SLC26A3在結(jié)直腸癌中的表達、功能及影響機制探討

陳向金,楊柳,李變利,彭穎,黃俊凱,徐麗紅

(1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院,新疆 石河子 832000;2 內(nèi)江市第一人民醫(yī)院,四川 內(nèi)江 641000;3 成都市第五人民醫(yī)院消化內(nèi)科,四川 成都 611130;4 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,新疆 石河子 832000)

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer)是常見的消化道腫瘤,在我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率均保持上升趨勢,發(fā)病率為376.3/10萬,死亡率為191.0/10萬[1],其臨床表現(xiàn)主要有腹痛、黏液血便、排便習(xí)慣改變等,其中排便習(xí)慣改變最常見[2]。

SLC26A3(又稱DRA)最早通過基因消減雜交技術(shù)對比匹配正常結(jié)腸組織和結(jié)腸癌組織的cDNA基因文庫后被確定為結(jié)腸癌的抑癌基因[3]。該基因主要表達在結(jié)腸正常黏膜組織,在結(jié)腸癌組織和結(jié)腸癌細胞系中表達明顯降低,故其蛋白質(zhì)產(chǎn)物最開始被命名為DRA(downregulated in adenoma),既往研究認為DRA的下調(diào)與結(jié)腸癌的進展具有相關(guān)性[4]。研究表明[5],DRA是位于結(jié)腸上皮頂端細胞膜上陰離子交換體,主要負責(zé)Cl-跨膜吸收和HCO3-的分泌,并參與維持腸黏液層的通透性及穩(wěn)定性[6],PI3K/ AKT信號通路的活化是SLC26A3從細胞內(nèi)向細胞膜轉(zhuǎn)移定位的條件之一,通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路可提高細胞頂端膜SLC26A3的蛋白表達和Cl-/OH-離子交換活性[7]。既往研究提示,結(jié)腸癌患者中,腸道PI3K/AKT信號通路存在異?；钴S[8]。那么,在結(jié)直腸癌患者中,SLC26A3的表達改變對其遠期預(yù)后和臨床特征是否有影響?PI3K/AKT信號通路活躍對SLC26A3蛋白表達最終是發(fā)揮了何種作用?本研究欲對這些問題進行探索和分析。

1 材料與方法

1.1 材料

Caco-2人結(jié)直腸腺癌細胞,購自中國科學(xué)院細胞庫。MEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司,胎牛血清、胰蛋白酶(Trypsin-EDTA)購自美國Hyclone公司,IGF-1購自美國Peprotech公司,LY294002購自美國APExBIO公司,兔抗人p-PI3K、p-AKT抗體購自美國 Cell Signaling Technology公司,兔抗人SLC26A3抗體購自英國Abcam公司,小鼠抗β-actin、GAPDH單克隆抗體、山羊抗兔、小鼠IgG/辣根酶標(biāo)記二抗購自北京中杉金橋生物科技有限公司,SuperSignal Western Blot Enhancer發(fā)光試劑購自美國Thermo Fisher公司。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)庫信息挖掘

通過對Oncomine,GEPIA,cBioportal,Genecards數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)挖掘,我們探索了SLC26A3在腫瘤疾病尤其是結(jié)直腸腺癌及相應(yīng)正常組織細胞中的表達情況,并分析了調(diào)控SLC26A3的相關(guān)因素。此外,我們還對SLC26A3與結(jié)直腸腺癌患者的臨床特征和預(yù)后的關(guān)系進行了探索以及通過分析單細胞測序數(shù)據(jù)庫CancerSEA研究SLC26A3在結(jié)直腸癌中的功能。

1.2.2 Caco-2細胞培養(yǎng)

Caco-2細胞培養(yǎng)于含20%FBS胎牛血清的MEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng),MEM培養(yǎng)基(GIBCO,貨號41500034,添加NaHCO3 1.5 g·L-1,Sodium Pyruvate 0.11 g·L-1),80%;優(yōu)質(zhì)胎牛血清,20%。氣相:空氣,95%;二氧化碳,5%。溫度:37攝氏度。細胞融合度為80%～90%時傳代,傳代后細胞貼壁較慢,48 h內(nèi)不要換液;細胞形態(tài)不均一,有一些含有液泡的巨大細胞,屬正常現(xiàn)象;消化時間3～5 min。

1.2.3 Western Blot法檢測Caco-2細胞中p-PI3K、p-AKT與SLC26A3的表達

Caco-2細胞經(jīng)PI3K激動劑或抑制劑處理12 h后,使用細胞裂解液抽提細胞總蛋白,經(jīng)BCA法測蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳(80 V,2 h),半干法轉(zhuǎn)膜(20 V,90 min)后室溫下5%脫脂奶粉溶液封閉2～4 h,使用5%BSA溶液稀釋p-PI3K(1∶1 000)與p-AKT(1∶1 000)一抗,5%脫脂牛奶稀釋SLC26A3(1∶1 000)與GAPDH(1∶1 000)一抗,山羊抗兔、鼠二抗稀釋比例均為(1∶20 000)。一抗免疫反應(yīng)4 ℃過夜,洗膜后二抗免疫反應(yīng)2-4 h,經(jīng)TBST洗膜后暗室顯色、膠片曝光,采圖后經(jīng)Image J圖像軟件分析灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析,Western Blot灰度值以(±S)表示,采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)比較各組間差異,P＜0.05差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 SLC26A3在結(jié)直腸腫瘤中的表達情況

SLC26A3在結(jié)直腸腫瘤組織中的表達相較正常組織均呈現(xiàn)出較低的表達水平。通過檢索Oncomine數(shù)據(jù)庫,有12項結(jié)直腸癌研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)SLC26A3在腫瘤組織中的表達水平低于正常組織(圖1A)。通過CCLE數(shù)據(jù)庫,對SLC26A3在不同腫瘤細胞系中的mRNA表達情況進行分析發(fā)現(xiàn):SLC26A3在所有腫瘤細胞系中均呈低表達水平,但SLC26A3在結(jié)直腸癌細胞系中的mRNA表達水平位居全部腫瘤細胞系之首(圖1B)。通過檢索GEPIA數(shù)據(jù)庫,我們發(fā)現(xiàn)SLC26A3在結(jié)腸腺癌(COAD)和直腸腺癌(READ)中的表達水平均高于其在其他腫瘤組織中的表達水平。與Oncomine數(shù)據(jù)庫中的發(fā)現(xiàn)相似,GEPIA數(shù)據(jù)庫的結(jié)果同樣提示SLC26A3在結(jié)直腸腺癌中的轉(zhuǎn)錄水平均低于其在正常結(jié)直腸組織中的表達水平(圖1C)。

圖1 SLC26A3在各類腫瘤中的表達情況

2.2 SLC26A3在結(jié)直腸腺癌中的分子與臨床特征(圖2)

基于前述SLC26A3在所有腫瘤類型中的表達情況,我們選取結(jié)腸腺癌和直腸腺癌進行進一步分析。通過cBioportal數(shù)據(jù)庫,我們發(fā)現(xiàn)約10%的結(jié)腸腺癌存在SLC26A3相關(guān)的基因突變或拷貝數(shù)變化;有近5%的直腸腺癌存在SLC26A3相關(guān)的基因突變或拷貝數(shù)變化。值得注意的是,結(jié)腸腺癌的SLC26A3 mRNA低表達水平是其分子學(xué)水平最主要的改變(圖2A)。隨后,我們對SLC26A3在結(jié)直腸腺癌中具體的基因突變和拷貝數(shù)變異類型進行探索,發(fā)現(xiàn)對于基因突變,錯義突變(Missense)是最主要的類型;對于拷貝數(shù)變異,拷貝數(shù)增加(Gain)是最主要的類型(圖2B)。在SLC26A3的臨床特征方面,GEPIA數(shù)據(jù)庫中并未提示結(jié)直腸腺癌的腫瘤組織(紅色:TCGA來源)與相應(yīng)正常組織(灰色:TCGA+GTex來源)相比存在統(tǒng)計學(xué)差異。SLC26A3在不同分期的結(jié)直腸腺癌間亦未發(fā)現(xiàn)明顯差異(P＞0.05)(圖2C、2D)。

圖2 SLC26A3在結(jié)直腸腺癌中的分子學(xué)特征

2.3 SLC26A3對結(jié)直腸腺癌病人預(yù)后的影響

通過GEPIA數(shù)據(jù)庫,我們對SLC26A3高表達水平和低表達水平的病人之間的生存差異進行探索。對于結(jié)腸腺癌病人(圖3A、B),SLC26A3的表達水平對總生存期(P=0.097)和無病生存期(P=0.61)均無影響,但對于總生存期在50個月內(nèi)結(jié)腸腺癌病人,高表達SLC26A3的病人生存率更高。

對于直腸腺癌病人(圖3C、D),SLC26A3的表達水平與總生存期(P=0.36)和無病生存期(P=0.79)亦無明顯相關(guān)性,但對于總生存期在40個月內(nèi)直腸腺癌病人,高表達SLC26A3的病人生存率更高。

圖3 SLC26A3對結(jié)腸腺癌病人的總生存率、無病生存率直腸腺癌病人的總生存率、無病生存率的影響

2.4 SLC26A3在結(jié)直腸癌中的功能

通過對單細胞測序數(shù)據(jù)庫CancerSEA進行分析,我們發(fā)現(xiàn)SLC26A3的表達與結(jié)直腸癌細胞的增殖(P＜0.01)、細胞周期(P＜0.01)以及DNA修復(fù)(P＜0.05)呈負相關(guān)(圖4)。

圖4 CancerSEA單細胞測序數(shù)據(jù)庫中SLC26A3在結(jié)直腸癌中的功能

2.5 Caco-2細胞中PI3K/AKT信號通路對SLC26A3蛋白表達的影響

利用Caco-2細胞給予不同濃度的IGF-1試劑,加藥濃度依次為0.1、0.2、0.4、1、2、3 μg·mL-1。

結(jié)果提示當(dāng)激活PI3K/AKT信號通路時,SLC26A3蛋白表達量隨著IGF-1濃度的增加而增加,增加至0.4 μg·mL-1時達高峰,當(dāng)IGF-1濃度大于0.4 μg·mL-1后,SLC26A3蛋白表達量呈降低趨勢(N:0.427±0.011,0.1∶0.613±0.003,0.2∶0.676±0.001,0.4∶0.976±0.001,1∶0.827±0.001,2∶0.729±0.002,3∶0.497±0.001,P＜0.05)(圖5A)。利用Caco-2細胞,分別給予不同濃度的LY294002試劑,加藥濃度依次為1、2、3、4、5、6 μg·mL-1。

SLC26A3表達量隨著LY294002濃度的增加而減少(N:0.605±0.001,1∶0.787±0.005,2∶0.958±0.002,3∶0.698±0.001,4∶0.756±0.002,5∶0.629±0.007,6∶0.598±0.003,P＜0.05)(圖5B)。

圖5 PI3K/AKT信號通路對SLC26A3的影響

3 討論

SLC26A3最早被發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌中低表達,并且是結(jié)腸癌的抑癌基因[3]。本研究在Oncomine、GEPIA、CCLE數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)其主要表達在結(jié)直腸組織和結(jié)直腸癌細胞中,與先前研究一致。ANTALIS等人[4]發(fā)現(xiàn)SLC26A3 mRNA在所有結(jié)腸腫瘤中的表達水平均低于匹配的正常黏膜,其表達下調(diào)與結(jié)腸腫瘤的Dukes分期呈正相關(guān),在正常黏膜向息肉到腺癌的早期轉(zhuǎn)變中尤為顯著,SLC26A3的表達缺失和下調(diào)分別與隱窩上皮的增殖成分和腫瘤轉(zhuǎn)化有關(guān)。本研究在GEPIA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)Ⅲ期、Ⅳ期結(jié)腸癌患者中SLC26A3表達高于Ⅰ期、Ⅱ期患者但其差異無統(tǒng)計學(xué)意義,Ⅰ期直腸癌患者中SLC26A3的表達水平明顯高于Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期患者,Ⅲ期最低但其差異無統(tǒng)計學(xué)意義。此結(jié)果中直腸癌與ANTALIS等[4]研究結(jié)果相似,但結(jié)腸癌結(jié)果與其結(jié)果相反,這可能提示SLC26A3在直腸癌中的功能改變和結(jié)腸癌不同。

已有研究證實在結(jié)腸上皮細胞SLC26A3作為膜蛋白主要分布在面向腸腔的刷膜一側(cè)[9],SLC26A3的突變可引起先天性失氯性腹瀉,確定SLC26A3是位于腸上皮細胞頂端膜與Cl-跨膜吸收和HCO3-的分泌有關(guān)的溶質(zhì)運載體家族(SLC)26成員之一[10],提示SLC26A3不僅具有調(diào)節(jié)腸黏液層水、電解質(zhì)的功能,而且還參與維持腸黏液層的通透性及穩(wěn)定性[6]。因此,推測SLC26A3的異常表達可能是結(jié)直腸癌患者出現(xiàn)排便習(xí)慣改變的原因之一。

CHAPMAN等[11]研究發(fā)現(xiàn),SLC26A3在結(jié)腸癌、乳腺癌、腎癌和宮頸癌細胞系中低表達,過表達SLC26A3基因后可抑制細胞的生長,表明SLC26A3在腫瘤中發(fā)揮著抑癌基因的作用。我們通過單細胞測序數(shù)據(jù)庫CancerSEA發(fā)現(xiàn)SLC26A3的表達與結(jié)直腸癌細胞的增殖、細胞周期以及DNA修復(fù)呈負相關(guān),提示SLC26A3可能通過影響腸癌細胞增殖、細胞周期和/或DNA損傷修復(fù)而發(fā)揮抑癌作用。研究表明[6],在小鼠中敲除SLC26A3可促進腫瘤的進展。SLC26A3-/-小鼠在癥狀上與先天性失氯性腹瀉而導(dǎo)致的腹瀉類似,這與SLC26A3的功能缺失相關(guān),但敲除SLC26A3后促進了結(jié)腸隱窩上皮細胞的增殖。盡管機制尚不清楚,但研究表明SLC26A3在結(jié)腸癌發(fā)展中存在著潛在作用。雖然SLC26A3集中表達在結(jié)直腸組織中并且具有重要的生理和病理生理學(xué)意義,但是本研究并未發(fā)現(xiàn)其對于結(jié)直腸腺癌的腫瘤分期和病人對于提示病人預(yù)后具有顯著意義。SLC26A3可能通過影響腸癌細胞增殖、細胞周期和DNA損傷修復(fù)發(fā)揮抑癌作用的機制也有待后續(xù)分子生物學(xué)實驗進一步證實。在40個月生存患者中SLC26A3高表達率較高,提示,SLC26A3可能是一個改善患者生存的保護性因素。

既往研究表明磷酯酰肌醇-3激酶(phosphoinosotode 3-kinase),PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase,PKB/AKT)信號通路具有調(diào)節(jié)細胞生長、代謝、凋亡、癌癥等廣泛的生物學(xué)作用[12]。結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展與PI3K/AKT信號通路密切相關(guān),抑制該通路可能是目前治療結(jié)腸癌的一種方法[8,13]。而與此同時,已有研究證實通過PI3K/AKT信號通路可提高細胞頂端膜SLC26A3的蛋白表達和Cl-/OH-離子交換活性[14-15],這其中,PI3K/AKT信號通路對SLC26A3的功能與SLC26A3在結(jié)直腸腺癌中的低表達似乎存在理論上的不一致。為此本研究進行的相關(guān)的實驗研究,并首次發(fā)現(xiàn),激活PI3K后,SLC26A3蛋白表達量先隨著PI3K信號通路激動劑濃度的增加而升高,此結(jié)果與既往研究結(jié)果相同,但當(dāng)PI3K信號通路激動劑濃度持續(xù)增加,即PI3K信號通路持續(xù)過度激活后,SLC26A3蛋白表達量呈下降趨勢,提示PI3K/AKT通路對SLC26A3的蛋白表達發(fā)揮著雙向作用。這一研究結(jié)果可為PI3K/AKT信號通路抑制劑在結(jié)直腸癌治療中的合理使用提供借鑒。

通過對SLC26A3在結(jié)直腸癌中的數(shù)據(jù)庫信息挖掘及細胞學(xué)實驗,我們推測SLC26A3可能會影響結(jié)腸癌患者的遠期生存率,且SLC26A3的表達改變可能與結(jié)直腸患者的排便習(xí)慣改變這一臨床特征有關(guān),并發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT通路對SLC26A3的表達調(diào)控可能發(fā)揮著雙向調(diào)節(jié)的作用。本研究結(jié)果為利用PI3K/AKT信號通路來減輕結(jié)直腸癌患者的臨床癥狀和改善其遠期預(yù)后提供了初步的實驗數(shù)據(jù)。