酸漿全草甾體類化學(xué)成分研究

譚茂強(qiáng)，牛 崢，張 敏，郭遠(yuǎn)強(qiáng)，邱 峰*，丁麗琴

酸漿全草甾體類化學(xué)成分研究

譚茂強(qiáng)1, 2，牛 崢1, 2，張 敏1, 2，郭遠(yuǎn)強(qiáng)1, 3，邱 峰1, 2*，丁麗琴2*

1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 301617 2. 天津中醫(yī)藥大學(xué) 組分中藥國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617 3. 南開大學(xué)藥學(xué)院，天津 300350

研究酸漿屬植物酸漿var.的化學(xué)成分。對(duì)酸漿全草醋酸乙酯部位采用硅膠、Sephadex LH-20、ODS等多種柱色譜，并結(jié)合制備液相等方法進(jìn)行分離和純化，根據(jù)理化性質(zhì)及波譜數(shù)據(jù)對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。從酸漿醋酸乙酯部位中共分離鑒定10個(gè)化合物，分別為4β-methoxy-7β-hydroxyneophysalin B（1）、酸漿苦素P（2）、7-氧代-β-谷甾醇（3）、7β-羥基谷甾醇（4）、3β-羥基豆甾-5,22-二烯-7-酮（5）、豆甾-5,22-二烯-3β,7β-二醇（6）、(24)-5,28-stigmastadiene-3β,24-diol-7-one（7）、(24)-5,28-stigmastadiene-3β,24-diol-7-one（8）、3β-羥基-膽甾-5-烯-7-酮（9）、sargassuol A（10）?；衔?為新化合物4β-methoxy-7β-hydroxyneophysalin B，中文俗名酸漿苦素XIII，化合物3～10均為首次從該屬植物中分離得到。

酸漿全草；4β-methoxy-7β-hydroxyneophysalin B；酸漿苦素P；7-氧代-β-谷甾醇；結(jié)構(gòu)鑒定；甾體類化合物

酸漿全草為茄科酸漿屬植物酸漿L. var.(Mast.) Makino的干燥全草，味酸、苦，性寒，歸肺、脾經(jīng)；具有清熱毒、利咽喉、通利二便的功效。酸漿中主要化學(xué)成分為甾體類、黃酮類、苯丙素類、生物堿類化合物和其他類化合物，其中甾體類（主要為變形麥角甾類）成分被認(rèn)為是酸漿的特征性和主要生物活性物質(zhì)[1-8]?，F(xiàn)代藥理研究表明酸漿具有抗腫瘤[9]、抗微生物[10]、抗瘧疾[11]、免疫抑制[12]、免疫調(diào)節(jié)[13]和抗炎[14]等多種藥理活性，而甾體類的抗腫瘤[15-17]、抗炎[14]活性較為顯著。本實(shí)驗(yàn)通過多種色譜方法，對(duì)酸漿全草醋酸乙酯部位進(jìn)行化學(xué)成分研究，共鑒定10個(gè)化合物（圖1），分別為4β-methoxy-7β-hydroxyneophysalin B（1）、酸漿苦素P（physalin P，2）、7-氧代-β-谷甾醇（7-oxo- β-sitosterol，3）、7β-羥基谷甾醇（7β-hydroxysitosterol，4）、3β-羥基豆甾-5, 22-二烯-7-酮（3β-hydroxystigmasta- 5,22-dien-7-one，5）、豆甾-5,22-二烯-3β,7β-二醇（stigmast-5,22- dieβ,7β-diol，6）、(24)-5,28- stigmastadiene- 3β,24-diol-7-one（7）、(24)-5,28- stigmastadiene-3 β,24-diol-7-one（8）、3β-羥基-膽甾-5-烯-7-酮（3β-hydroxy-cholest-5-en-7-one，9）、sargassuol A（10），其中化合物1為新化合物，命名為4β-methoxy-7β-hydroxyneophysalin B，化合物3～10均為首次從酸漿屬植物中分離得到。

圖1 酸漿全草醋酸乙酯部位化合物的結(jié)構(gòu)

1 儀器與材料

1.1 儀器

A1204型萬分之一電子天平 [梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]，Bruker AVANCE III 600 MHz核磁共振波譜儀（瑞士Bruker公司），EYELA N-1100型系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化EYELA公司），SB25-1DTN型超聲清洗儀（寧波新芝生物科技有限公司），ZF-20D型暗箱式紫外分析儀（上海顧村電光儀器廠），Waters e2695分析型高效液相色譜儀（美國Waters公司），Waters 2535制備型高效液相色譜儀（美國Waters公司），Waters Xevo G2-S UPLC-Q/TOF（美國Waters公司），分析型及制備型YMC C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，250 mm×20 mm，5 μm，日本）；分析型及制備型PBr C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，250 mm×20 mm，5 μm，日本）。

1.2 材料

柱色譜硅膠（100～200、200～300目，青島海洋化工廠）；ODS-A-HG 12 nm S-50 μm（日本YMC公司）；Silica gel 60 F254（美國Merck公司）；TLC Silica gel 60 RP-18 F254s（美國Merck公司）；Sephadex LH-20（美國GE）；薄層制備硅膠GF2540.4～0.5 mm（于成化工上海有限公司）；色譜級(jí)甲醇、乙腈（天津市康科德科技有限公司），分析級(jí)環(huán)己烷、二氯甲烷、醋酸乙酯、甲醇（天津市康科德科技有限公司）。

樣品（170 kg）購于吉林省延邊朝鮮族自治州，藥材經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥資源學(xué)教研室張麗娟教授鑒定為酸漿L. var.(Mast.) Makino全草，留樣現(xiàn)保存于天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院。

2 提取與分離

酸漿全草170 kg，用10倍量60%乙醇/水浸泡10 h，回流提取2次，每次2 h。合并提取液，減壓回收溶劑濃縮，得到提取物浸膏。將總浸膏分散到5倍量的水中，分別用等體積的石油醚，醋酸乙酯萃取3次，減壓得到石油醚萃取物、醋酸乙酯萃取物以及水層。醋酸乙酯萃取物（1.05 kg）經(jīng)正相硅膠柱色譜，用二氯甲烷-甲醇（100∶0、50∶1、25∶1、10∶1、5∶1、3∶1、1∶1、0∶100）梯度洗脫，收集、濃縮后依據(jù)TLC檢測合并得到13個(gè)流分（E1～E13）。

E3（66 g）經(jīng)正相硅膠柱色譜，用環(huán)己烷-醋酸乙酯（100∶0、50∶1、25∶1、10∶1、5∶1、3∶1、1∶1、0∶100）梯度洗脫，收集、濃縮后依據(jù)TLC檢測合并得到11個(gè)流分。E3-7經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜（二氯甲烷-甲醇1∶1）進(jìn)行分離，經(jīng)制備高效液相分離（甲醇-水25∶75，體積流量3 mL/min，檢測波長205、236 nm）得到化合物6（3.2 mg）。

E8（35 g）經(jīng)正相硅膠柱色譜，用環(huán)己烷-醋酸乙酯（100∶0、50∶1、25∶1、10∶1、5∶1、3∶1、1∶1、0∶100）梯度洗脫，收集、濃縮后依據(jù)TLC檢測合并得到11個(gè)流分。E8-6經(jīng)過二氯甲烷-甲醇重結(jié)晶后得到化合物2（435.6 mg）。E8-9經(jīng)開放ODS柱色譜，水-甲醇（100∶0～0∶100）梯度洗脫后分為6個(gè)流分，E8-9-5經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜（二氯甲烷-甲醇 = 1∶1）和制備高效液相分離（甲醇-水-58∶42，體積流量3 mL/min，檢測波長210、236 nm）得到化合物9（15.6 mg）。E8-10樣品經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜（二氯甲烷-甲醇1∶1）進(jìn)行分離，得到的E8-10-2經(jīng)開放ODS柱色譜，水-甲醇（100∶0～0∶100）梯度洗脫后，得到的E8-10-2-5流分，經(jīng)正相硅膠柱色譜，用環(huán)己烷-醋酸乙酯（100∶0、50∶1、25∶1、10∶1、5∶1、3∶1、1∶1、0∶100）梯度洗脫后，經(jīng)制備高效液相分離（甲醇-水35∶65，體積流量3 mL/min，檢測波長205、228 nm）得到化合物1（2.5 mg）。E8-5經(jīng)開放ODS柱色譜，水-甲醇（100∶0～0∶100）梯度洗脫后，經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜（二氯甲烷-甲醇1∶1）和制備高效液相分離得到化合物3（23.6 mg）、4（2.6 mg）、5（66.0 mg）、7（2.0 mg）、8（2.5 mg）和10（8.8 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

1H-NMR (600 MHz，DMSO-6) 譜中（表1），在低場區(qū)顯示3個(gè)烯烴質(zhì)子信號(hào)H6.90 (1H, dd,= 10.0, 4.5 Hz, H-3), 5.94 (1H, d,= 10.0 Hz, H-2), 5.68 (1H, d,= 2.0 Hz, H-6)；在高場區(qū)顯示有1個(gè)甲氧基質(zhì)子信號(hào)H3.30 (3H, s)；3個(gè)甲基質(zhì)子信號(hào)H1.75 (3H, s, H-21), 1.41 (3H, s, H-28) , 1.32 (3H, s, H-19)。13C-NMR (150 MHz, DMSO-6) 譜中提示29個(gè)碳信號(hào)，其中包括1個(gè)酮羰基碳信號(hào)C202.3 (C-1)，3個(gè)酯羰基碳信號(hào)C172.9 (C-15), 171.9 (C-18), 170.9 (C-26)；2組雙鍵碳信號(hào)C142.7 (C-3), 135.5 (C-6), 131.6 (C-5), 128.5 (C-2)；7個(gè)連氧碳信號(hào)C83.7 (C-13), 82.2 (C-20), 81.4 (C-14), 77.3 (C-17), 76.1 (C-22), 75.7 (C-4), 67.5 (C-7) 以及1個(gè)甲氧基碳信號(hào)C56.1。HSQC譜圖（表1）將直接相連的碳?xì)湫盘?hào)進(jìn)行歸屬，通過比對(duì)發(fā)現(xiàn)該化合物的核磁數(shù)據(jù)與3-hydroxy-2,3-dihydro-4, 7-didehydroneophysalin B數(shù)據(jù)接近[2]，不同之處在于A、B環(huán)上取代基類型。

表1 化合物1的氫譜（600 MHz）、碳譜（150 MHz）數(shù)據(jù)歸屬

1H-1H COSY譜中（圖2），給出A、B環(huán)上氫偶合關(guān)系。H-2/H-3/H-4依次相關(guān)，H-6/H-7/H-8/H-9依次相關(guān)，H-7/7-OH相關(guān)。在HMBC譜（圖2）中，可以觀察到如下遠(yuǎn)程相關(guān)信號(hào)：H-19 (H1.32)與C-1 (C202.3)、C-5 (C131.6)、C-10 (C51.6)、C-9 (C37.0)相關(guān)，從而確定H1.32處甲基信號(hào)為H-19信號(hào)；H-2 (H5.94)/C-1 (C202.3)、C-4 (C75.7)、C-10 (C51.6) 以及H-3 (H6.90)/C-1 (C202.3)、C-5 (C131.6)、C-4 (C75.7)確定與1位酮羰基共軛烯鍵存在；H-6 (H5.68)與C-4 (C75.7)、C-10 (C51.6) 相關(guān)確定另一雙鍵取代位置；7-OH (H4.61)/C-6 (C135.5)、C-7 (C67.5)確定H4.61為羥基氫信號(hào)并確定其取代在C-7；-OCH3(H3.30)與C-4 (C75.7) 相關(guān)確定甲氧基取代于C-4。

圖2 化合物1中主要1H-1H COSY和HMBC相關(guān)信號(hào)

在NOESY譜中（圖3），H-4 (H4.14)與H-7 (H4.45)相關(guān)，H-19 (H1.32)與4-OCH3(H3.30)相關(guān)，提示H-19和4-OCH3是β構(gòu)型，H-4 (H4.14)與H-7 (H4.45)是α構(gòu)型，故推測7-OH為β構(gòu)型，從而確定化合物1 A、B環(huán)的相對(duì)構(gòu)型。通過X-ray單晶衍射，最終鑒定該化合物的絕對(duì)構(gòu)型為(4β,7β,14α,16β,22α,25)-(16,24-cyclo-13,14-secoer gosta-2,5-diene-15,18,26-trioicacid,14,17:14,27-diepoxy-7, 13,20,22-tetrahydroxy-1-oxo--lactone--lactone（圖4），經(jīng)Sci-Finder檢索，為未見報(bào)道的新化合物，命名為4β-methoxy-7β-hydroxyneophysalin B，中文俗名酸漿苦素XIII。

圖3 化合物1中主要NOESY相關(guān)信號(hào)

圖4 化合物1的X-單晶衍射

圖5 化合物2的X-單晶衍射

4 討論

甾體類（以變形麥角甾類為主）成分是酸漿中的主要特征性及活性成分，課題組前期曾發(fā)現(xiàn)此類成分具有顯著的抗腫瘤活性[25-27]。本實(shí)驗(yàn)從酸漿全草醋酸乙酯部分分離得到10個(gè)甾體類成分，其中化合物1為新化合物，化合物3～10為首次從該屬植物中分離得到，為進(jìn)一步的活性評(píng)價(jià)奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)也為闡明酸漿的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)，對(duì)于酸漿的合理開發(fā)與應(yīng)用具有一定的指導(dǎo)意義。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Li A L, Chen B J, Li G H,.L. var.(Mast.) Makino: An ethnomedical, phytochemical and pharmacological review [J]., 2018, 210: 260-274.

[2] Qiu L, Zhao F, Jiang Z H,. Steroids and flavonoids fromvar.and their inhibitory effects on nitric oxide production [J]., 2008, 71(4): 642-646.

[3] Ma Y M, Han W, Li J,. Physalin B not only inhibits the ubiquitin-proteasome pathway but also induces incomplete autophagic response in human colon cancer cells[J]., 2015, 36(4): 517-527.

[4] Lin Y, Shi R X, Wang X,. Luteolin, a flavonoid with potential for cancer prevention and therapy [J]., 2008, 8(7): 634-646.

[5] 幸福, 蔣建勤. 錦燈籠的化學(xué)成分研究 [J]. 藥學(xué)與臨床研究, 2013, 21(4): 344-346.

[6] Itoh T, Tamura T, Matsumoto T. 4-Desmethylsgerols in the seeds of Solanaceae [J]., 1977, 30(3): 425-433.

[7] Chen L X, Xia G Y, Liu Q Y,. Chemical constituents from the calyces ofvar[J]., 2014, 54: 31-35.

[8] Asano N, Kato A, Kizu H,. 1β-amino-2α, 3β, 5β-trihydroxycycloheptane fromvar.[J]., 1996, 42(3): 719-721.

[9] Han H Y, Qiu L, Wang X H,. Physalins A and B inhibit androgen-independent prostate cancer cell growth through activation of cell apoptosis and downregulation of androgen receptor expression [J]., 2011, 34(10): 1584-1588.

[10] Silva M T, Simas S M, Batista T G,. Studies on antimicrobial activity,, ofL. (Solanaceae) fraction and physalin B bringing out the importance of assay determination [J]., 2005, 100(7): 779-782.

[11] Sá M S, de Menezes M N, Krettli A U,. Antimalarial activity of physalins B, D, F, and G [J]., 2011, 74(10): 2269-2272.

[12] Yu Y J, Sun L J, Ma L,. Investigation of the immunosuppressive activity of Physalin H on T lymphocytes [J]., 2010, 10(3): 290-297.

[13] Lin Y S, Chiang H C, Kan W S,. Immunomodulatory activity of various fractions derived fromL. extract [J]., 1992, 20(3/4): 233-243.

[14] Pinto N B, Morais T C, Carvalho K M,. Topical anti-inflammatory potential of Physalin E fromon experimental dermatitis in mice [J]., 2010, 17(10): 740-743.

[15] Chiang H C, Jaw S M, Chen C F,. Antitumor agent, physalin F fromL [J]., 1992, 12(3): 837-843.

[16] Wu S Y, Leu Y L, Chang Y L,. Physalin F induces cell apoptosis in human renal carcinoma cells by targeting NF-kappaB and generating reactive oxygen species [J]., 2012, 7(7): e40727.

[17] Magalh?es H I, Veras M L, Torres M R,.andantitumour activity of physalins B and D from[J]., 2006, 58(2): 235-241.

[18] Peng X F, Wu Q, Gao C,. Chemical constituents from the fruit calyx ofvar.[J]., 2015, 24(9): 600-606.

[19] 白學(xué)莉. 抱莖苦荬菜的化學(xué)成分研究 [J]. 中國當(dāng)代醫(yī)藥, 2016, 23(17): 4-7.

[20] 尚小雅, 王若蘭, 尹素琴, 等. 紫紅曲代謝產(chǎn)物中的甾體成分 [J]. 中國中藥雜志, 2009, 34(14): 1809-1811.

[21] 賈陸, 郭明明, 李東, 等. 黃秋葵石油醚部位化學(xué)成分的研究Ⅱ [J]. 中國中藥雜志, 2011, 36(7): 891-895.

[22] Feng M T, Wang T, Liu A H,. PTP1B inhibitory and cytotoxic C-24 epimers of Δ28-24-hydroxy stigmastane-type steroids from the brown algaHolmes [J]., 2018, 146: 25-35.

[23] Wang Y S, Wang L L, Hu Y,. Isolation and identification of two steroid compounds from[J]., 2010, 24(16): 1518-1522.

[24] Wang S Y, Xiang J, Huang X J,. Chemical constituents from(harv.)[J]., 2020, 17(6): e2000182.

[25] Chen L, Xia G, Qiu F,. Physapubescin selectively induces apoptosis in VHL-null renal cell carcinoma cells through down-regulation of HIF-2α and inhibits tumor growth [J]., 2016, 6: 32582.

[26] He H, Zang L H, Feng Y S,. Physalin A induces apoptotic cell death and protective autophagy in HT1080 human fibrosarcoma cells [J]., 2013, 76(5): 880-888.

[27] Sun C P, Qiu C Y, Yuan T,. Antiproliferative and anti-inflammatory withanolides from[J]., 2016, 79(6): 1586-1597.

Studies on the steroids from the whole herb ofvar.

TAN Mao-qiang1, 2, NIU Zheng1, 2, ZHANG Min1, 2, GUO Yuan-qiang1, 3, QIU Feng1, 2, DING Li-qin2

1. School of Chinese Materia Medica, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China 2. State Key Laboratory of Component-based Chinese Medicine, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China 3.College of Pharmacy, Nankai University, Tianjin 300350, China

To study the chemical constituents fromL. var.(Mast.) Makino.The compounds were isolated and purified by comprehensive column chromatography and preparative RP-HPLC. Their structures were elucidated by physicochemical properties and spectral analyses.10 compounds were obtained and identified as 4β-methoxy-7β-hydroxyneophysalin B (1), physalin P (2), 7-oxo-β-sitosterol (3), 7β-hydroxysitosterol (4), 3β-hydroxystigmasta- 5,22-dien-7-one (5), stigmast-5,22-dien-3β,7β-diol (6), (24)-5,28-stigmastadiene-3β,24-diol-7-one (7), (24)-5,28-stigmastadiene- 3β,24-diol-7-one (8), 3β-hydroxy-cholest-5-en-7-one (9), sargassuol A (10).Compound 1 was a new compound. Compounds 3—10 were isolated from thegenus for the first time.

whole plant ofL. var.(Mast.) Makino; 4β-methoxy-7β-hydroxyneophysalin B; physalin P ; 7-oxo-β-sitosterol; structural identification; steroids

R284.1

A

0253 - 2670(2021)17 - 5203 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.17.011

2021-08-06

國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（82030116），國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（21472138）

譚茂強(qiáng)（1996—），男，碩士研究生，主要研究方向?yàn)樘烊凰幬锘瘜W(xué)。E-mail: 1316042069@qq.com

邱 峰（1967—），男，沈陽藥科大學(xué)52期藥學(xué)日語專業(yè)校友，博士研究生，教授，博/碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幖疤烊划a(chǎn)物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。于1996年日本北海道藥科大學(xué)博士畢業(yè)后，在沈陽藥科大學(xué)從事博士后工作并留校，曾任天然藥物化學(xué)系主任，校學(xué)位委員會(huì)委員、天然藥物化學(xué)學(xué)科主席，教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室副主任等。入選教育部長江學(xué)者特聘教授，國家高層次人才特殊支持計(jì)劃領(lǐng)軍人才和國家百千萬人才工程，科技部重點(diǎn)領(lǐng)域創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)帶頭人，兼任第七、八屆國務(wù)院學(xué)位委員會(huì)中藥學(xué)科評(píng)議組成員，世界中醫(yī)藥學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)中藥化學(xué)專業(yè)委員會(huì)副會(huì)長，全國中醫(yī)藥高等教育學(xué)會(huì)中藥教育研究會(huì)副理事長，教育部高等學(xué)校中藥學(xué)類專業(yè)教育指導(dǎo)委員會(huì)委員，國家自然科學(xué)基金醫(yī)學(xué)科學(xué)部中藥學(xué)學(xué)科組會(huì)評(píng)專家等。Tel: 022-59596223 E-mail: fengqiu20070118@163.com

丁麗琴（1983—），女，博士研究生，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幖疤烊划a(chǎn)物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的研究。Tel: 15522086884 E-mail: ruby70303@163.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]