金銀花枝葉提取液體外抑菌活性與體內抗炎作用研究

呂歸紅 陳 宇

1 杭州市富陽中醫(yī)骨傷醫(yī)院 浙江 杭州 311400

2 浙江省中醫(yī)藥研究院 浙江 杭州 310007

金銀花首載于梁·陶弘景《名醫(yī)別錄》，名忍冬，為常用中藥［1］，其味甘，性寒，歸肺、心、胃經，具有清熱解毒、涼散風熱之功效［2］?，F(xiàn)代藥理研究表明其具有抑菌、抗病毒、抗炎、解熱、增強免疫、降血脂、抗內毒素、利膽、保肝、抗腫瘤等藥理作用［3］。大量研究顯示，金銀花具有廣譜抗菌作用[4]，可抑制金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、無乳鏈球菌、化膿鏈球菌、大腸桿菌等多種細菌，被稱為抗菌之王[5]。金銀花的副產物枝葉產量較高，卻一直被視為非藥用部位而長期未得到利用?！侗静菥V目》：“莖葉及花，功用皆同。”現(xiàn)代藥理研究也表明金銀花枝葉與金銀花具有相近的化學成分和藥理活性。隨著抗生素的廣泛使用以及微生物耐藥現(xiàn)象越趨嚴重，對于尋找、合理開發(fā)、使用中草藥替代西藥解決抗菌消炎問題和防止二次污染的研究具有非常重要的意義。本實驗通過金銀花枝葉提取液的體外抑菌和體內抗炎作用研究，探討其體外抑菌效果和對急性炎癥作用的影響，為金銀花枝葉的合理開發(fā)利用提供實驗基礎，有利于進一步開發(fā)綠色環(huán)保的抗菌中草藥。

1 材料

1.1 動物：ICR小鼠，雌雄各半，體重20±2g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，生產許可證號：SCXK（京）2016-0011。

1.2 儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱（日本THERRMO）；SW-CJ 型生物潔凈工作臺（蘇州凈化）；全自動手提式滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）；METTLER AE-240 電子天平（梅特勒-托利多上海有限公司）；J-15R 冷凍型高效臺式離心機[貝克曼庫爾特商貿（中國）有限公司]。

1.3 試藥：金黃色葡萄球菌(ATCC23259)、大腸埃希菌(ATCC22953)、銅綠假單胞菌(ATCC23578)由浙江省臨床檢驗中心提供；金銀花枝葉提取液由浙江省中醫(yī)藥研究院中藥研究中心提供，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 金銀花枝葉提取液制備：準確稱取金銀花枝葉100g，加入14倍量70%濃度乙醇溶液，分2次提取，每次1.5h，制備得到提取液，過濾，回收乙醇，水浴上濃縮至100ml，制成1mg/ml 的溶液，滅菌，密封，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 供試菌株和含菌平板制備：無菌條件下，將供試菌種移接入相對應的培養(yǎng)基上，35～37℃恒溫箱內培養(yǎng)44～48h，0～4℃下冷藏備用。分別用接種環(huán)取少許菌體置于裝有9ml 無菌生理鹽水試管內，振蕩搖勻，制成菌懸液，含菌體量103～105 個/ml，分別用無菌移液管向相應的固體平板上加0.1ml 菌懸液，并涂布均勻。

2.3 抑菌圈直徑測定：采用藥敏紙片法將6mm 定性濾紙小圓片分裝于潔凈干燥試管內，120℃干熱滅菌2h后備用。無菌操作下將100 片滅菌濾紙片浸于1ml 各濃度金銀花枝葉醇提物中，置冰箱內浸泡1h，然后置于37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱內干燥2～3h 后無菌操作貼在制備好的含菌平板上，以相同濃度濾紙片3片作為1片，每皿均勻分貼不同藥液濾紙片10 片，重復3 次；置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24h后取出觀察，以藥敏紙片周圍無色區(qū)域為抑菌圈，測量直徑，求出3個平皿的平均值。金銀花枝葉提取液對三種病原菌均有抑制作用，金黃色葡萄球菌較強敏感性，大腸埃希菌中度敏感，銅綠假單胞菌低度敏感，結果見表1。

表1 對三種細菌的抑菌結果（±s，mm)

表1 對三種細菌的抑菌結果（±s，mm)

抑菌圈直徑20.68±0.35 15.98±0.16 11.67±0.18菌 株金黃色葡萄球菌大腸埃希菌銅綠假單胞菌空白對照－－－

2.4 最低抑菌濃度（MIC）測定：采用試管二倍稀釋法，13mm×100mm滅菌具塞試管11支。每管先加入無菌肉湯培養(yǎng)基2ml，然后于第1 管中加入滅菌金銀花提取物2ml，混勻后取出2ml 放入第2 管中，依次類推，直到第9管取出2ml 棄去，配成含中藥提取物分別為1∶2、1∶4、1∶8、1∶16……各濃度液體。第10管不加藥物作為對照，以觀察培養(yǎng)基是否適合細菌生長。第11 管加受試藥液2ml，混勻取出2ml 棄去，不加細菌，以觀察受試中藥是否污染。將培養(yǎng)6h的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌與銅綠假單胞菌試驗菌液用無菌肉湯稀釋，取0.1ml分別加入1～10管中，混勻后一起放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h。記錄各管內細菌生長情況，以渾濁度為指標檢查有無細菌生長，以不顯示渾濁、細菌未生長的藥液稀釋度為MIC。金銀花枝葉提取液對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌MIC值為0.0308g/ml，而對銅綠假單胞菌為0.128g/ml，說明金銀花枝葉提取物對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌有較好的抑菌作用，對銅綠假單胞菌有較低的抑制作用，并隨著濃度的增大抑菌效果增強。結果見表2。

表2 對各種細菌的最小抑菌濃度（MIC）

2.5 金銀花枝葉提取物對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響：取ICR 小鼠40 只，隨機分成4 組（空白對照組、模型組、陽性對照組、金銀花枝葉提取液組），每組10 只。灌胃：空白對照組0.9%生理鹽水20ml/kg，陽性藥物組吲哚美辛10mg/kg，金銀花枝葉提取液組1mg/ml 提取液20ml/kg。給藥7 天，末次給藥40min 后，除空白組外按20μl/只均勻涂抹二甲苯于右耳正反兩面，20min 后脫頸處死，用直徑9mm 打孔器在左右耳同一部位沖下耳片，分別稱定重量，計算耳腫脹及耳腫脹抑制率，結果見表3。

表3 對小鼠耳腫脹的影響（±s）

表3 對小鼠耳腫脹的影響（±s）

注：與模型組比較，bP＜0.05。

組別空白對照組模型組陽性對照組金銀花枝葉提取液組耳腫脹度1.12±0.58 13.43±3.44 7.11±2.89b 9.40±2.71b抑制率——47.06%30.01%

2.6 金銀花枝葉提取液對白細胞（WBC）數(shù)、血紅蛋白（Hb）的影響：按“2.5”項下方法構建急性炎癥小鼠模型，30min 后，摘眼球取血，采集的血液按照血常規(guī)方法測定血液中白細胞（WBC）數(shù)、血紅蛋白（Hb）的含量，結果見表4。

表4 對急性炎癥小鼠WBC、Hb的影響（±s）

表4 對急性炎癥小鼠WBC、Hb的影響（±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05。

組別空白對照組模型組陽性對照組金銀花枝葉提取液組Hb（g·L-1）142.26±4.49 111.64±5.41a 134.58±8.92b 128.33±7.42b WBC（×109·L-1）6.27±0.76 8.52±0.49a 5.84±0.69b 7.65±0.63b

3 小結

血液中的白細胞、血紅蛋白水平在一定程度上可以反映骨髓的造血功能，炎癥發(fā)生時白細胞升高、而Hb水平會有不同程度降低。本實驗結果顯示，急性炎癥小鼠造模成功后白細胞升高，Hb 有一定程度下降，符合預期，而當給予了金銀花枝葉提取液的炎癥小鼠，其白細胞水平降低，同時Hb得到顯著回升；通過急性炎癥實驗表明金銀花枝葉提取液又能夠顯著抑制二甲苯所致小鼠耳腫脹，由此可見金銀花枝葉提取液對急性炎癥有一定的治療作用。