便攜式微型液相色譜儀的研制

付 強, 楊利民, 王秋泉*

(1. 廈門大學化學化工學院, 譜學分析與儀器教育部重點實驗室, 福建 廈門 361005; 2. 廣州匯標檢測技術(shù)中心, 廣東 廣州 510700)

液相色譜(liquid chromatography, LC)是涉及復雜樣品分離分析的核心技術(shù)之一[1]。近年來,伴隨著現(xiàn)場和綠色低能耗分析檢測以及靈活多變的聯(lián)用技術(shù)的色譜偶聯(lián)需求,現(xiàn)有大型LC儀器微型化便攜式的趨勢愈發(fā)凸顯。但是,為了提高色譜分離效能而配備細顆粒固定相色譜填充柱的LC要求使用高壓柱塞式機械泵來克服隨之而來的流動相傳輸阻力,在一定程度上制約了LC儀器小型化便攜化研究的快速發(fā)展。盡管如此,隨著電子、光學和微加工技術(shù)的進步和毛細管整體色譜固定相的出現(xiàn)以及相關微型化檢測技術(shù)的不斷發(fā)展,便攜式小型化/微型化LC儀器不斷涌現(xiàn)。目前已報道的小型化/微型化便攜式LC主要有以下幾類:1)早期的小型化LC儀器主要是沿襲傳統(tǒng)LC儀器結(jié)構(gòu)框架,使用常規(guī)色譜柱,對柱塞機械泵和檢測器等部件進行小型化。這類儀器的體積和重量雖然比實驗室傳統(tǒng)LC儀器小,實現(xiàn)了可移動,但距便攜式微型LC的要求仍有距離[2-6]; 2)采用壓縮氣體[7,8]或熱膨脹泵[9]驅(qū)動流動相為LC微型化提供了可能性;3)使用電滲泵、毛細管微柱和微型檢測器,可以使儀器達到較高的微型化程度[10-13]; 4)使用高壓注射泵、毛細管整體柱和微型檢測元件,制作便攜式微型LC儀器,因其穩(wěn)定可靠,已成為了便攜式微型LC儀器發(fā)展的主流[11-17]。

自2003年開始,我們課題組著手研制便攜式微型液相色譜儀(portable micro LC,p-μLC)并制作了首臺p-μLC[14]。該儀器以注射泵驅(qū)動流動相、自制毛細管整體柱作為固定相,使用自行研制的紫外-可見吸收/熒光兩用流通池-光纖光譜儀進行檢測,儀器總重輕至11 kg。儀器采用了模塊化結(jié)構(gòu),主要部件包括注射泵、自主設計研制的光纖式紫外-可見吸收/熒光兩用微型流通池[18]及配套使用的光纖組件[19]、毛細管聚合物整體柱[20,21]和可調(diào)式色譜柱-流通池安裝架[22]、微型光柵光譜儀和發(fā)光二極管光源、鹵鎢燈光源、手動進樣閥、平板控制電腦等。儀器原理流程如圖1所示:流動相由注射泵驅(qū)動,從進樣閥注入的樣品進入毛細管整體柱進行分離,樣品中的不同物質(zhì)依次被洗脫進入流通池;光源發(fā)出的光由光纖導入流通池,根據(jù)不同光纖連接方式實現(xiàn)紫外-可見吸收或熒光檢測兩種模式,透射光/熒光經(jīng)由光纖導入微型光柵光譜儀進行檢測,檢測信號經(jīng)計算機處理得到相應的色譜圖,整個過程可以通過觸摸式平板電腦進行控制。

圖1 p-μLC結(jié)構(gòu)和工作原理Fig. 1 Structure and operational principle of p-μLCa. UV-Vis detection mode; b. fluorescence detection mode.

針對前期研制的p-μLC注射泵推力不足流量不夠穩(wěn)定、微型檢測元件設計不夠合理、流通池內(nèi)部組件安裝定位困難等問題,我們對p-μLC進行了不斷的改進[23]。在升級p-μLC過程中,我們重新設計研制了新的緊湊型大推力注射泵和新的檢測器流通池結(jié)構(gòu)以及光纖組件,配備了大功率LED/脈沖氙燈組合光源等關鍵部件,優(yōu)化了儀器結(jié)構(gòu),進一步提升了p-μLC的性能、減小了儀器體積和重量。

1 p-μLC的整體結(jié)構(gòu)設計

升級版p-μLC沿用了我們前期制作的p-μLC的基本模塊化結(jié)構(gòu)[14],主要部件包括1)可梯度驅(qū)動流動相的注射泵組件和微量進樣閥;2)毛細管聚合物整體柱和安裝架;3)自主設計研制的紫外-可見吸收/熒光兩用微型流通池光纖組件,以及4)小型LED/脈沖氙燈組合光源和微型光柵光譜儀[23]。在改進型p-μLC儀器研制過程中,重新設計了儀器結(jié)構(gòu)及各部件的組裝位置和裝配方式,進一步縮小了儀器體積,增加了結(jié)構(gòu)強度。改進設計的p-μLC采用了手提箱式整體結(jié)構(gòu)(335 mm×250 mm×155 mm)。儀器分為上蓋和箱體兩部分,上蓋內(nèi)裝有儀器控制-數(shù)據(jù)采集模塊;箱體中裝配有儀器的其他組件,包括光源模塊、色譜柱-流通池模塊、光譜儀模塊和流路模塊等。各模塊的結(jié)構(gòu)相對獨立,分別安裝在機箱底部的底架或箱體壁上,方便拆裝和維護。儀器全重約8 kg。儀器各模塊在機箱中的位置和結(jié)構(gòu)見圖2。

圖2 升級版p-μLC的(a)主要模塊分布圖和(b)部件安裝位置示意圖(頂視圖)Fig. 2 Schematic of (a) arrangement of modules and (b) components p-μLC (top view)

儀器的實物圖見圖3。儀器工作時,箱蓋呈打開狀態(tài),一塊面板遮蓋住注射泵和光源部分,面板上可以放置超薄鍵盤,流動相補充瓶和廢液瓶置于主機箱之外。

圖3 p-μLC的照片F(xiàn)ig. 3 Photographs of p-μLCa. on-mode; b. off-mode; c. internal structure.

2 p-μLC主要模塊的設計制作

2.1 流路模塊

針對前期研制的p-μLC注射泵推力不足,注射器夾持不牢固導致的流路不穩(wěn)定的問題,我們重新設計制作了一種結(jié)構(gòu)緊湊的大推力注射泵。為了提高注射泵的壓力輸出能力,采用了大扭矩步進電機和齒輪減速機以得到更大的靜推力,注射泵滑塊能產(chǎn)生的理論最大推力為760 N;設計制作的新注射器支架,可保證固定外徑在15 mm以下的帶鎖緊接頭的高壓注射器(Hamilton 1010LT 10 mL, Hamilton,瑞士),實現(xiàn)雙向推拉;優(yōu)化設計注射泵結(jié)構(gòu),增加強度同時減小體積和重量;兩套注射泵通過三通連接器并聯(lián),可以實現(xiàn)梯度洗脫。儀器注射泵可控流速范圍從0.025 μL/min到5.6 mL/min,該泵在實際使用中可以達到的最大工作壓強為4.5 MPa。注射泵實物圖如圖4所示。注射泵包括注射器支架和注射泵主體,分別安裝在儀器流路模塊注射器面板的上下兩邊。注射器支架安裝在注射泵面板上,其上固定有注射器。注射泵主體安裝在注射泵面板之下,其中包括步進電機、減速齒輪、絲桿、滑塊等運動系統(tǒng)零部件。步進電機輸出的扭矩經(jīng)減速齒輪放大傳遞到具有一定螺距的絲桿上,推動滑塊在兩根光軸組成的軌道上平移直線運動,注射泵滑塊連接注射器活塞,對注射器進行推拉動作。步進電機軸末端的截止傳感器可以在滑塊運行到極限位置或受

圖4 自制大推力注射泵泵體結(jié)構(gòu)實物圖Fig. 4 Photographs of the internal structure of the home-made large-thrust syringe pumpsa. top view, b. sectional view, c. set-up view.

到阻力過大時自動停轉(zhuǎn)步進電機,以防止機械損壞或電機燒損。

為了提高注射泵連續(xù)工作能力,避免頻繁拆裝注射器,在流路系統(tǒng)中通過一個位于注射泵和三通混合器之間的低壓六通閥(IDEX Scientific,美國)來實現(xiàn)注射器再裝填功能。流動相再裝填組件安裝在流路模塊中,六通切換閥安裝在流路模塊面板之下,其旋鈕位于進樣口附近。其工作原理如圖5所示。六通閥由手動操作,位于裝填位置時注射器分別與對應的補充溶劑瓶聯(lián)通,兩套注射泵同時執(zhí)行抽吸動作,可以向注射器中填充流動相;當六通閥切換到輸出位置,注射器流路輸出與三通混合器聯(lián)通,注射泵執(zhí)行推動作,輸出流動相。儀器進樣閥采用VICI C4-0004-.05微量進樣閥(VICI,瑞士),進樣體積為0.05 μL。閥體安裝在流路模塊面板之下,進樣扳柄和獨立的進樣針口部件位于流路模塊面板上。

圖5 流動相再裝填流路示意圖Fig. 5 Schematic of the mobile phase reloading system

2.2 光源和檢測器模塊

為升級p-μLC,我們重新設計制作了光源模塊。新的光源模塊由小型化光纖LED光源和Ocean Optics PX-2脈沖氙燈光源組合而成。自制光纖LED光源的發(fā)光元件使用了LUXEON大功率LED(LUXEON,美國),光源中同時安裝了3 W白光LED和1 W的藍光LED,通過獨立的光纖端口輸出,分別作為400～680 nm可見光源和480 nm熒光激發(fā)光源,使用時可以選擇白光或藍光輸出。大功率LED工作時發(fā)熱量較大,因此自制光源內(nèi)部設置了散熱片和散熱風扇。儀器使用Ocean Optics PX-2型脈沖氙燈光源作為紫外波段光源。PX-2脈沖氙燈光源是高閃光頻率短弧氙燈(工作波長220～750 nm),最高工作頻率220 Hz。為方便安裝,PX-2脈沖氙燈除去了外殼,與自制光纖LED光源共同裝配在自制支架上成為一個整體的光源模塊。自制LED光纖光源和組合式光源模塊實物照片見圖6。

圖6 自制LED光纖光源結(jié)構(gòu)和光源模塊實物圖Fig. 6 Structure of the home-made miniaturized lightemission diode (LED) fiber-optical source and photographs of the light source module

儀器檢測系統(tǒng)的核心是光纖式紫外-可見吸收/熒光兩用流通池。在流通池兩端通過光纖連接光路,其中光路入口端連接一條分岔光纖,光路出口端連接的是單根光纖,分岔光纖的一支連接光源,另一支和出口單根光纖可以分別連接光柵光譜儀。使用毛細管整體柱進行分離后檢測時要求流通池死體積盡量小。為減小流通池體積和盡量提高通光效率,流通池中使用了光導石英毛細管作為流通池光路部分的內(nèi)腔。光導毛細管內(nèi)壁石英層與外表面聚酰亞胺涂層之間存在一層折射率較低的摻雜石英層,兩層石英之間的界面可以形成全反射界面;從管內(nèi)射向管壁的光線入射角大于臨界角23.6°時會發(fā)生全反射而折回管內(nèi),減少了流通池光路內(nèi)壁對光線的吸收,從而提高了光通量,有助于提高熒光檢測靈敏度。流通池中,光纖和光導毛細管之間使用自聚焦透鏡作為光路耦合器件。自聚焦透鏡又稱為梯度變折射率透鏡,其折射率分布是沿徑向漸變的柱狀光學透鏡,此處應用其聚焦功能作為光路耦合器件,同時兼做流通池窗口。從光纖射出的發(fā)散光經(jīng)過自聚焦透鏡時會匯聚進入流通池,從光導毛細管射出的發(fā)散光在經(jīng)過自聚焦透鏡時也會匯聚進入光纖,減少了光的發(fā)散損失,提高光路耦合效率。流通池的工作原理如圖7所示。在紫外-可見吸收檢測模式下,來自光源的入射光由分岔光纖的一條分支進入流通池,在光導毛細管中經(jīng)過樣品溶液吸收后,透射光由出口的單根光纖導入光譜儀測量,得到吸光度信號;在熒光檢測模式下,光源通過分岔光纖的一支與流通池一端的光路入口相連,光譜儀通過分岔光纖的另一條分支與流通池相連。從光源發(fā)出的光由分岔光纖的一支導入流通池作為激發(fā)光,激發(fā)樣品溶液中的熒光性物質(zhì)發(fā)出各向同性的熒光,其中與激發(fā)光呈反方向的熒光經(jīng)過光路入口端的自聚焦透鏡,由分岔光纖的另一支導入光譜儀,測定熒光強度,扣除雜散光背景后可得到熒光強度信號。

圖7 自制兩用流通池的工作原理示意圖Fig. 7 Operating principle of the home-made dual functional flow cella. schematic of the flow cell; b. principle of the light-guide capillary; c. principle of the self-focusing lens.

改進型p-μLC的研制過程中,在原有流通池基礎上重新設計制作了流通池,由池體、PEEK襯管、自聚焦透鏡、密封墊圈、光纖、液體流路管路等零部件構(gòu)成。為解決原有流通池流路入口和出口位于池體對側(cè)、占用空間較大且不易精確組裝的問題,新的流通池中流路結(jié)構(gòu)由原有的Z形改為H形,流路進口和出口位于池體的同側(cè),適應了更為緊湊的儀器結(jié)構(gòu)要求;改進了流通池的光路/流路元件組裝方式,簡化了組裝步驟并提高了使用穩(wěn)定性;使用石英光纖制作了適配新流通池光路接口的分岔光纖和直通光纖組件。H形流路流通池的結(jié)構(gòu)如圖8中所示。流通池體內(nèi)沿著長軸方向有一個通孔作為光路孔,光路孔中各部件從內(nèi)到外對稱分布,依次為光路管、密封墊片、光路密封接頭。光路密封接頭由自聚焦透鏡、超級無凸緣卡套和手緊接頭組成。光導纖維和光導毛細管之間使用自聚焦透鏡作為光路耦合器件,自聚焦透鏡作為光路耦合器件的同時還起到了流通池窗口的作用,減少了光的發(fā)散損失,提高光路耦合效率。自聚焦透鏡安裝在內(nèi)徑1.8 mm的超級無凸緣卡套中,流路依靠卡套實現(xiàn)定位和密封。流通池的流路入口和流路出口位于流通池體的同側(cè),流路出入口通道與光路孔垂直,石英毛細管整體柱尾端直接插入流通池中,伸入到光路孔中以盡量減少死體積,流通池光程長為20 mm,死體積約為0.4 μL。升級版p-μLC采用了Ocean Optics USB2000型微型光柵光譜儀(Ocean Optics USB2000,美國)作為光學檢測模塊。該光譜儀以光柵為分光器件、以電荷耦合器件(CCD)為感光元件,光譜儀尺寸為89.1 mm×63.3 mm×34.4 mm,光譜檢測范圍200～1 100 nm,光譜分辨率0.3～10 nm。光譜儀與控制計算機通過通用串行總線(USB)電纜連接,通過RS-232接口與PX-2光源進行脈沖同步。

圖8 自制的H形流路流通池結(jié)構(gòu)剖面圖Fig. 8 Cutaway view of the home-made H-shaped flow cell

此外,為適應升級版p-μLC的結(jié)構(gòu),設計制作了新的毛細管柱-流通池安裝架,通過兩端固定保護整體柱,可以安裝長度為18～23 cm的石英毛細管整體柱,新的毛細管柱-流通池安裝架是升級版p-μLC內(nèi)部框架結(jié)構(gòu)的一部分。

2.3 功能控制、數(shù)據(jù)采集和電源模塊

儀器控制和數(shù)據(jù)采集模塊包括工控主板、顯示屏/觸摸屏、注射泵控制單片機和USB hub等主要部件,全部安裝在厚度30 mm的儀器箱體上蓋中,提高了集成程度。儀器的數(shù)據(jù)采集和控制部分采用了PPC-121T/BEL平板電腦,硬件部分包括PCM-613主板、Intel Celeron M移動處理器、256M SDRAM、12寸觸摸顯示屏等。前期p-μLC上采用USB2000光譜儀配用的OOIBase32數(shù)據(jù)采集軟件和自編的圖形化的注射泵控制軟件分別實現(xiàn)光譜采集和泵的控制功能。OOIBase32數(shù)據(jù)采集軟件側(cè)重于光譜數(shù)據(jù)的采集。升級版p-μLC儀器配備了自行編制的全新的集成化儀器操作界面軟件OOLab,該軟件可以實現(xiàn)注射泵、光源和光柵光譜儀的控制,光譜、色譜信號的實時采集、顯示與記錄,色譜圖和色譜數(shù)據(jù)的存儲、分析處理和報告輸出等功能。儀器可以使用外置電源,電源變壓器輸出規(guī)格DC 12V 3A;儀器整體設計過程中在機箱底部預留了容納電池組的空間,可以適時使用18650電芯鋰電池組供電,便于野外現(xiàn)場使用。

3 儀器性能測試

3.1 檢測器性能測試

使用標準溶液直接進樣方式離線測試檢測系統(tǒng)[23]。使用直接紫外吸收檢測模式檢測苯并[α]芘,檢出限達到0.014 μg/L;在應用4-(2-吡啶偶氮)間苯二酚在線衍生檢測水中的重金屬元素Cd2+離子,檢出限為10.0 μg/L;應用偶氮胂Ⅲ在線衍生檢測稀土元素La3+離子,檢出限為8.41 μg/L。應用過硫酸鉀氧化-紫外吸收光度法,初步建立了測定水中總氮的實驗方法,檢出限為27.7 μg/L。檢測系統(tǒng)以熒光檢測模式使用時,檢測熒光素的檢出限為200 μg/L,檢測熒光素的靈敏度較低的原因可能是由于熒光檢測模式下背景散射噪聲較高,儀器檢測系統(tǒng)結(jié)構(gòu)尚在進一步優(yōu)化中。

3.2 色譜分離測試

在升級版p-μLC上測試其色譜分離功能。使用自制甲基丙烯酸酯C-18有機聚合物毛細管整體柱為分離柱[20,21],分別在自制p-μLC和商品化HPLC儀器上比較了典型苯系物探針分子的分離效果(見圖9)。在等度洗脫模式下,使用乙腈-水(70/30, v/v)流動相,苯系物分子都實現(xiàn)了基線分離,樣品峰對稱性良好,基線平穩(wěn);說明我們自行研制的p-μLC的分離檢測性能可以與商品化HPLC儀器相媲美。

圖9 苯系物在p-μLC和商品化HPLC儀器上的分離譜圖Fig. 9 Chromatograms of alkylbenzenes on the p-μLC and commercial HPLC Column: polymethacrylate based C-18 monolith column (20 cm×530 μm); mobile phase: ACN-H2O (70/30, v/v); flow rate: 20 μL/min; detection mode: UV, 254 nm; sample concentration: 1 μg/mL each; sample size: 0.05 μL.

4 結(jié)論

我們研制了一種p-μLC儀器。儀器包括了自主設計研制的大推力注射泵、毛細管整體柱、自制的高亮度二極管和脈沖氙燈光纖光源和改進結(jié)構(gòu)的紫外-可見/熒光檢測裝置,可以實現(xiàn)恒流和梯度洗脫分離模式,并根據(jù)樣品的特性可選用紫外-可見吸收或熒光檢測;在具備了基本的色譜分離和檢測功能的同時,實現(xiàn)了微型化便攜式。該儀器結(jié)構(gòu)緊湊,體積小,重量輕,防水、抗震,方便攜帶,適于野外現(xiàn)場監(jiān)測使用。隨著各種新型有機-無機雜化毛細管整體材料研究的不斷進步[21,24-26],p-μLC不僅將為野外現(xiàn)場監(jiān)測提供便攜式的檢測工具,也將靈活地與各類實驗室檢測儀器,如質(zhì)譜等,聯(lián)合使用,提高工作效率。

致謝: 感謝廈門大學環(huán)境與生物分析實驗室參與研制便攜式微型液相色譜儀的已畢業(yè)和正在開展相關研究的研究生同學們的辛勤工作。