柴胡皂苷A上調(diào)HO-1對(duì)新生大鼠神經(jīng)OGD/R損傷的影響

何 靜，王玨嵐，鄒福蘭，梁小明，陳 燕

1)四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院；四川省人民醫(yī)院兒科 成都 610031 2)四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院；四川省人民醫(yī)院腫瘤科 成都 610031 3)四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院；四川省人民醫(yī)院門(mén)診兒科 成都 610031

缺血缺氧性腦病是新生兒死亡和不可逆腦損傷的主要病因[1]。低溫治療等干預(yù)手段已大大改善了缺血缺氧性腦病新生兒的結(jié)局，但是，仍有大量新生兒死亡或遭受?chē)?yán)重的腦損傷。缺血/缺氧和再灌注/復(fù)氧會(huì)引發(fā)自由基的產(chǎn)生，包括活性氧(reactive oxygen species，ROS)、過(guò)氧化氫和其他羥基自由基[2]，而自由基引起的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞壞死和凋亡[3]。柴胡皂苷A(saikosaponin A，SSa)可以通過(guò)抑制核因子κB等抑制炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)[4]。SSa也可濃度依賴地上調(diào)核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid derived 2-like 2,Nrf2)和其靶分子血紅素加氧酶1(heme oxygenase-1,HO-1)，緩解小鼠子宮內(nèi)膜癌癥狀[5]。本研究中，我們分離了新生大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞建立體外氧-葡萄糖剝奪/復(fù)氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)模型，觀察SSa對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，以探索SSa在腦缺血缺氧損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)新生SD大鼠(出生2 d內(nèi)，由四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)斷頭，分離海馬神經(jīng)細(xì)胞，在2.5 g/L胰蛋白酶(美國(guó)Sigma公司)中于37 ℃輕輕搖動(dòng)消化20 min。將細(xì)胞懸浮于DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)HyClone公司)中，該培養(yǎng)基含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、體積分?jǐn)?shù)10%馬血清、10 g/L L-谷氨酰胺(均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司)和100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素(美國(guó)HyClone公司)。細(xì)胞接種在15 mm共聚焦皿上，每皿5×105個(gè)，該皿用0.1 g/L聚D-賴氨酸(美國(guó)Sigma公司)包被。2 h后，用含有體積分?jǐn)?shù)2%神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)補(bǔ)充劑B27(美國(guó)Gibco公司)、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素和2.5 g/L谷氨酰胺的神經(jīng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基代替共聚焦皿的培養(yǎng)基。之后，每4 d更換1 mL培養(yǎng)基[6]。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理實(shí)驗(yàn)Ⅰ：分為OGD/R組、OGD/R+SSa 2.5 mol/L組、OGD/R+SSa 5.0 mol/L組、OGD/R+SSa 10.0 mol/L組，另設(shè)未經(jīng)OGD/R和加藥處理的細(xì)胞作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)Ⅱ：細(xì)胞分為對(duì)照組、OGD/R組、OGD/R+SSa 5 mol/L組以及OGD/R+SSa 5 mol/L+ML385(Nrf2信號(hào)通路抑制劑)2 mol/L組。OGD/R:海馬神經(jīng)細(xì)胞在厭氧室(體積分?jǐn)?shù)1%CO2、5%CO2、94%N2孵育)、不含葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)HyClone公司)中于37 ℃孵育12 h，以模仿缺血缺氧；此后，在常氧條件、正常培養(yǎng)基中孵育24 h，以確保復(fù)氧[7]。對(duì)于除CCK-8實(shí)驗(yàn)以外的給藥處理，按1×106個(gè)/孔將細(xì)胞接種于6孔板，分別于缺氧前2 h和復(fù)氧后給藥，復(fù)氧給藥后24 h檢測(cè)各指標(biāo)。其中，SSa(純度≥98%；貨號(hào)Y0001932)和ML385(純度≥98%；貨號(hào)SML1833)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.3 海馬神經(jīng)細(xì)胞活力的測(cè)定CCK-8試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。將海馬神經(jīng)細(xì)胞以5×103個(gè)/孔的密度接種在含100 μL培養(yǎng)基的96孔板中，12 h后OGD/R組行OGD/R處理，不經(jīng)OGD/R處理的更換50 μL正常培養(yǎng)基。于接種后的第48 h分別更換含1 μL PBS的50 μL培養(yǎng)基或SSa，在37 ℃孵育22 h。將10 μL CCK-8溶液添加到培養(yǎng)物中，并在37 ℃孵育2 h。使用酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)光密度值，以背景校正后的處理組與對(duì)照組的百分比計(jì)算細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

1.4 海馬神經(jīng)細(xì)胞ROS水平的測(cè)定使用探針2,7-二氯熒光素二乙酸鹽(DCFH-DA；南京建成生物工程研究所)，根據(jù)說(shuō)明書(shū)測(cè)量細(xì)胞內(nèi)ROS水平。將經(jīng)1.2所述處理的各組細(xì)胞與10 μmol/L DCFH-DA在黑暗中于37 ℃孵育30 min。然后，將細(xì)胞重懸于500 μL PBS中，并置于FACS Calibur流式細(xì)胞儀中，設(shè)置488 nm激發(fā)和521 nm發(fā)射波長(zhǎng)，測(cè)量熒光強(qiáng)度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 海馬神經(jīng)細(xì)胞MDA水平的測(cè)定將各組海馬神經(jīng)細(xì)胞在PBS(pH=7.4)中勻漿，然后在4 ℃下以3 000×g離心5 min。取上清液使用MDA試劑盒(南京建成生物工程研究所)測(cè)定MDA的水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 海馬神經(jīng)細(xì)胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、Nrf2和HO-1等凋亡和氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的測(cè)定使用NE-PER核和細(xì)胞質(zhì)提取試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)提取核蛋白和細(xì)胞質(zhì)。使用BCA蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)對(duì)細(xì)胞質(zhì)和核提取物中的蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行定量。將等量的蛋白質(zhì)樣品(每泳道30 μg)通過(guò)100 g/L SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，50 g/L脫脂牛奶中封閉1 h。將膜與Bcl-2、Bax、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、Nrf2、HO-1、Iamin B1(內(nèi)參)、GAPDH(內(nèi)參)一抗孵育過(guò)夜，然后與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(美國(guó)Abcam公司)孵育。最后，使用ECL檢測(cè)試劑(德國(guó)GE Healthcare公司)將膜上的蛋白條帶可視化，并通過(guò)Image J測(cè)定條帶的灰度值，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量取目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參條帶灰度值的比值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prism 6分析結(jié)果。各組間細(xì)胞活力、ROS、MDA、Bax/Bcl-2、Cleaved-Caspase-3/Caspase-3、Nrf2和HO-1水平等的比較使用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞活力的比較與對(duì)照組比較，其他4組細(xì)胞活力降低；與OGD/R組比較，2.5、5.0和10.0 mol/L SSa與OGD/R共處理組細(xì)胞活力升高(表1)。

表1 各組細(xì)胞活力的比較 %

2.2 各組細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果與對(duì)照組比較，其他4組Bax/Bcl-2和Cleaved-Caspase-3/Caspase-3升高，MDA和ROS上升；而與OGD/R組比較，2.5、5.0和10.0 mol/L SSa與OGD/R共處理組上述指標(biāo)均降低(圖1、表2)。

1：對(duì)照組；2：OGD/R組；3：OGD/R+SSa 2.5 mol/L組；4：OGD/R+SSa 5.0 mol/L組；5：OGD/R+SSa 10.0 mol/L組

2.3 各組細(xì)胞中Nrf2、HO-1蛋白的檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組比較，其他4組Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平升高；與OGD/R組比較，5.0、10.0 μmol/L SSa與OGD/R共處理組Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平升高(圖2、表3)。

1：對(duì)照組；2：OGD/R組；3：OGD/R+SSa 2.5 mol/L組；4：OGD/R+SSa 5.0 mol/L組；5：OGD/R+SSa 10.0 mol/L組

表3 各組細(xì)胞Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的比較

2.4 各組細(xì)胞活力、ROS、MDA、Cleaved-Caspase-3/Caspase-3、Nrf2的檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照組比較，OGD/R組細(xì)胞活力下降，ROS、MDA、Nrf2、Cleaved-Caspase-3/Caspase-3升高；與OGD/R組比較，OGD/R+SSa 5 mol/L組細(xì)胞活力升高，ROS和MDA降低，Nrf2進(jìn)一步升高，Cleaved-Caspase-3/Caspase-3降低；與OGD/R+SSa 5 mol/L組比較，OGD/R+SSa 5 mol/L+ML385 2 mol/L組細(xì)胞活力下降，ROS和MDA升高，Nrf2表達(dá)下降，Cleaved-Caspase-3/Caspase-3升高(圖3、表4)。

1：對(duì)照組；2：OGD/R組；3：OGD/R+SSa 5 mol/L組；4：OGD/R+SSa 5 mol/L+ML385 2 mol/L組

表4 4組細(xì)胞活力、ROS、MDA、Cleaved-Caspase-3/Caspase-3、Nrf2的比較

3 討論

氧化應(yīng)激以及其導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞壞死和凋亡是缺血缺氧性腦病的關(guān)鍵致病機(jī)制。缺血缺氧發(fā)生后，氧化應(yīng)激被誘導(dǎo)，短時(shí)間內(nèi)就可能導(dǎo)致細(xì)胞壞死，并啟動(dòng)持續(xù)的炎癥、氧化應(yīng)激和凋亡，相互促進(jìn)，造成不可逆的神經(jīng)損傷[8]。盡管已經(jīng)有各種治療措施，但缺血缺氧導(dǎo)致的神經(jīng)損傷依然是新生兒致殘和致死的主要原因[9]。SSa具有抗氧化應(yīng)激、抗炎和抗凋亡的作用。在這項(xiàng)研究中我們發(fā)現(xiàn)，SSa可顯著抑制OGD/R誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡。潛在的機(jī)制與其對(duì)海馬神經(jīng)細(xì)胞Nrf2途徑的調(diào)節(jié)作用有關(guān)。

在缺血缺氧性腦病中，氧化應(yīng)激是最主要的病理刺激[1]。SSa具有激活Nrf2的功能，在煙草導(dǎo)致的小鼠肺炎模型中，SSa通過(guò)上調(diào)Nrf2/HO-1抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)[9]。藥動(dòng)學(xué)研究[10]表明，SSa給藥后在腦內(nèi)的藥物濃度高于血漿。因此，SSa可能對(duì)新生兒缺血缺氧性腦病中氧化應(yīng)激反應(yīng)具有抑制作用，尤其是通過(guò)Nrf2/HO-1通路。我們的結(jié)果表明，SSa可誘導(dǎo)OGD/R海馬神經(jīng)細(xì)胞Nrf2核蓄積以及HO-1的表達(dá)，而Nrf2信號(hào)逆轉(zhuǎn)了SSa對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。這些發(fā)現(xiàn)表明，SSa通過(guò)激活Nrf2信號(hào)對(duì)OGD/R誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

凋亡持續(xù)是新生兒缺血缺氧性腦病導(dǎo)致不可逆神經(jīng)損傷的根源，因此，抑制凋亡是治療該病的重要途徑[1]。柴胡皂苷D等類似物在腫瘤細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)具有促凋亡作用[11]；然而，在神經(jīng)細(xì)胞中，柴胡皂苷類可能通過(guò)抑制糖皮質(zhì)激素受體和調(diào)節(jié)Bax抑制凋亡[12]。此外，SSa也可能通過(guò)對(duì)氧化應(yīng)激和炎癥的調(diào)控，間接抑制凋亡。SSa通過(guò)多種途徑抑制炎癥，如在高血脂型胰腺炎中通過(guò)抑制NF-κB減輕炎癥[4]。氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)均能誘導(dǎo)凋亡，從而導(dǎo)致缺血/再灌注損傷[8]。我們的結(jié)果表明，SSa可改善OGD/R引起的海馬神經(jīng)細(xì)胞活力降低。同時(shí)，SSa導(dǎo)致Cleaved-Caspase-3/Caspase-3和Bax/Bcl-2比值降低，這表明SSa具有抗凋亡作用。

本文存在一些局限性。首先，整個(gè)實(shí)驗(yàn)并沒(méi)有探索SSa對(duì)新生大鼠缺血缺氧的保護(hù)作用。其次，炎癥的激活可能是氧化應(yīng)激和凋亡持續(xù)的一個(gè)動(dòng)因，而本研究對(duì)炎癥的研究不足。因此，SSa對(duì)新生兒缺血缺氧性腦病的保護(hù)作用，還有待深入研究。

總之，SSa可通過(guò)激活Nrf2/HO-1信號(hào)通路、抑制凋亡來(lái)保護(hù)海馬神經(jīng)細(xì)胞免受OGD/R損傷。