基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的如意金黃散治療癤腫的機(jī)制研究

張濤 ，周春宇 ，楊成城 ，張少輝 ，門斯燁 ，錢嘉惠 ，馬亦湘 ，安佳琳

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078）

癤腫（Furuncle）是人體皮膚單個(gè)毛囊或皮脂腺發(fā)生的急性化膿性感染，常由皮膚擴(kuò)展到皮下組織，是常見(jiàn)的皮膚科外科疾病。致病菌多為金黃色葡萄球菌與表皮葡萄球菌。癤腫易發(fā)生于毛囊和皮脂腺豐富的部位如頭面、頸、背等部位。多個(gè)癤連成一片形成癰。表現(xiàn)為局部紅腫熱痛。西醫(yī)治療多以靜脈應(yīng)用抗生素，局部切開(kāi)引流排膿為主[1]。中醫(yī)藥在癤腫的治療上能夠清熱解毒，散結(jié)消腫，并且在改善癥狀方面有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，效果顯著。如意金黃散出自明代陳實(shí)功《外科正宗》[2]，收錄于2015版《中國(guó)藥典》[3]。全方中大黃、黃柏苦寒解毒為君藥。陳皮、天南星、蒼術(shù)、厚樸燥濕化痰行氣，姜黃破血行氣共為臣藥。天花粉、白芷清熱解毒，消腫止痛為佐藥。甘草調(diào)和諸藥，兼以甘緩斂瘡為使藥。諸藥合用，使得熱毒得除，瘀血得散，氣滯得行，癤腫可消。如意金黃散被廣泛應(yīng)用于癤腫的臨床治療且效果顯著。故筆者基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從成分-靶點(diǎn)-通路預(yù)測(cè)如意金黃散治療癤腫的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 復(fù)方化學(xué)成分收集及藥物靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 將大黃、黃柏、陳皮、天南星、蒼術(shù)、厚樸、姜黃、天花粉、白芷、甘草輸入中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)Traditional Chinese Medicine System Pharmacology Database[4]（TCMSPTM，http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）。篩選條件：口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性指數(shù)（DL）≥0.18[5]。藥物靶點(diǎn)數(shù)據(jù)來(lái)源于Drugbank[6]（https：//www.drugbank.ca/），應(yīng)用 Uniprot（https：//www.Uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)使其標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 疾病靶點(diǎn)來(lái)源 基于GeneCards（https：//www.genecards.org/） 與 OMIM-NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）數(shù)據(jù)庫(kù)以癤腫、Furuncle為關(guān)鍵詞篩選疾病靶點(diǎn)。

1.3 復(fù)方-疾病交集基因的獲取 應(yīng)用R軟件中的Draw Venn Diagrams工具對(duì)1.1與1.2中獲取到的藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)進(jìn)行處理，獲得交集基因靶點(diǎn)。

1.4 如意金黃散治療癤腫的靶蛋白相互作用（Protein protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將如意金黃散的活性化學(xué)成分，核心靶標(biāo)通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)與Cytoscape 3.7.1進(jìn)行PPI蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析，構(gòu)建藥物-活性化學(xué)成分-核心靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)。

1.5 GO功能富集和KEGG通路分析 基于Bioconductor（https：//www.bioconductor.org/）中的R包（https：//www.r-project.org/）clusterprofile version 3.12.0對(duì)核心靶標(biāo)進(jìn)行基因本體論（Gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因和基因組百科全書(shū)通路分析（KEGG pathway analysis）。選擇物種為人（Homo spanies），設(shè)定閾值P<0.05，根據(jù)結(jié)果在Cytoscape3.7.1進(jìn)行核心靶標(biāo)-關(guān)鍵通路網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方化學(xué)成分及藥物靶點(diǎn) 本次研究共收集如意金黃散藥物化學(xué)成分126個(gè)，預(yù)測(cè)靶點(diǎn)279個(gè)，如意金黃散各中藥有效成分見(jiàn)表1。

表1 如意金黃散的有效成分

2.2 疾病靶點(diǎn)的獲取 在GeneCards與OMIMNCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中以“Furuncle、Scabies”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)按照Relevance score≥10篩選，將2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中所得的疾病靶點(diǎn)匯總并刪除重復(fù)，共獲得165個(gè)，將其作為候選靶標(biāo)來(lái)源。

2.3 獲取交集基因及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

2.3.1 獲取復(fù)方-疾病交集基因 將1.1與1.2中獲得的復(fù)方藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入到R軟件，應(yīng)用Draw Venn Diagrams工具獲取交集基因，見(jiàn)表2；并繪制韋恩圖，見(jiàn)圖1。

表2 如意金黃散治療癤腫的20個(gè)靶蛋白

續(xù)表

續(xù)表

圖1 復(fù)方-疾病交集基因韋恩圖

2.3.2 構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖 運(yùn)用Cytoscape3.7.1中Network Analyze插件構(gòu)建復(fù)方化學(xué)成分-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖2。網(wǎng)絡(luò)共有76個(gè)節(jié)點(diǎn)，93條邊。方形代表核心靶標(biāo)，橢圓形代表活性化學(xué)成分，不同顏色代表來(lái)自不同藥物。每條邊代表化合物與靶點(diǎn)的關(guān)系。通過(guò)分析排名前5的化學(xué)成分是槲皮素、漢黃芩素、β-谷甾醇、豆甾醇、Formononetin和芒柄花素；靶點(diǎn)排名前5的是前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2（PTGS2）、乙酰膽堿酯酶（ACHE）、白細(xì)胞介素（IL）-6、IL-4和表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）；一個(gè)化學(xué)成分往往與多個(gè)交集基因靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)，且一個(gè)交集基因與靶點(diǎn)也同時(shí)對(duì)應(yīng)多個(gè)化學(xué)成分，化學(xué)成分又從屬于不同的中藥，這說(shuō)明如意金黃散治療癤腫是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路起效的，見(jiàn)圖2。

圖2 復(fù)方化學(xué)成分-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)

2.4 交集基因PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)交集基因?qū)С醪綐?gòu)建蛋白作用網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖3。網(wǎng)絡(luò)圖包括20個(gè)節(jié)點(diǎn)，138條邊。節(jié)點(diǎn)代表蛋白，邊代表蛋白與蛋白之間的作用關(guān)系。網(wǎng)絡(luò)連接程度越高說(shuō)明蛋白之間關(guān)系越密切。通過(guò)觀察IL-6、IL-4、EGFR在網(wǎng)絡(luò)中連接程度較高，說(shuō)明這3個(gè)靶蛋白是網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖3 如意金黃散與癤腫蛋白質(zhì)相互作用核心網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 交集基因的GO和KEGG通路富集分析 基于Bioconductor中的R包對(duì)核心靶標(biāo)進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路分析。富集條件為pvalueCutoff=0.05且qvalueCutoff=0.05，其余默認(rèn)原始設(shè)置，并根據(jù)每個(gè)項(xiàng)目的P值、Q值及富集在其上的基因數(shù)目繪制氣泡圖，見(jiàn)圖4、5，橫坐標(biāo)表示靶點(diǎn)數(shù)，左邊表示生物學(xué)過(guò)程，顏色表示P值，P值越小顏色越偏向紅色，P值越大則越偏向藍(lán)色。GO富集中交集基因主要參與了白細(xì)胞-細(xì)胞黏附、蛋白質(zhì)定位建立的正調(diào)控、多細(xì)胞組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)等生物學(xué)過(guò)程。KEGG通路主要涉及IL-17信號(hào)通路、AGE-RAGE信號(hào)通路以及腫瘤壞死因子（TNF）信號(hào)通路等。

圖4 交集基因GO分析圖

圖5 交集基因KEGG通路富集圖

3 討論

癤腫相當(dāng)于中醫(yī)上的癤。多因內(nèi)郁濕火，外感風(fēng)邪，蘊(yùn)阻肌膚所致。根據(jù)其病因、證候的不同，可以分為有頭癤、無(wú)頭癤、癤病等。臨床上多表現(xiàn)為局部皮膚的紅腫熱痛，并伴有發(fā)熱、口渴、苔黃、便秘等癥狀[7]。如意金黃散是《外科正宗》的經(jīng)典方劑，在治療癤，癰，疔，疽，濕痰流毒，火丹等疾病療效顯著[8]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，周聰和等[9]研究發(fā)現(xiàn)，如意金黃散能夠抑制金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌，并且可以明顯降低炎性肉芽囊的質(zhì)量，減少炎性滲出，控制炎癥的發(fā)展。張遠(yuǎn)哲等[10]通過(guò)大鼠實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，如意金黃散能夠有效調(diào)控TNF-α等炎性介質(zhì)的表達(dá)和釋放，從而達(dá)到消炎止痛的作用。王喜云等[11]研究發(fā)現(xiàn)，如意金黃散能夠顯著提高大鼠血清中的溶酶菌的含量。這說(shuō)明如意金黃散能夠整體治療瘡瘍，并能夠提高機(jī)體的防御能力。因此，如意金黃散被廣泛用于癤腫的治療。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法研究如意金黃散治療癤腫的作用機(jī)制。根據(jù)OB和DL參數(shù)，共篩選出如意金黃散化學(xué)成分126個(gè)，預(yù)測(cè)靶點(diǎn)279個(gè)。結(jié)果表明，槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等是其主要的化學(xué)成分。藥理學(xué)研究表明，槲皮素是一種黃酮類化合物，能夠有效抑制TNF和IL等炎性因子的表達(dá)，且有舒張血管的作用，能夠清除氧自由基，從而達(dá)到有抗炎，抗氧化，消炎鎮(zhèn)痛的作用[12-14]。劉威良等[15]發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇通過(guò)調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺激素系統(tǒng)達(dá)到類似激素樣抗炎的作用。肖志彬等[16]發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇可以增強(qiáng)血清中氧自由基清除能力，降低TNF水平達(dá)到抗炎的作用。田媛媛等[17]研究發(fā)現(xiàn)豆甾醇能夠顯著降低IL-6，IL-1B等炎性因子的表達(dá)，有明顯的抗炎作用。在如意金黃散的主要化學(xué)成分中，槲皮素主要來(lái)源于黃柏。β-谷甾醇主要來(lái)源于黃柏、大黃和天南星。豆甾醇主要來(lái)源于黃柏、姜黃和天南星。這說(shuō)明如意金黃散可能是通過(guò)多味中藥中的槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等主要化學(xué)成分來(lái)抑制TNF、IL等炎性因子的表達(dá)來(lái)達(dá)到治療癤腫的目的。槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等主要化學(xué)成分能夠作用于網(wǎng)絡(luò)中的多個(gè)交集基因靶點(diǎn)，交集基因也與多個(gè)化學(xué)成分互相作用，這說(shuō)明如意金黃散有效成分之間存在協(xié)同作用，多靶點(diǎn)調(diào)控來(lái)治療癤腫。

為進(jìn)一步闡述靶點(diǎn)之間的作用關(guān)系，對(duì)復(fù)方-疾病交集基因靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白互作分析。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，IL-4、IL-6、EGFR 在網(wǎng)絡(luò)中 Degree值較大，在網(wǎng)絡(luò)中連接程度較高。進(jìn)一步對(duì)交集基因進(jìn)行GO功能富集分析，發(fā)現(xiàn)交集基因主要參與了白細(xì)胞-細(xì)胞黏附、蛋白質(zhì)定位建立的正調(diào)控、多細(xì)胞組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)等生物學(xué)過(guò)程。IL-6與IL-4同屬于白細(xì)胞介素，是由多種細(xì)胞產(chǎn)生并作用于多種細(xì)胞的一類細(xì)胞因子。IL-6能夠促進(jìn)T細(xì)胞表面IL-2r的表達(dá)，增強(qiáng)IL-1和TNF對(duì)TH細(xì)胞的致有絲分裂作用。郭佳[18]發(fā)現(xiàn)在感染引起的急性炎性反應(yīng)中誘導(dǎo)急性期反應(yīng)蛋白的合成，其中以c-反應(yīng)蛋白（CRP）增加尤為明顯，有利于更早發(fā)現(xiàn)機(jī)體炎性反應(yīng)。劉世國(guó)[19]發(fā)現(xiàn)IL-4能夠促使B細(xì)胞表達(dá)和分泌IgE，介導(dǎo)過(guò)敏反應(yīng)。EGFR通路能夠有效促進(jìn)有絲分裂，形成角質(zhì)細(xì)胞，角質(zhì)細(xì)胞也可通過(guò)EGFR刺激再生。EGF是EGFR主要配體之一，能夠刺激周圍神經(jīng)修復(fù)和再生[20]。另外，Marino等[21]對(duì)人表皮淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞（LECs）進(jìn)行體外研究，發(fā)現(xiàn)EGFR可以通過(guò)表達(dá)EGF來(lái)促進(jìn)淋巴管形成。EGFR能夠使受體配體活性增強(qiáng)，來(lái)促進(jìn)血管淋巴管的再生，刺激周圍神經(jīng)的修復(fù)和再生來(lái)達(dá)到促進(jìn)瘡瘍愈合，減輕疼痛，治療癤腫的目的。這提示如意金黃散中槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等有效成分可能是通過(guò)直接作用于IL-6、IL-4、EGFR等交集基因從而參與機(jī)體白細(xì)胞-細(xì)胞黏附、蛋白質(zhì)定位建立的正調(diào)控、多細(xì)胞組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)等生物學(xué)過(guò)程來(lái)達(dá)到治療癤腫的目的。

交集基因KEGG通路富集分析，其通路主要包括IL-17信號(hào)通路、AGE-RAGE信號(hào)通路、以及TNF信號(hào)通路。既往的研究表明，局部炎性反應(yīng)是癤腫發(fā)生病變的基礎(chǔ)，有效的控制炎性反應(yīng)對(duì)治療癤腫有明顯的促進(jìn)作用。在癤腫的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中會(huì)釋放大量的炎性因子（IL-2，IL-4，IL-6，IL-1α，IL-1β等），阻斷IL-17信號(hào)通路能夠有效抑制炎性因子的釋放[22]，達(dá)到治療的目的。楊超茅等[23]發(fā)現(xiàn)AGE-RACE信號(hào)通路能夠激活逆轉(zhuǎn)錄因子（NF）-κB，從而使得細(xì)胞核表達(dá)和釋放大量的黏附因子、生長(zhǎng)因子、促炎細(xì)胞因子（IL-6，TNF-α）等，抑制炎性因子的表達(dá)，達(dá)到抗炎的作用。NF-κB又可以增強(qiáng)AGE-RACE信號(hào)通路的表達(dá)，使得該通路能夠持久作用于細(xì)胞[24]。TNF-α和IL-6是參與機(jī)體組織損害和病理反應(yīng)的炎性細(xì)胞因子[25]，阻斷機(jī)體的TNF信號(hào)通路能夠顯著抑制TNF等炎性因子的釋放和表達(dá)，如意金黃散可能是通過(guò)阻斷機(jī)體的IL-17信號(hào)通路、AGE-RAGE信號(hào)通路、以及TNF信號(hào)通路來(lái)達(dá)到抗炎，治療癤腫的作用。

上述KEGG通路的富集結(jié)果還顯示，還富集到了細(xì)胞因子間相互作用、瘧疾、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化等通路結(jié)果，這說(shuō)明如意金黃散除了直接作用于炎性反應(yīng)相關(guān)的信號(hào)通路，還有影響機(jī)體內(nèi)多種多種代謝通路的基因靶點(diǎn)發(fā)揮治療癤腫的作用。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，分析如意金黃散治療癤腫的機(jī)制。結(jié)果顯示，如意金黃散治療癤腫主要是通過(guò)槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇等多種潛在化學(xué)成分作用于IL-6、IL-4、EGFR等基因，從而調(diào)節(jié)多種生物學(xué)功能以及多條通路來(lái)達(dá)到治療目的。為后續(xù)進(jìn)一步探討機(jī)制和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)提供支持，同時(shí)，本文也為中藥及其復(fù)方治療某種疾病的機(jī)制分析提供了研究方法。