隱源性卒中患者腸道炎癥及腸道屏障的變化

項舒雅，崔慧麗，劉 晗，夏丹豪，滕軍放，王雪晶

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內科 鄭州 450052 2)河南省高等學校臨床醫(yī)學重點學科開放實驗室 鄭州 450052

隱源性卒中(cryptogenic stroke，CS)，亦稱原因不明性卒中，是指常規(guī)臨床檢查不能明確病因的缺血性卒中[1]，有較高的患病率、致殘率及致死率，占缺血性卒中的10%～40%[2-3]，在中青年中也較為常見。有研究[4-5]表明腸道菌群紊亂影響體內自身免疫及炎癥水平，參與缺血性卒中的發(fā)生和發(fā)展。此外腸道屏障的顯著改變增加了腸道的通透性，加劇炎性因子及自身抗原進入血液循環(huán)，導致全身慢性炎癥狀態(tài)，進而導致靶器官的損害并增加心腦血管疾病風險[6]。近年來研究[7]發(fā)現(xiàn)，腸道炎癥可引起腦梗死進一步加重，腦卒中患者常伴有便秘、腹瀉等腸道癥狀，提示腸道炎癥可能參與CS的發(fā)生發(fā)展。然而目前有關CS與腸道炎癥的研究相對較少，因此我們對CS患者腸道炎癥標記物糞鈣衛(wèi)蛋白(fecal calprotectin,FC)及糞乳鐵蛋白(fecal lactoferrin,FLF)水平及腸組織緊密連接蛋白ZO-1及Occludin表達水平進行了分析，以探討CS的發(fā)病機制。

1 對象與方法

1.1 研究對象收集2018年10月至2020年6月于鄭州大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內科就診并診斷為CS的患者53例，男24例，女29例，年齡29～70(47.0±9.0)歲。納入標準：①符合文獻[8]的缺血性腦卒中診斷標準，通過頭部MRI或CT檢查證實為腦梗死患者。②入院后依據(jù)類肝素藥物治療急性缺血性腦卒中試驗分型符合CS標準的患者。③入院后完善頸部血管超聲、頭頸部CT血管成像、經(jīng)顱多普勒超聲、心電圖、血常規(guī)、肝腎功能及血凝試驗等檢查。排除標準：①經(jīng)檢查發(fā)現(xiàn)明確的病因(腦動脈狹窄、血液系統(tǒng)疾病及房顫、風濕性心臟病等心臟器質性疾病等)。②嚴重的感染、肝腎功能不全、嚴重心肺疾患等。53名同期來該院體檢健康的志愿者作為對照，其中男26例，女27例，年齡21～71(45.5±12.3)歲。8例CS患者及5例對照行腸鏡檢查及腸組織活檢。記錄所有受試者基本信息包括性別、年齡、既往史、個人史等。CS患者在入院后由同一位神經(jīng)內科醫(yī)師進行美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)評分并記錄。本研究經(jīng)過鄭州大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，所有受試者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 糞便標本采集及FC、FLF檢測對照組留取晨首次糞便標本，CS組患者入院后留取糞便標本，取樣后放入無菌塑料管中，保存于-80 ℃冰箱。檢測前標本在室溫下解凍，按照糞便質量與PBS體積比1∶9進行配比，用勻漿器充分勻漿，5 000×g離心10 min，取上清液進行檢測。使用Elabscience公司生產(chǎn)的ELISA試劑盒，按照常規(guī)操作流程進行檢測，檢測前將試劑盒平衡至室溫，讀數(shù)前15 min開啟酶標儀預熱，用酶標儀測450 nm波長處的光密度值，通過繪制標準曲線計算出樣品中FC和FLF的含量。

1.3 腸組織HE染色觀察在全麻和心電監(jiān)護狀態(tài)下使用電子腸鏡、活檢鉗留取受試者直腸和乙狀結腸交界處組織標本。術后密切監(jiān)測受試者生命體征。組織標本置于40 g/L多聚甲醛溶液中固定24 h，梯度乙醇脫水、透明，石蠟包埋，4 μm厚切片，常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察組織病理學變化。

1.4 腸組織中ZO-1及Occludin蛋白表達的檢測取腸組織切片，置于60 ℃恒溫箱烘烤120 min,二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水,將體積分數(shù)3%的H2O2去離子水滴于切片上以封閉內源性過氧化物酶,然后將切片置于檸檬酸鈉緩沖液中進行高溫高壓抗原修復5 min,室溫放置2 min后，用PBS洗滌。在切片上滴加正常山羊血清封閉內源性抗體,隨后分別滴加一抗工作液(抗ZO-1、Occludin抗體均購自Invitrogen公司,1∶1 000稀釋),室溫下孵育過夜。PBS漂洗5次，每次3 min。滴加辣根過氧化物酶標記的二抗工作液(山羊抗小鼠IgG購自Abcam公司,1∶800稀釋),室溫下孵育30 min,PBS洗滌3次。DAB顯色,蘇木精復染,脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片，晾干后在Olympus IX51顯微鏡下觀察。陽性染色為棕褐色、棕黃色，呈顆粒狀或團塊狀。于200倍鏡下選取4個視野，采用Image J軟件測量積分光密度值(integrate option density，IOD)，結果取均值。

1.5 統(tǒng)計學處理采用SPSS 26.0進行數(shù)據(jù)分析。CS組與對照組糞便FC和FLF含量不符合正態(tài)分布，采用中位數(shù)(下、上四分位數(shù))描述，應用Mann-WhitneyU檢驗進行比較；應用兩獨立樣本t檢驗比較兩組腸組織中Occludin和ZO-1蛋白表達水平的差異；應用Spearman相關分析CS患者糞便FC、FLF含量與NIHSS評分的相關性。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 兩組腸道炎癥標記物檢測結果見表1。CS組糞便FC、FLF含量高于對照組。

表1 兩組糞便FC、FLF含量比較 μg/g

2.2 兩組腸組織病理觀察結果見圖1。對照者的腸黏膜完整，無炎性細胞浸潤。而CS患者的腸上皮細胞受損，部分腸黏膜完整性破壞，伴有大量炎性細胞浸潤。

圖1 對照組(A)與CS組(B)腸組織病理表現(xiàn)(HE,×200)

2.3 兩組腸組織中ZO-1及Occludin蛋白表達比較結果見圖2及表2。與對照相比，CS患者的腸組織中緊密連接蛋白ZO-1及Occludin表達水平降低，并伴有腸黏膜的完整性破壞。

A：對照組；B：CS組；1:Occludin；2:ZO-1

表2 兩組腸組織中Occludin和ZO-1蛋白IOD比較

2.4 CS患者腸道炎癥標記物與NIHSS評分相關性分析CS組糞便FLF、FC含量均與NIHSS評分(7.9±3.5)存在正相關(r=0.325，P=0.018；r=0.339，P=0.013)。

3 討論

近年來，腸道炎癥與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的聯(lián)系受到越來越多的關注[9]。據(jù)報道[10-12]，腸道炎癥患者卒中發(fā)生風險明顯增加。研究[13]發(fā)現(xiàn),在缺血性腦卒中癥狀出現(xiàn)之前已有部分腸道菌群從腸道易位到血液。糾正腸道菌群紊亂和減少腸道炎癥反應可能有助于中風后腦組織損傷的修復和神經(jīng)功能的恢復。

既往研究[14]表明，糞便中的腸道炎癥標志物可作為預測炎性腸病風險、嚴重程度及預后的一種方法，包括FC、FLF。本研究結果表明，CS患者糞便FC和FLF含量均高于對照。腸黏膜損傷及腸道炎癥可以導致黏膜中炎性細胞浸潤，進而促使中性粒細胞脫顆粒將FC、FLF排至腸腔中，導致其在糞便中的含量增高[15]。據(jù)報道[16-17]，F(xiàn)C、FLF具有較強穩(wěn)定性和抗酶降解性，其含量與腸道炎癥程度具有相關性。本研究結果提示，CS患者存在腸道炎癥反應，且腸道炎癥指標與CS患者神經(jīng)功能缺損程度之間存在正相關。

既往研究[18]表明腸道炎癥與腸道屏障功能喪失、微生物易位和全身免疫有關。失調的腸道菌群可以引起腸黏膜中緊密連接蛋白ZO-1及Occludin表達的改變，進而導致腸上皮屏障受損，腸道通透性增加[19]。緊密連接蛋白Occludin和ZO-1是構成腸黏膜屏障的主要成分，其表達減少可在一定程度上反映腸道屏障破壞[20]。據(jù)報道[21]，炎性腸病患者通過炎性細胞因子影響緊密連接蛋白的功能，進而使腸黏膜的完整性受到破壞，腸道通透性增加。本研究采用腸組織活檢，在顯微鏡下觀察到CS患者腸黏膜上皮存在較多炎性細胞浸潤，腸黏膜完整性破壞；同時，與對照相比，CS患者腸黏膜中ZO-1及Occludin表達顯著減少。這些結果進一步表明CS患者存在腸道炎癥及腸黏膜屏障通透性改變。

據(jù)報道[22]，在慢性腸道炎癥過程中，病原微生物產(chǎn)生的毒素增加了腸道通透性，向外周血釋放促炎細胞因子增加，進而導致全身炎癥。由此猜想腸道炎癥與CS可能存在以下聯(lián)系：腸道炎癥時腸黏膜炎性細胞浸潤、腸黏膜屏障破壞及腸道通透性增加，細菌等有害物質可通過受損的腸上皮屏障進入外周血液循環(huán)系統(tǒng)，刺激機體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應答，導致血腦屏障破壞，進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎性細胞因子增加，導致高凝血狀態(tài)和血栓形成，最終導致卒中發(fā)生。由于條件限制，我們的研究存在些許不足。首先，這是一個橫斷面研究，我們并不能完全確定這些發(fā)現(xiàn)之間的因果關系，腸道炎癥可引起或加重腦卒中，腦卒中也同樣可以引起腸道缺血、腸道屏障破壞，兩者相互促進，形成惡性循環(huán)。其次，我們的樣本量相對較小，可能導致結果偏倚。需要通過大規(guī)模、前瞻性的隨訪研究來驗證我們的結果。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)，與對照相比，CS患者糞便FC、FLF含量增高，存在腸道炎癥及腸道屏障改變，且腸道炎癥指標與神經(jīng)功能缺損程度相關，這可能為腦卒中的篩查、治療及預后判斷提供了一個新的方向。