tuán)頭魴、翹嘴鲌和魴鲌F(tuán)1精巢組織,用液氮將其速凍后超低溫保存,作為相關(guān)基因檢測的材料。

1.2 性腺染色體制備與觀察

從雄性魴鲌F(tuán)1的腹腔兩側(cè)取出精巢組織,放入小培養(yǎng)皿中,小心除去結(jié)締組織,用生理鹽水（0.7%的氯化鈉）清洗干凈;用手術(shù)剪將精巢組織剪碎至糊狀,隨后將其全部轉(zhuǎn)移到15 mL尖底離心管中,用吸管猛吹,打散細(xì)胞后補(bǔ)足生理鹽水至11 mL;靜置10 min后取上清,離心、取沉淀物,加入0.05 mol/L的氯化鉀低滲液,低滲處理80 min,其間每隔20 min吸取沉淀物并丟棄,低滲處理結(jié)束后離心、收集沉淀物;加入2 mL卡諾氏固定液固定3次,每次固定20 min,固定后離心、取沉淀物,最后加2 mL卡諾氏固定液固定并于4℃保存。吸取20 μL染色體溶液,從高處滴落至冰凍玻片上,于酒精燈上加熱、固定,以吉姆薩染液染色50 min后流水沖洗,晾干。最后,在Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察染色體形態(tài)并記錄。

1.3 總RNA提取與cDNA第一條鏈合成

從超低溫冰箱取出保存的精巢組織材料,用Trizol（美國ThermoFisher Scientific公司）提取總RNA,具體操作步驟參考試劑說明書。用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測新提取的總RNA,確認(rèn)其是否降解,用酶標(biāo)儀檢測總RNA的純度和濃度。

檢測合格的RNA經(jīng)DNaseⅠ酶（美國Thermo-Fisher Scientific公司）去除基因組DNA后,用于cDNA第一條鏈的合成,具體合成步驟參照Revert-Aid First Strand cDNA Synthesis Kit（美國Thermo-Fisher Scientific公司）的說明進(jìn)行。

1.4 Dmc1和Rec8基因編碼區(qū)片段克隆

從NCBI（National Center for Biotechnology Information）公共數(shù)據(jù)庫上查找并下載斑馬魚的Dmc1（NM_001020782）和 Rec8（NM_001040378）基因序列,用BLAST軟件從團(tuán)頭魴和翹嘴鲌的基因組中調(diào)取相應(yīng)的Dmc1和Rec8基因片段。為確保序列的準(zhǔn)確性,分別設(shè)計(jì)引物（表1）,以5條團(tuán)頭魴、翹嘴鲌和魴鲌F(tuán)1精巢組織的cDNA為模板,用高保真酶（美國ThermoFisher Scientific公司）擴(kuò)增這兩個(gè)基因的編碼區(qū)片段,并完成克隆、測序。

表1 Dmc1和Rec8基因的全長擴(kuò)增與熒光定量PCR引物Table 1 Primers used for amplification of full-length genes and real-time quantitative PCR

1.5 基因序列比較分析

根據(jù)團(tuán)頭魴、翹嘴鲌與魴鲌F(tuán)1的Dmc1和Rec8基因序列,用ClustalW軟件分別比對同源序列,分析并計(jì)算Dmc1和Rec8的基因序列與氨基酸序列在團(tuán)頭魴和翹嘴鲌中的同源性;同時(shí)分析團(tuán)頭魴、翹嘴鲌中這兩個(gè)基因在編碼區(qū)的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP）位點(diǎn)的差異,并進(jìn)一步利用這些差異的SNP位點(diǎn),確認(rèn)魴鲌F(tuán)1中這兩個(gè)基因的遺傳組成情況。

1.6 系統(tǒng)進(jìn)化分析

從NCBI上 下載斑馬魚、鯽、金線 鲃 等魚類Dmc1和Rec8基因所編碼蛋白質(zhì)的氨基酸序列,將這些序列與團(tuán)頭魴和翹嘴鲌對應(yīng)的序列構(gòu)成單獨(dú)的文件,利用MEGA 7軟件調(diào)用ClustalW,進(jìn)行同源氨基酸多序列比對。采用鄰接法（neighborjoining method）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,bootstrap設(shè)置為1 000,其他參數(shù)選擇默認(rèn)值。

1.7 基因表達(dá)檢測

以團(tuán)頭魴、翹嘴鲌和魴鲌F(tuán)1的Dmc1和Rec8基因序列為參考,利用Primer Premier 5軟件在三者均保守的編碼區(qū)域設(shè)計(jì)定量PCR引物 （表1）。以團(tuán)頭魴、翹嘴鲌和魴鲌F(tuán)1反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板,以管家基因β-Actin作為內(nèi)參,SYBR GreenⅠ（美國ThermoFisher Scientific公司）為 mix,在ABI 7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析。反應(yīng)條件:50℃5 min;95℃10 min;95℃15 s,61℃45 s,40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,定量結(jié)果采用2-△△Ct法,用GraphPad Prism 5軟件制圖。

2 結(jié)果

2.1 性腺染色體減數(shù)分裂特征分析

魴鲌F(tuán)1作為雜交子一代,其異源染色體組包括一套來源于母本團(tuán)頭魴的染色體和一套來源于父本翹嘴鲌的染色體。通過對魴鲌F(tuán)1精巢染色體制片結(jié)果的觀察,我們發(fā)現(xiàn)部分分裂相中的48條染色體出現(xiàn)了聯(lián)會(huì)配對的現(xiàn)象（圖1A）,具體表現(xiàn)為形態(tài)大小相近的“同源”染色體兩兩配對,以24個(gè)二價(jià)體的形式存在,推測其為減數(shù)分裂第一次分裂中期的初級精母細(xì)胞染色體。此外,我們也發(fā)現(xiàn)少量分裂相僅含有24條染色體,這些染色體均以“X”的形態(tài)存在,即每條染色體上均含有一對姐妹染色單體（圖1B）,推測此為減數(shù)分裂后產(chǎn)生的次級精母細(xì)胞染色體。上述結(jié)果說明,盡管魴 鲌 F1中含有兩套來源于不同物種的異源染色體組,但其在減數(shù)分裂過程中能進(jìn)行正常的染色體配對和分離,形成染色體數(shù)目減半的次級精母細(xì)胞。

圖1 魴鲌F(tuán)1性腺染色體圖（A）第一次減數(shù)分裂中期初級精母細(xì)胞中48條異源染色體配對;（B）第二次減數(shù)分裂產(chǎn)生的早期次級精母細(xì)胞包含24條“X”形態(tài)染色體。標(biāo)尺:20 μm。Fig.1 Gonadal chromosome distribution in hybrids of M.amblycephala×C.alburnus（A）Forty-eight chromosomes pairing in primary spermatocytes at metaphase of first meiotic division;（B）Twenty-four chromosomes with the morphology of“X”in early secondary spermatocytes produced by the second meiotic division.Bar:20 μm.

2.2 Dmc1和Rec8的序列比較分析

從團(tuán)頭魴和翹嘴鲌已有的基因組數(shù)據(jù)中調(diào)取Dmc1和Rec8基因。其中,團(tuán)頭魴和翹嘴鲌的Dmc1基因編碼區(qū)均為1 029 bp（圖2A）,相似性為99.0%,且均編碼342個(gè)氨基酸（圖2C）,氨基酸序列的相似性為99.4%;Rec8基因的編碼區(qū)均為1 713 bp（圖2B）,相似性為98.5%,均編碼570個(gè)氨基酸（圖2D）,氨基酸序列的相似性為97.8%。這兩個(gè)基因在兩個(gè)物種中的相似性極高,但存在明顯的SNP位點(diǎn)差異,故利用這些差異的SNP位點(diǎn)對雜交子代進(jìn)行基因的遺傳分析。

圖2 團(tuán)頭魴與翹嘴鲌中Dmc1和Rec8基因的核苷酸及所編碼蛋白質(zhì)的多序列比對結(jié)果（A）Dmc1基因的編碼區(qū)序列比對;（B）Rec8基因的編碼區(qū)序列比對;（C）Dmc1基因所編碼蛋白質(zhì)的多序列比對;（D）Rec8基因所編碼蛋白質(zhì)的多序列比對。Fig.2 The nucleotide and amino acid sequence alignment of Dmc1 and Rec8 genes in M.amblycephala and C.alburnus（A）The nucleotide sequence alignment of Dmc1 gene;（B）The nucleotide sequence alignment of Rec8 gene;（C）The amino acid sequence alignment of Dmc1;（D）The amino acid sequence alignment of Rec8.

分別從5條魴鲌F(tuán)1的cDNA中克隆Dmc1和Rec8基因并測序,結(jié)果顯示:在測序的Dmc1基因中,50%（14/28）的序列與團(tuán)頭魴的完全一致,10.71%（3/28）的序列與翹嘴鲌的完全一致,而39.29%（11/28）的序列為重組型序列;在檢測的Rec8基因中,50%（11/22）的序列與團(tuán)頭魴的完全一致,4.54%（1/22）的序列與翹嘴鲌的完全一致,而45.45%（10/22）的序列為重組型序列。上述結(jié)果表明,Dmc1和Rec8存在較大程度的基因重組,并且魴鲌F(tuán)1中表達(dá)的這兩個(gè)基因在結(jié)構(gòu)上更偏向于其母本團(tuán)頭魴。

2.3 Dmc1和Rec8的系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過構(gòu)建進(jìn)化樹,我們分析了團(tuán)頭魴、翹嘴鲌與其他魚類的親緣關(guān)系。結(jié)果如圖3所示,在Dmc1和Rec8基因構(gòu)建的進(jìn)化樹中,所有的鯉科魚類聚為一支（橙色方框）,其親緣關(guān)系遠(yuǎn)高于其他魚類;此外,在鯉科魚類中,團(tuán)頭魴和翹嘴鲌單獨(dú)聚為一支（紅色方框）,其親緣關(guān)系高于其他鯉科魚類,推測其雜交子代可育與其親緣關(guān)系相近有關(guān)。

圖3 Dmc1和Rec8基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析（A）Dmc1基因的進(jìn)化分析;（B）Rec8基因的進(jìn)化分析。橙色方框表示鯉科魚類,紅色方框表示團(tuán)頭魴和翹嘴鲌聚為一支,親緣關(guān)系較近。Fig.3 The phylogenetic analysis of Dmc1 and Rec8 genes（A）The phylogenetic analysis of Dmc1 gene;（B）The phylogenetic analysis of Rec8 gene.The orange boxes highlight cyprinid fish,and red boxes show that the relationship between M.amblycephala and C.alburnus is closer.

2.4 Dmc1和Rec8的基因表達(dá)分析

團(tuán)頭魴、翹嘴鲌及魴鲌F(tuán)1中Dmc1和Rec8基因的熒光定量檢測結(jié)果如圖4所示,兩個(gè)基因均正常表達(dá)。在Dmc1表達(dá)上,魴鲌F(tuán)1的表達(dá)水平略低于團(tuán)頭魴和翹嘴鲌,但無顯著性差異（P>0.05）;在Rec8表達(dá)上,魴鲌F(tuán)1與團(tuán)頭魴之間存在顯著性差異（P<0.05）,但與翹嘴鲌無顯著性差異,且魴鲌F(tuán)1的表達(dá)水平介于團(tuán)頭魴和翹嘴鲌之間。這些結(jié)果說明,魴鲌F(tuán)1中Dmc1和Rec8基因的正常表達(dá)可能是保證其正常進(jìn)行減數(shù)分裂的重要原因。

圖4 Dmc1和Rec8基因在團(tuán)頭魴、翹嘴鲌和魴鲌F(tuán)1精巢的表達(dá)ns表示無顯著性差異（P>0.05）;**表示有顯著性差異（P<0.05）。Fig.4 The expression of Dmc1和Rec8 genes in the testis of M.amblycephala,C.alburnus and their hybrid fish（BTF1）ns represents no significant difference between BTF1and its parents（P>0.05）;**represents significant difference between BTF1 and its parents（P<0.05）.

3 討論

生殖隔離提出,不同物種間雜交難以獲得存活后代或獲得的雜交后代不可育,如在高等動(dòng)物中雜種雄性不育是普遍存在的現(xiàn)象[9];而在低等動(dòng)物中,已有研究證明許多物種都是起源于自然雜交事件[20]。自然界中已有記載的魚類超過32 500種,是脊椎動(dòng)物中最多的一類[21]。最近的研究表明,很多魚類是通過自然雜交形成的,如:紅鯽[7]和鯉[8]的基因組解析證明,兩者均為包含多套亞基因組的異源多倍體魚,這間接證明了其雜交起源。繁多的種類加上獨(dú)特的體外受精方式,使得魚類雜交實(shí)驗(yàn)廣泛進(jìn)行。在眾多的遠(yuǎn)緣雜交組合中,目前人們僅發(fā)現(xiàn)少數(shù)兩性可育的雜交種[22]。兩性可育的雜交物種是雜交優(yōu)勢在育種工作中延續(xù)的關(guān)鍵,也是雜交品系建立的關(guān)鍵。本課題組利用雌性團(tuán)頭魴與雄性翹嘴鲌的屬間雜交,獲得了兩性可育的魴鲌雜交魚子一代,并通過其連續(xù)自交建立了魴鲌雜交品系（BTF1-BTF6）,打破了遠(yuǎn)緣雜交的生殖障礙,也為探索遠(yuǎn)緣雜交的遺傳和繁殖規(guī)律提供了寶貴的研究材料。

目前已有的報(bào)道大多是研究雜交種的不育性[23],而雜交種為什么可育的科學(xué)問題被研究的相對較少,這可能在于很難獲得可育的雜交種材料。本文對魴鲌F(tuán)1雜交魚的減數(shù)分裂進(jìn)行了初步研究。在細(xì)胞學(xué)方面,制備了魴鲌F(tuán)1的精巢染色體,觀察到減數(shù)第一次分裂中期存在“同源”染色體配對現(xiàn)象,具體表現(xiàn)為來源于團(tuán)頭魴和翹嘴鲌的兩套異源染色體形成了24個(gè)二價(jià)體的形式;同時(shí)也觀察到了第一次減數(shù)分裂形成的次級精母細(xì)胞的染色體,具體表現(xiàn)為24個(gè)“X”形態(tài)染色體。實(shí)際上,減數(shù)分裂過程正常進(jìn)行的關(guān)鍵在于第一次減數(shù)分裂過程中的同源染色體聯(lián)會(huì)配對與分離。本研究結(jié)果證明了魴鲌雜交魚能進(jìn)行正常的第一次減數(shù)分裂,并形成次級精母細(xì)胞。張純等[12]在異源四倍體鯽鯉中發(fā)現(xiàn),異源四倍體的染色體在減數(shù)分裂過程中是以100個(gè)二價(jià)體的形式存在,而不是以25個(gè)四價(jià)體的形式存在,且未觀察到單價(jià)體或多價(jià)體的存在;而在三倍體湘云鯽中,除了二價(jià)體,未配對的單價(jià)體也有存在,因此聯(lián)會(huì)紊亂可能是三倍體不育的重要原因。我們推測,魴鲌F(tuán)1中兩套“同源”染色體在減數(shù)分裂過程中能進(jìn)行正常的聯(lián)會(huì)配對和分離可能是該雜交魚可育的原因之一。

為研究魴鲌雜交魚在減數(shù)分裂中“同源”染色體能正常進(jìn)行聯(lián)會(huì)配對和分離的相關(guān)機(jī)制,我們對與減數(shù)分裂有關(guān)的Dmc1和Rec8基因進(jìn)行了相關(guān)研究。雖然這兩個(gè)基因是在酵母中發(fā)現(xiàn)的,但目前的報(bào)道已確認(rèn)其在魚類的減數(shù)分裂過程中也起到重要的作用[24～26]。本文對Dmc1和Rec8的結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化及表達(dá)水平進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示,在團(tuán)頭魴和翹嘴鲌之間,這兩個(gè)基因的序列相似性極高,兩者的親緣關(guān)系最近,并且雜交魚中的基因表達(dá)未見異常,推測魴鲌雜交魚可育的主要原因是其能夠順利地進(jìn)行減數(shù)分裂過程,即能進(jìn)行正常的減數(shù)分裂調(diào)控。根據(jù)以上結(jié)果,我們推測團(tuán)頭魴和翹嘴鲌的雜交后代可育是由于其關(guān)鍵基因間具有高度的相似性。在減數(shù)分裂過程中,那些差異的SNP位點(diǎn)不影響基因的正常表達(dá)和蛋白質(zhì)的相互識別與作用,異源基因之間可能能夠互相調(diào)控,從而共同推進(jìn)減數(shù)分裂的進(jìn)程。

綜上所述,本研究制備了異源二倍體雜交魴鲌F(tuán)1的性腺染色體,觀察到明顯的異源染色體配對形成二價(jià)體,并分離形成含有單價(jià)體的次級精母細(xì)胞,直接證明了異源二倍體雜交魴鲌能夠進(jìn)行正常的“同源”染色體配對和分離,這可能是魴鲌雜交魚能夠進(jìn)行正常減數(shù)分裂的原因之一。此外,本文對在減數(shù)分裂過程中起重要作用的Dmc1和Rec8基因的序列、表達(dá)及系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行了分析,揭示了其在團(tuán)頭魴和翹嘴鲌這兩個(gè)物種中具有極高的相似性,這可能是魴鲌雜交魚能夠進(jìn)行正常減數(shù)分裂的另一個(gè)重要原因。總的來講,本文初步探討了魴鲌雜交魚染色體減數(shù)分裂過程的特征及相關(guān)基因的表達(dá)情況,為揭示雜交品系形成乃至雜交物種形成提供了重要的證據(jù),同時(shí)也將為雜交育種工作提供重要的理論指導(dǎo)。