慢性乙型病毒性肝炎患者基因分型與耐藥變異的相關(guān)性分析

劉 奇

（江蘇省宜興市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 江蘇 宜興 214200）

慢性乙型病毒性肝炎是指慢性乙肝病毒檢測為陽性，病程超過半年或發(fā)病日期不明確的臨床有慢性肝炎表現(xiàn)者[1]?；颊甙l(fā)病早期臨床多表現(xiàn)為乏力、畏食、惡心嘔吐等，嚴(yán)重者可伴有慢性肝病面容、蜘蛛痣及肝功能異常等，影響患者正常生活及健康[2]。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明：我國慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染者達(dá)到9 300萬，且慢性乙型肝炎患者達(dá)到2 000 萬例。目前，臨床上對于HBV 感染治療藥物主要依賴于干擾素（interferon,IFN）、核苷酸類似物2 類，前者具有調(diào)節(jié)免疫、抗病毒及抗纖維化優(yōu)點(diǎn)，但是藥物副作用嚴(yán)重，使用不便且存在諸多禁忌證。而核苷類似物具有更強(qiáng)的抑制病毒復(fù)制的能力，能獲得良好的治療預(yù)后[3-5]?；颊唛L期治療過程中拉米夫定、阿德福韋等出現(xiàn)嚴(yán)重的病毒反彈及血清學(xué)突破現(xiàn)象。但是，臨床上慢性乙型病毒性肝炎患者基因分型與耐藥變異性的關(guān)系研究較少。因此，本文以慢性乙型肝炎患者為對象，探討慢性乙型病毒性肝炎患者基因分型與耐藥變異的相關(guān)性，報道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

選取2018 年5 月—2020 年3 月我院收治的慢性乙型肝炎患者121 例，男67 例，女54 例，年齡6 ～74 歲，平均年齡（52.59±6.73）歲；病程1 ～14 年，平均（7.51±1.39）年；體重指數(shù)（BMI）18 ～27 kg/m2，平均（23.59±3.51）kg/m2；納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合2015 年《慢性乙型肝炎防治指南》中慢性乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）均完成標(biāo)本采集，且患者均可耐受[6]；（3）具有完整的基線及隨訪資料者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并精神異常、認(rèn)知功能異常或器質(zhì)性疾病者；（2）血液系統(tǒng)疾病、伴有自身免疫系統(tǒng)疾病者；（3）嚴(yán)重心、腎功能異?；蚝喜⒕凭愿尾?、脂肪肝者。

1.2 方法

儀器與設(shè)備：全基因組提取試劑盒，購自于QIAGEN。HBV 核酸熒光檢測試劑盒，購自于中山大學(xué)達(dá)安基因有限公司；熒光定量PCR 儀，型號：7500RT-PCR System 以及遺傳分析儀，型號：3500DX，購自于美國ABI 公司。

方法：（1）標(biāo)本采集。所有患者入院后次日取外周空腹血3 mL，35 min 離心，速度3 000 rpm，血清分離后，放置在低溫下，備用；（2）檢測方法。①基因型分析。采用基因測序法測定入組患者HBV 基因型，具體方法如下：取上述分離的血清標(biāo)本，根據(jù)Qiagen 全基因組提取試劑盒說明書完成血漿樣本HBV-DNA 基因的提取。采用普通PCR 擴(kuò)增HBV P 區(qū)序列，根據(jù)檢測目的設(shè)置PCR 反應(yīng)參數(shù)：普通PCR 反應(yīng)條件為50μL，95℃下進(jìn)行3 min 預(yù)變性；94℃下30 s，57℃下30 s，72℃下40 s，連續(xù)完成35 個循環(huán)。引物均由生工生物工程股份有限公司完成；測序結(jié)果采用NCBI BLAST 及DANMAN 軟件進(jìn)行分析，完成HBV 基因型分析。②耐藥突變位點(diǎn)。上述操作完畢后，完成常見核苷酸類似物（NAs）耐藥突變位點(diǎn)測定。本研究中檢測了NAs 常見的101 個耐藥突變位點(diǎn)，包括：173L、180M、181V、184AGIS、194TM、204VIS、207MIL、213T、236T、237H 等。③HBV DNA 定量測定。取上述分離的血清標(biāo)本，采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction, PCR）儀進(jìn)行定量分析，采用HBV 核酸熒光試劑盒，檢測下限為100 IU/mL。每批PCR 試驗(yàn)均設(shè)陽性、臨界陽性及陰性對照，所有操作均必須嚴(yán)格遵循儀器說明書完成。（3）相關(guān)性分析。采用Pearson 相關(guān)性分析軟件對患者基因分型與耐藥變異性進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-± s）表示，行t檢驗(yàn)；計數(shù)資料以率[n（%）]表示，行χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 慢性乙型病毒性肝炎患者檢測基因分型及構(gòu)成比

121 例慢性乙型病毒性肝炎患者均完成基因分型測定，結(jié)果顯示：慢性乙型病毒性肝炎患者以B 型及C 型為主，分別占：59.50%和40.50%，見表1。

表1 慢性乙型病毒性肝炎患者檢測基因分型及構(gòu)成比

2.2 慢性乙型病毒性肝炎患者耐藥位點(diǎn)分布及突變率

入組患者均完成耐藥位點(diǎn)檢測，結(jié)果表明：10 個常見的耐藥位點(diǎn)中排在前3 位的分別為：204VIS、180M 及194TM，突變率分別為：52.89%、32.23%和19.83%，見表2。

表2 慢性乙型病毒性肝炎患者耐藥位點(diǎn)分布及突變率

2.3 慢性乙型病毒性肝炎患者基因分型與耐藥變異性相關(guān)性分析

Pearson 相關(guān)性分析結(jié)果表明：慢性乙型病毒性肝炎患者B 型及C 型與204VIS、180M 及194TM 呈正相關(guān)性，r 有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與173L、181V、184AGIS、207MIL、213T、236T 及237H 無相關(guān)性，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 慢性乙型病毒性肝炎患者基因B、C 分型與耐藥變異性相關(guān)性分析

3.討論

國內(nèi)學(xué)者研究表明：乙型肝炎患者HBV-DNA 載量與血清標(biāo)志物水平存在緊密的聯(lián)系，且乙肝病毒基因會影響該病的狀況及臨床治療聯(lián)系[7]。目前，我國HBV 感染患者多以B 型與C 型為主。本研究中，121 例慢性乙型病毒性肝炎患者均完成基因分型測定，結(jié)果表明：慢性乙型病毒性肝炎患者以B 型及C 型為主，分別占：59.50%和40.50%，與既往結(jié)果相符。從以往研究結(jié)果表明：C 型感染患者明顯多于B 型感染患者，且C 型患者纖維化水平明顯高于B 型。對于不同基因型如混合感染，不僅乙型肝病毒載量更高，亦會加重病情的發(fā)展。因此，患者治療前確定基因型，對疾病的治療及預(yù)后具有重要的意義。目前，臨床上對于慢性乙型肝炎多以抗病毒治療為主，多數(shù)患者經(jīng)藥物抗病毒治療后癥狀能得到明顯改善，但是部分患者治療期間會產(chǎn)生變異與耐藥。目前，基因型與抗病毒藥物的研究更多的集中在抗病毒藥物治療上。本研究中，完成入組患者耐藥位點(diǎn)測定，結(jié)果顯示：10 個常見的耐藥位點(diǎn)中排在前3 位的分別為：204VIS、180M 及194TM，突變率分別為：52.89%、32.23%和19.83%，從本結(jié)果看出，慢性乙型病毒性肝炎患者耐藥變異率較高，導(dǎo)致患者預(yù)后較差。為了進(jìn)一步分析慢性乙型病毒性肝炎患者HBV 基因分型與耐藥性的關(guān)系，本研究中對其進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析，結(jié)果顯示：慢性乙型病毒性肝炎患者B 型及C 型與204VIS、180M 及194TM 呈正相關(guān)性，r 有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與173L、181V、184AGIS、207MIL、213T、236T 及237H無相關(guān)性，r 無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明慢性乙型肝炎患者HBV 基因與耐藥性存在緊密的聯(lián)系。因此，臨床上慢性乙型肝炎患者治療前應(yīng)加強(qiáng)患者HBV 基因型分析，了解患者基因的類型，并選擇合適的抗病毒藥物，盡可能降低耐藥率，提高臨床效果。同時，患者治療過程中加強(qiáng)其生命體征監(jiān)測，加強(qiáng)患者肝功能及HBV DNA水平測定，評估患者預(yù)后，善于根據(jù)測定結(jié)果調(diào)整治療方法，使得患者的治療更具科學(xué)性。

綜上所述，慢性乙型病毒性肝炎患者HBV 基因分型以B 型為主，其次為C 型，且不同分型患者耐藥變異性存在顯著差異，加強(qiáng)HBV 基因型及耐藥性分析可指導(dǎo)臨床用藥。