固相萃取-反相高效液相色譜法測定蛋黃中的斑蝥黃

王鳳芹 劉 鑫 程遠(yuǎn)之 郭冠群 路則慶 汪以真

(浙江大學(xué)飼料科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部(華東)動物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省飼料與動物營養(yǎng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310058)

雞蛋是許多國家重要的食物之一，雞蛋除了含有蛋白質(zhì)、脂肪等常規(guī)營養(yǎng)物質(zhì)外，還含有類胡蘿卜素，類胡蘿卜素在蛋黃中沉積賦予其金黃色或橙色[1]。斑蝥黃化學(xué)名稱為β,β-胡蘿卜-4,4-二酮，主要有全反式(圖1)和順式(圖2)2種異構(gòu)體[2]，它作為一種重要的類胡蘿卜素類紅色色素，被用作禽類的著色劑，以增強(qiáng)禽類皮膚、肌肉以及蛋黃的顏色[3]。除此之外，就像其他類胡蘿卜色素一樣，它還是一種有效的抗氧化劑[4]，但是攝取過量的斑蝥黃可能在人和動物的視網(wǎng)膜上沉積，導(dǎo)致視覺問題[5]。為此，歐洲食品安全局和日本厚生勞動省規(guī)定了蛋黃中斑蝥黃的最高殘留限量分別為30和25 μg/g[6]。因此，有必要建立針對蛋黃中斑蝥黃的定量檢測方法，為禽蛋質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測提供依據(jù)，繼而可以為社會關(guān)切的“化妝的土雞蛋”進(jìn)行準(zhǔn)確地質(zhì)量評價，為養(yǎng)殖場科學(xué)、合理使用色素添加劑提供指導(dǎo)。

圖1 全反式斑蝥黃的化學(xué)結(jié)構(gòu)

圖2 9-順式斑蝥黃的化學(xué)結(jié)構(gòu)

目前，對于禽蛋蛋黃中斑蝥黃殘留的檢測尚無相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)方法。文獻(xiàn)報(bào)道的方法主要有高效液相色譜(HPLC)法[7-9]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)法[2,10-11]?；诟咝б合嗌V法和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法分析蛋黃中斑蝥黃的儀器方法已經(jīng)很成熟，但是往往忽略了對斑蝥黃順反異構(gòu)體的定量[1,12-13]，而據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，斑蝥黃順式異構(gòu)體較全反式異構(gòu)體具有更強(qiáng)的抗氧化性能[14]。另外，減少蛋黃中脂類物質(zhì)的干擾以獲得較高的回收率、簡便的提取和凈化方法，從而建立準(zhǔn)確、快速的蛋黃中斑蝥黃順反異構(gòu)體定量分析方法則是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。

蛋黃中脂類物質(zhì)的去除主要有以下3種途徑。皂化法：Larsen等[15]使用氫氧化鉀的甲醇溶液提取葉黃素類物質(zhì)，但是皂化過程會導(dǎo)致色素降解[2]，因此該方法在后續(xù)文獻(xiàn)中較少報(bào)道。固相萃取(SPE)法：先使用有機(jī)溶劑從樣品基質(zhì)中提取斑蝥黃，比較常見的溶劑有乙腈[16-17]、甲醇[12]、丙酮[12]、石油醚-甲醇-乙酸乙酯混合溶液[9]、乙腈-乙酸乙酯混合溶液[13]以及無水乙醇-二氯甲烷混合溶液[18]等，隨后經(jīng)C18-SPE、硅膠-SPE、氰丙基-SPE、中性氧化鋁-SPE凈化[1,6]。上述乙酸乙酯和二氯甲烷等提取體系對蛋黃中斑蝥黃提取完全，但萃取液中含有大量的脂類物質(zhì)，造成了固相萃取柱堵塞，明顯導(dǎo)致斑蝥黃的回收率過低；此外，凈化過程將斑蝥黃提取液經(jīng)過C18-SPE、硅膠-SPE、氰丙基-SPE以及中性氧化鋁-SPE等固相萃取柱凈化，大都采用復(fù)雜的活化、平衡步驟，在真空泵下操作，費(fèi)時費(fèi)力。液液萃取法：采用正己烷等非極性溶劑分次對蛋黃的乙腈提取液進(jìn)行萃取除脂[17]。乙腈對蛋黃中的斑蝥黃具有很好的提取效率，采用正己烷分次萃取除脂，雖然成本低，但是有機(jī)溶劑消耗量大，正己烷在萃取除脂的過程中造成了部分斑蝥黃損失，也導(dǎo)致斑蝥黃回收率偏低。

針對現(xiàn)有蛋黃中斑蝥黃檢測方法前處理方法復(fù)雜、因脂類物質(zhì)干擾而導(dǎo)致回收率較低、不能對斑蝥黃順反異構(gòu)體同時定量的問題，本試驗(yàn)選用乙腈超聲提取蛋黃中斑蝥黃，取部分提取液與水混合后直接通過PRiME HLB固相萃取柱凈化，濃縮后由反相高效液相色譜(RP-HPLC)檢測，該方法較上述方法易于操作且回收率高，可實(shí)現(xiàn)對蛋黃中斑蝥黃的快速、準(zhǔn)確定量。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 雞蛋

從綜合性大型超市采購新鮮白雞蛋、紅雞蛋、五谷蛋和土雞蛋各10枚。

1.1.2 試劑

1.1.3 主要儀器

高效液相色譜儀(e2695，美國Waters公司)、超聲波清洗器(KQ-500E，昆山市超聲儀器有限公司)、純水儀(Millipore，德國EMD Millipore公司)、電子分析天平(ME204E，瑞士Mettler Toledo公司)、離心機(jī)(ST 40R，美國Thermo Scientific公司)、氮吹儀(N-EVAP 112，美國Organomation公司)。

1.2 色譜分析條件

Welch C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，上海月旭公司)；進(jìn)樣量20 μL；流動相為乙腈-水(95∶5，體積比)；流速：1.2 mL/min；柱溫：30 ℃；二極管陣列檢測器：波長474 nm。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

稱取斑蝥黃62.5 mg(精確到0.000 1 g)，用二氯甲烷溶解并定容至50 mL棕色容量瓶中，混勻，配制成濃度為1 250 μg/mL的斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。分裝后于-18 ℃保存。

準(zhǔn)確移取1 250 μg/mL的斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用乙腈配制成濃度為0.1、0.2、0.5、1.0、2.5、5.0和10.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液?，F(xiàn)配現(xiàn)用。

1.4 樣品的提取與凈化

1.4.1 乙腈提取HLB固相萃取柱凈化(ACN-SPE)

取新鮮雞蛋，分離出蛋黃，隨后將蛋黃混合均勻，再稱取5 g(精確至0.00 1 g，置于50 mL離心管中，并加入10 g無水硫酸鈉和20 mL乙腈，用玻璃棒充分?jǐn)嚢瑁旌暇鶆?，超聲提?0 min，再以5 000×g離心10 min，將提取液收集至50 mL容量瓶中。沉淀用20 mL乙腈重復(fù)提取、離心，合并提取液于容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻，備用。準(zhǔn)確移取5 mL提取液至10 mL離心管中，再加入5 mL水，超聲混勻后過PRiME HLB固相萃取柱，向離心管中先后加入1 mL乙腈和1 mL水，洗滌離心管，洗滌液一并過柱。用5 mL乙腈水溶液(1∶1，體積比)淋洗固相萃取柱，最后用3 mL乙腈洗脫，收集洗脫液于50 ℃氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)確加入0.5 mL乙腈溶解殘?jiān)?，? 000×g離心5 min，取上清液上機(jī)測定。做3次平行測定。

1.4.2 乙腈提取正己烷分次萃取(ACN+n-Hexane)

取新鮮雞蛋，分離出蛋黃，隨后將蛋黃混合均勻，再稱取5 g(精確至0.00 1 g)于50 mL離心管中，加入10 g無水硫酸鈉和20 mL乙腈，用玻璃棒充分?jǐn)嚢?，混合均勻，超聲提?0 min，再以5 000×g離心10 min，將提取液用20 mL乙腈飽和的正己烷萃取，收集乙腈相至50 mL容量瓶中，沉淀重復(fù)提取1次，合并乙腈相于容量瓶中，用乙腈定容至刻度，搖勻，備用。準(zhǔn)確移取5 mL提取液至10 mL離心管中，50 ℃水浴氮吹濃縮至干，準(zhǔn)確加入0.5 mL乙腈溶解殘?jiān)?，? 000×g離心5 min，取上清液上機(jī)測定。做3次平行測定。

1.4.3 乙腈-乙酸乙酯提取HLB固相萃取柱凈化(ACN+EA-SPE)

取新鮮雞蛋，分離出蛋黃，隨后將蛋黃混合均勻，再稱取5 g(精確至0.001 g，置于50 mL離心管中，并加入10 g無水硫酸鈉和20 mL乙腈-乙酸乙酯(1∶1，體積比)，用玻璃棒充分?jǐn)嚢瑁旌暇鶆?，超聲提?0 min，再以5 000×g離心10 min，將提取液收集至50 mL容量瓶中。沉淀重復(fù)提取1次，合并提取液于容量瓶中，并用提取溶劑定容至刻度，搖勻，備用。準(zhǔn)確移取5 mL提取液至10 mL離心管中，50 ℃水浴氮吹濃縮至干，加入5 mL乙腈，超聲15 s，再加入5 mL水，超聲混勻過PRiME HLB固相萃取柱，向離心管中先后加入1 mL乙腈和1 mL水，洗滌離心管，洗滌液一并過柱。用5 mL乙腈水溶液(1∶1，體積比)淋洗固相萃取柱，抽干淋洗液，用3 mL乙腈洗脫，收集洗脫液于50 ℃氮?dú)獯蹈桑瑴?zhǔn)確加入0.5 mL乙腈溶解殘?jiān)?，? 000×g離心5 min，取上清液上機(jī)測定。做3次平行測定。

1.4.4 無水乙醇-二氯甲烷提取HLB固相萃取柱凈化(Ethanol+DCM-SPE)

取新鮮雞蛋，分離出蛋黃，隨后將蛋黃混合均勻，再稱取5 g(精確至0.001 g，置于50 mL離心管中，并加入10 g無水硫酸鈉和20 mL無水乙醇-二氯甲烷(體積比，1∶1)，用玻璃棒充分?jǐn)嚢?，混合均勻，超聲提?0 min，再以5 000×g離心10 min，將提取液收集至50 mL容量瓶中。沉淀重復(fù)提取1次，合并提取液于容量瓶中，并用相應(yīng)的提取溶劑定容至刻度，搖勻，備用。準(zhǔn)確移取5 mL提取液至10 mL離心管中，50 ℃水浴氮吹濃縮至干，加入5 mL 乙腈，超聲15 s，再加入5 mL水，超聲混勻過PRiME HLB固相萃取柱，向離心管中先后加入1 mL乙腈和1 mL水，洗滌離心管，洗滌液一并過柱。用5 mL乙腈水溶液(1∶1，體積比)淋洗固相萃取柱，抽干淋洗液，用3 mL乙腈洗脫，收集洗脫液于50 ℃氮?dú)獯蹈桑瑴?zhǔn)確加入0.5 mL乙腈溶解殘?jiān)?，? 000×g離心5 min，取上清液上機(jī)測定。做3次平行測定。

1.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

篩選不含斑蝥黃的雞蛋——空白雞蛋，分離出蛋黃，隨后將蛋黃混合均勻，再稱取5 g(精確至0.00 1 g)，置于50 mL離心管中，并加入10 g無水硫酸鈉，再向其中分別加入0.2 mL濃度分別為1.25、25.00和100.00 μg/mL的斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)溶液，使蛋黃中斑蝥黃加標(biāo)濃度分別為0.1、1.0和4.0 μg/g，按1.4步驟提取與凈化，計(jì)算回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.6 其他色素干擾性試驗(yàn)

制備蝦青素、玉米黃質(zhì)、葉黃素、斑蝥黃、β-阿樸-8′-胡蘿卜素醛、β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1～0.5 μg/mL)，上機(jī)測定，以考察上述色素的色譜分離情況。

1.7 斑蝥黃檢測方法的應(yīng)用

對所采購的白雞蛋、紅雞蛋、五谷蛋和本雞蛋，采用1.4.1試驗(yàn)步驟進(jìn)行前處理并采用高效液相色譜儀分析其斑蝥黃含量。

1.8 定性與定量

以斑蝥黃異構(gòu)體的紫外-可見吸收光譜圖做比對，進(jìn)行進(jìn)一步的組分定性；統(tǒng)計(jì)色譜圖中斑蝥黃順反異構(gòu)體峰面積總和，根據(jù)斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，采用外標(biāo)法對樣品中斑蝥黃進(jìn)行定量[2]。

試樣中斑蝥黃的含量(順反式斑蝥黃總量)以質(zhì)量分?jǐn)?shù)(w)表示，數(shù)值以微克每克(μg/g)表示，按下式計(jì)算：

w=(ρ×V×V2×n)/(m×V1)。

式中：ρ表示由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的試樣溶液中斑蝥黃的濃度，單位為微克每毫升(μg/mL)；V表示提取液的定容體積，單位為毫升(mL)；V1表示用于凈化的提取液體積，單位為毫升(mL)；V2表示凈化后最終定容體積，單位為毫升(mL)；n表示稀釋倍數(shù)；m表示試樣的質(zhì)量，單位為克(g)。

1.9 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)處理采用Excel 2020統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理和計(jì)算，結(jié)果以平均值來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的線性范圍

按1.3步驟進(jìn)行處理，以斑蝥黃的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)(x)，斑蝥黃順反異構(gòu)體色譜峰面積(響應(yīng)值)總和為縱坐標(biāo)(y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定結(jié)果顯示，斑蝥黃在0.1～10.0 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=173 321x-9 521，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999 9，色譜圖見圖3。

圖3 斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)溶液(1.0 μg/mL)色譜圖

2.2 方法的檢出限與定量限

向空白雞蛋中添加斑蝥黃使之濃度為0.1 μg/g，其信噪比(S/N)大于10，并且經(jīng)前處理后其濃度在線性范圍內(nèi)，該方法的檢出限則根據(jù)S/N=3，確定的檢出限可達(dá)到0.05 μg/g。所以最終確定方法的定量限為0.1 μg/g(圖4)，檢出限為0.05 μg/g，滿足分析方法性能的要求。

圖4 空白蛋黃添加斑蝥黃(0.1 μg/g)色譜圖

2.3 樣品的前處理方法優(yōu)化

考慮到蛋黃中含有大量脂類物質(zhì)，本試驗(yàn)開展了針對乙腈提取液的正己烷分次萃取除脂研究，同時考察了乙腈-乙酸乙酯、無水乙醇-二氯甲烷2個不同混合溶劑提取體系對蛋黃中斑蝥黃的提取效率(與乙腈提取體系對比)。乙腈由正己烷脫脂和乙腈-乙酸乙酯、乙腈和無水乙醇-二氯甲烷3種提取溶劑提取再經(jīng)固相萃取柱凈化后的回收率結(jié)果見圖5。

圖5 不同前處理對斑蝥黃回收率的影響

2.4 方法的準(zhǔn)確度與精密度

在確定最佳提取體系后，計(jì)算斑蝥黃在不同加標(biāo)濃度下的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表1。在加標(biāo)濃度為0.1～4.0 μg/g的濃度范圍內(nèi)，斑蝥黃回收率為85.9%～98.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.7%～8.0%。

表1 斑蝥黃回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.5 其他色素干擾性試驗(yàn)

常用的著色劑如葉黃素、β-阿樸-8′-胡蘿卜素醛、β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯，常被飼料生產(chǎn)商和養(yǎng)殖場添加至飼糧中，為了驗(yàn)證該方法能夠很好地測定出蛋黃中斑蝥黃的含量，而不被其他色素所干擾，本試驗(yàn)考察了蝦青素、玉米黃質(zhì)、葉黃素、斑蝥黃、β-阿樸-8′-胡蘿卜素醛、β-阿樸-8′-胡蘿卜素酸乙酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜分離情況，圖6顯示，在保留時間在11.7 min左右，沒有除斑蝥黃以外的干擾峰。

2.6 檢測方法的應(yīng)用

對所采購的白雞蛋、紅雞蛋、五谷蛋和土雞蛋采用1.4.1試驗(yàn)步驟進(jìn)行前處理并經(jīng)過高效液相色譜儀分析其斑蝥黃含量，結(jié)果見表2。

表2 市售不同類型雞蛋斑蝥黃含量測定結(jié)果

2.7 定性與定量

斑蝥黃的順反異構(gòu)體紫外-可見吸收光譜圖如圖7所示：全反式斑蝥黃的最大吸收波長為474 nm左右，而順式斑蝥黃的最大吸收波長為464 nm左右，除此之外，其在364 nm處還有1個明顯的肩峰。

圖7 全反式斑蝥黃(A)和順式斑蝥黃(B)紫外-可見吸收光譜圖

3 討 論

3.1 前處理?xiàng)l件的選擇

通過比較針對乙腈提取液的2種脫脂方法——正己烷分次萃取除脂和固相萃取柱凈化，以及乙腈、乙腈-乙酸乙酯、無水乙醇-二氯甲烷3個不同溶劑提取體系對蛋黃中斑蝥黃的提取試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：乙腈對蛋黃中的斑蝥黃具有很好的提取效率，采用正己烷分次萃取除脂，雖然成本低，但是有機(jī)溶劑消耗量大，正己烷在萃取除脂的過程中造成了部分斑蝥黃損失，導(dǎo)致斑蝥黃回收率偏低，平均回收率不到80%(如圖5所示)；乙腈-乙酸乙酯和無水乙醇-二氯甲烷提取液中基質(zhì)在固相萃取柱上形成較強(qiáng)吸附，明顯降低了斑蝥黃的回收率，二者的平均回收率分別為37.1%和45.5%(如圖5所示)。此外，斑蝥黃提取過程中未凈化完全的基質(zhì)在色譜柱不能被完全洗脫，造成了色譜柱柱效降低，也使得儀器系統(tǒng)壓力升高。

斑蝥黃具有脂溶性，并具有很強(qiáng)的疏水性，而PRiME HLB作為反相固相萃取吸附劑，對斑蝥黃具有很好的保留。整個凈化過程無需要活化和平衡，在常壓下實(shí)現(xiàn)了樣品的凈化。文獻(xiàn)報(bào)道的將斑蝥黃提取液經(jīng)過C18-SPE、硅膠-SPE、氰丙基-SPE以及中性氧化鋁-SPE等固相萃取柱凈化，大都采用復(fù)雜的活化、平衡步驟，在真空泵下操作；乙腈作為斑蝥黃的提取溶劑，與水混勻后，直接過固相萃取柱，無需濃縮至干，避免了加熱可能造成的斑蝥黃分解。

因此，本試驗(yàn)選用乙腈超聲提取蛋黃中斑蝥黃，取部分提取液與水混合后直接通過PRiME HLB固相萃取柱凈化。

3.2 方法學(xué)考察

斑蝥黃在0.1～10 μg/mL的濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.999；蛋黃中斑蝥黃的檢出限為0.05 μg/g，定量限為0.1 μg/g，說明該方法具有較好的靈敏度；在低、中、高3個加標(biāo)濃度下，斑蝥黃的平均回收率大于85%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，說明該方法具有較高的準(zhǔn)確性和精密度；常見色素色譜峰對斑蝥黃的順反異構(gòu)體色譜峰沒有產(chǎn)生干擾，表明該方法專一性好；通過應(yīng)用發(fā)現(xiàn)，該方法適用于對市場上新鮮商品雞蛋蛋黃中斑蝥黃的快速、準(zhǔn)確檢測。

3.3 斑蝥黃的定性與定量

在對斑蝥黃定量時統(tǒng)計(jì)的是2種異構(gòu)體的總量[2]。斑蝥黃標(biāo)準(zhǔn)品主要成分為全反式異構(gòu)體，含量達(dá)95%以上，其次還有部分順式異構(gòu)體。而對雞蛋黃中斑蝥黃分析過程中發(fā)現(xiàn)，斑蝥黃順式異構(gòu)體約占15%。

4 結(jié) 論

① 本試驗(yàn)采用乙腈在超聲波輔助下成功提取了蛋黃中的斑蝥黃，斑蝥黃乙腈提取液用水稀釋后直接過PRiME HLB固相萃取柱，以乙腈和水的混合溶液洗脫，乙腈淋洗，即可完成樣品的前處理。

② 蛋黃中斑蝥黃的檢出限為0.05 μg/g，定量限為0.1 μg/g。斑蝥黃在0.1～10.0 μg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.999。在3個加標(biāo)濃度(0.1、1.0和4.0 μg/g)下，斑蝥黃的回收率為85.9%～98.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～8.0%。

③ 應(yīng)用上述乙腈提取+固相萃取-反相高效液相色譜法對市場上新鮮商品雞蛋蛋黃中斑蝥黃進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示所選購市售雞蛋蛋黃中斑蝥黃含量差異較大，從低于0.1 μg/g到高達(dá)8.3 μg/g不等。

④ 綜上可知，本試驗(yàn)建立的固相萃取-反相高效液相色譜法測定蛋黃中斑蝥黃的方法可應(yīng)用于對新鮮商品雞蛋蛋黃中斑蝥黃的快速、準(zhǔn)確定量。