微小RNA在急性肺損傷中的研究進(jìn)展

金小紅， 施 烜， 呂 欣

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬上海市肺科醫(yī)院麻醉科，上海 200433； 2. 南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科，南昌 330006)

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)是由多種原因引起的以急性、進(jìn)行性呼吸功能不全為特征的呼吸系統(tǒng)危重疾病，急性肺損傷進(jìn)一步可發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome， ARDS)。研究發(fā)現(xiàn)ARDS的患病率和死亡率非常高，重度ARDS死亡率可高達(dá)46.1%[1]。急性肺損傷主要損傷了肺泡上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，因此，從細(xì)胞和分子病理學(xué)層面探索新的治療方法和治療藥物改善細(xì)胞損傷成為當(dāng)前熱點(diǎn)課題，由于微小RNA(microRNA, miRNA)在許多疾病中特異性表達(dá)(顯著上調(diào)或下調(diào))，并在患者血清中容易檢測(cè)且靈敏度高，因此可作為研究的重要切入點(diǎn)。

1 miRNA的基本分子特征

miRNA在細(xì)胞核內(nèi)合成，主要被RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄為初始miRNA，然后被Drosha/DGCR8復(fù)合體剪切成70～100個(gè)核苷酸的前體miRNA，再通過(guò)輸出蛋白5轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)被Dicer/TRBP復(fù)合體處理為21～25個(gè)核苷酸的雙鏈RNA分子，最后降解成單鏈的成熟miRNA與特定靶基因的3’-UTR(非翻譯區(qū))結(jié)合，降解mRNA或抑制其蛋白質(zhì)翻譯[2]。目前已通過(guò)高通量測(cè)序、基因芯片等技術(shù)篩選出大量與肺損傷相關(guān)的miRNAs，并在動(dòng)物及細(xì)胞等層面驗(yàn)證miRNAs參與了肺損傷的調(diào)控見(jiàn)表1～2。

表1 miRNAs在ALI中表達(dá)譜變化

2 與肺泡上皮細(xì)胞相關(guān)miRNAs

肺泡上皮細(xì)胞是肺泡血管屏障的主要組成部分，損傷會(huì)導(dǎo)致屏障功能下降，并且由于肺泡上皮完整性的破壞以及表面活性物質(zhì)合成減少導(dǎo)致肺水的清除障礙，最終導(dǎo)致肺纖維化。miRNAs通過(guò)介導(dǎo)多種信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡及炎癥因子表達(dá)，從而影響肺泡上皮細(xì)胞功能。

表2 miRNAs在各種細(xì)胞內(nèi)參與調(diào)控ALI

2.1 保護(hù)性miRNAs

在脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)的肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(alveolar type Ⅱ epithelial cell, ATⅡ)中miR-145-5P顯著下調(diào)[3]，人癌系肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(adenocarcinomic human alveolar epithelial cell， A549)中miR-16[4]、miR-140[5]和miR-140-5p[6]也明顯下降，并且上述miRNAs均與Toll樣受體4(toll like receptor 4, TLR4)mRNA的3’-UTR結(jié)合。TLR4定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，是LPS的模式識(shí)別受體[31]，與LPS結(jié)合后觸發(fā)信號(hào)級(jí)聯(lián)效應(yīng)，激活了下游NF-κB通路[32]，因此過(guò)表達(dá)miR-145-5p、miR-16、miR-140及miR-140-5p可以抑制TLR4的表達(dá)，阻斷NF-κB通路的活化，降低炎癥因子的表達(dá)，從而減輕ALI。

也有研究發(fā)現(xiàn)在高氧誘導(dǎo)的肺泡 Ⅱ 型上皮細(xì)胞(type 2 alveolar epithelial cell, AECⅡ、T2AEC)中miR-16表達(dá)明顯下降[33]，且LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞中miR-216a[7]的表達(dá)也顯著下調(diào)。過(guò)表達(dá)miR-16促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制其凋亡，這可能與TGF-β/Smad2和JAK/STAT3通路有關(guān)[33]。而miR-216a是通過(guò)靶向JAK激酶2(janus kinase, JAK2)來(lái)調(diào)節(jié)JAK2/STAT3和NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)抑制細(xì)胞凋亡、自噬及炎癥因子釋放[7]。Kloss等[34]發(fā)現(xiàn)TGF-β/Smad通路主要調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡和遷移等過(guò)程。而JAK/STAT通路調(diào)控細(xì)胞因子、黏附分子和炎癥因子轉(zhuǎn)錄[35]。所以miRNAs可以通過(guò)介導(dǎo)多種信號(hào)通路(TGF-β/Smad、JAK/STAT和NF-κB)來(lái)緩解ALI。

2.2 損傷性miRNAs

在LPS誘導(dǎo)ATⅡ細(xì)胞[8]和暴露于高氧的T2AEC、小鼠肺上皮細(xì)胞-12(murine lung epithelial-12， MLE12)中[19]發(fā)現(xiàn)miR-34a表達(dá)明顯升高，結(jié)果證實(shí)miR-34a可以與自噬相關(guān)基因叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O3(forkhead box O3, FoxO3)[8]及血管生成素1(angiopoietin-1,Ang1)[9]的3’-UTR結(jié)合。既往研究表明FoxO3能夠抑制NF-κB的活性[36]，而Fang等[37]發(fā)現(xiàn)Ang1可以抑制人T2AEC中的NF-κB活性來(lái)恢復(fù)上皮細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)的通透性。所以,miR-34a通過(guò)靶控FoxO3或Ang1介導(dǎo)NF-κB通路來(lái)調(diào)控肺泡上皮細(xì)胞功能。

LPS誘導(dǎo)的AEC模型中，靶向B淋巴細(xì)胞瘤2相關(guān)蛋白A1(B cell lymphoma 2 related A1, BCL2A1)基因的miR-326激活了NF-κB信號(hào)軸[10]，另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)LPS處理的A549細(xì)胞中miR-300靶控抑制性κBα蛋白(inhibitor kappa B α, ⅠκBα)，活化了NF-κB通路[11]。而在靜息狀態(tài)下,NF-κB二聚體與IκB蛋白結(jié)合后存留于胞質(zhì)中[38],當(dāng)肺損傷后，細(xì)胞受到外源性刺激,NF-κB活化進(jìn)入細(xì)胞核啟動(dòng)了炎癥反應(yīng)[39]。結(jié)果證明過(guò)表達(dá)miR-326和miR-300都可通過(guò)介導(dǎo)NF-κB信號(hào)通路導(dǎo)致促炎因子表達(dá)增加，并促進(jìn)肺泡上皮細(xì)胞凋亡，而抑制miR-326和miR-300的表達(dá)則可以緩解急性肺損傷。

3 與血管內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)miRNAs

ALI導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白解聚，細(xì)胞間連接松散，最終導(dǎo)致血管壁通透性增加及單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、多核細(xì)胞等炎性細(xì)胞聚集。miRNAs靶向血管內(nèi)皮細(xì)胞的mRNAs，參與內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的改變，包括對(duì)細(xì)胞周期、凋亡、細(xì)胞層通透性和炎癥信號(hào)的調(diào)節(jié)，從而調(diào)控肺損傷相關(guān)內(nèi)皮細(xì)胞的功能。

3.1 保護(hù)性miRNAs

LPS誘導(dǎo)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)miR-339-3p、miR-539-5p和miR-33均低表達(dá)。研究證實(shí)miR-339-3p靶向膜聯(lián)蛋白A3(annexin A3, Anxa3)，抑制AKT/mTOR通路[12]，而Anxa3參與調(diào)控細(xì)胞骨架蛋白的相互作用、細(xì)胞分化、增殖、凋亡和炎癥反應(yīng)等[40]，且AKT/mTOR通路也調(diào)控細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)[41]。熒光素酶報(bào)告基因證實(shí)Rho相關(guān)卷曲螺旋形成蛋白激酶1(Rho associated coiled coil conta-ining protein kinase 1, ROCK1)是miR-539-5p的靶基因[13]，而ROCK1與ALI的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡有關(guān)[42]。因此miR-339-3p和miR-539-5p都減少急性肺損傷中的細(xì)胞凋亡和炎癥因子的表達(dá)水平。miR-33與受體相互作用蛋白140表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[14]，受體相互作用蛋白140是NF-κB輔助激活物，通過(guò)招募環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein, CREB)調(diào)節(jié)促炎因子的產(chǎn)生[43]，過(guò)表達(dá)miR-33減輕了ALI的炎癥反應(yīng)。

3.2 損傷性miRNAs

LPS和高氧刺激內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cell, EC)后，發(fā)現(xiàn)miR-34a-5p介導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙與組蛋白去乙?；?(sirtuin type 1, SIRT1)表達(dá)降低和p53的表達(dá)升高有關(guān)[15]，SIRT1通過(guò)介導(dǎo)p53促使凋亡蛋白Bax進(jìn)入線粒體，導(dǎo)致線粒體氧化應(yīng)激損傷[44-45]。LPS顯著刺激了肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中miR-1246和miR-92a的表達(dá)。由于miR-1246靶向血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)基因[16]，ACE2又是通過(guò)裂解AngⅡ 產(chǎn)生血管緊張素1-7來(lái)使AngⅡ 失活[46]，而AngⅡ 與受體結(jié)合調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡來(lái)緩解急性肺損傷[47]。結(jié)果證明抑制miR-34a-5p或miR-1246的表達(dá)可抑制氧化應(yīng)激，減輕內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，降低炎癥因子表達(dá)水平。抑制miR-92a，可以增加其靶基因整聯(lián)蛋白α5(integrin α 5, ITGA5)的表達(dá)[17]，ITGA5在細(xì)胞黏附、增殖、遷移中起著關(guān)鍵作用[48]。結(jié)果也證實(shí)ITGA5明顯增加肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，增強(qiáng)血管生成，改善內(nèi)皮細(xì)胞功能，并減少促炎因子釋放。研究顯示miR-92a與ITGA5的上述作用可能與PI3K/AKT、NF-κB通路相關(guān)[49]。

4 與巨噬細(xì)胞相關(guān)miRNAs

巨噬細(xì)胞具有吞噬、分泌等多種功能，在急性肺損傷早期，分泌多種細(xì)胞因子啟動(dòng)級(jí)聯(lián)炎性反應(yīng)。大量的研究表明miRNAs參與免疫調(diào)節(jié)，單核細(xì)胞的發(fā)育、分化、增殖及等中心環(huán)節(jié)。

4.1 保護(hù)性miRNAs

在LPS誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(mouse peritoneal macrophage cell, RAW264.7)中，miR-497和miR-30b-5p的表達(dá)下降。抑制miR-497的表達(dá)增加了白介素1受體相關(guān)激酶2(interleukin-1 receptor-associated kinase 2, IRAK2)的表達(dá)，卻抑制了NF-κB通路蛋白的表達(dá)[18]。在TLR早期，IRAK1和IRAK2都發(fā)揮重要作用，但在后期IRAK2則起著關(guān)鍵作用[50]。既往研究發(fā)現(xiàn)IRAK2參與了IL-1誘導(dǎo)的NF-κB通路的激活[51]。miR-30b-5p可以和細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3, SOCS3)的3’-UTR結(jié)合[19]，而SOCS家族介導(dǎo)多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生[52]，且SOCS3負(fù)調(diào)控JAK/STAT3通路介導(dǎo)肺巨噬細(xì)胞炎癥[53]。綜上所述，miR-497和miR-30b-5p都能抑制ALI炎癥因子的表達(dá)。

LPS導(dǎo)致肺泡巨噬細(xì)胞中miR-495和miR-802的表達(dá)顯著下調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)miR-495基因啟動(dòng)子甲基化導(dǎo)致miR-495降解，活化炎癥小體3(nod like receptor family pyrin domain containing 3, NLRP3)，而抑制miR-495的降解可以減輕肺泡巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和焦亡，緩解ALI[20]。You等[21]證實(shí)miR-802通過(guò)靶控皮層E3泛素蛋白連接酶家族2(pellino E3 ubiquitin protein ligase family member 2, Peli2)來(lái)改善肺損傷。Peli2通過(guò)促進(jìn)LPS誘導(dǎo)NLRP3的泛素化來(lái)介導(dǎo)NLRP3的激活[54]。而NLRP3與肺部炎性疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[55]?？傊?，miR-495和miR-802都可以通過(guò)NLRP3信號(hào)軸介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，改善ALI。

4.2 損傷性miRNAs

在LPS誘導(dǎo)RAW264.7中發(fā)現(xiàn)miR-92a及miR-34b-5p的表達(dá)明顯上調(diào)。miR-92a通過(guò)與10號(hào)染色體上的磷酸酯酶與張力蛋白同源物(gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten, PTEN)的3’-UTR結(jié)合并阻斷PTEN/AKT/NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)抑制炎癥反應(yīng)[22]。PTEN在增殖、凋亡和炎癥等多種過(guò)程中起關(guān)鍵作用，并能夠抑制PI3K/AKT信號(hào)通路[56]。研究證實(shí)原顆粒蛋白(progranulin, PGRN)是miR-34b-5p的功能靶標(biāo)[23]，并在炎癥和細(xì)胞凋亡等病理過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[57-58]。肺泡巨噬細(xì)胞中miR-199a直接靶控SIRT1基因[24]，SIRT1在各種類(lèi)型的細(xì)胞中具有抗炎、抗氧化、抑制DNA損傷和減少細(xì)胞凋亡的作用[59-60]。因此，通過(guò)抑制miR-92a、miR-34b-5p和miR-199a的表達(dá)，減輕ALI中過(guò)度的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，提高ALI小鼠生存率。

5 與間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)miRNAs

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell, MSC)是一種具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肺泡細(xì)胞等多種體細(xì)胞系。MSC調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)并釋放旁分泌因子，以維持屏障功能，促進(jìn)組織修復(fù)并再生新組織，從而緩解ALI，而這種作用主要是由MSC衍生的外泌體包含的miRNAs引起的，而miRNAs在不同組織、不同細(xì)胞類(lèi)型和不同發(fā)育階段表達(dá)量不同，在干細(xì)胞自我更新、增殖、分化、組織發(fā)育等細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮不同的調(diào)控作用。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cell, UCMSC)與A549在低氧條件下共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)缺氧能夠誘導(dǎo)UCMSC分化為ATⅡ細(xì)胞，這對(duì)于ALI的上皮再形成和恢復(fù)至關(guān)重要,主要是由miR-145通過(guò)靶向TGF-β受體Ⅱ(transforming growth factor-β receptorⅡ, TGFβRⅡ)調(diào)控的[30]，TGFβRⅡ結(jié)合后激活了TGF-β信號(hào)。光氣暴露導(dǎo)致ALI后，用超速離心法得到的外泌體中包含的miR-28-5p通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)MSC的增殖及遷移并增加了IL-10的分泌，增強(qiáng)了旁分泌因子如： 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor, HGF)、抗菌肽(cathelicidin LL-37, LL-37)和Ang 1的表達(dá)[25]。使用重物致傷法建立大鼠創(chuàng)傷性ALI模型，然后注入MSC衍生的外泌體，在外泌體中大量表達(dá)miR-124-3p直接靶向嘌呤能受體P2X配體門(mén)控離子通道7(purinergic receptor P2X ligand-gated ion channel 7, P2X7)[26]，而P2X7作為嘌呤能受體，與人類(lèi)炎癥和應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)[61]。P2X7敲減抑制炎癥反應(yīng)而對(duì)ALI起到保護(hù)作用[62]。

6 與內(nèi)皮祖細(xì)胞相關(guān)miRNAs

內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cell, EPC)作為成熟內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在維持內(nèi)皮完整、促進(jìn)血管新生、保護(hù)器官功能中發(fā)揮重要作用。EPC減輕膿毒血癥肺損傷是通過(guò)內(nèi)皮祖細(xì)胞衍生的外泌體(endothelial progenitor cell-exosomes, EPC-Exos)包含miRNAs決定的。

LPS誘導(dǎo)大鼠模型后，用EPC-Exos移植到大鼠體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-126在EPC-Exos中富集，而miR-126又通過(guò)抑制其靶點(diǎn)快速發(fā)育生長(zhǎng)因子同源蛋白1(sprouty-related enabled/vasodilator-stimulated pho-sphoprotein homology 1 domain 1, SPRED1)的表達(dá)，激活了RAF/ERK信號(hào)通路，增強(qiáng)了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)的增殖、遷移和管狀結(jié)構(gòu)形成[27]。研究發(fā)現(xiàn)小氣道上皮細(xì)胞(small airway epithelial cell, SAEC)中miRNA-126-3p可靶向磷酸肌醇-3-激酶調(diào)節(jié)亞基2(phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 2, PIK3R2)，從而抑制高速泳動(dòng)族蛋白B1(high mo-bility group box-1, HMGB1)和通透性因子VEGFα的表達(dá)[28]。在LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(mouse pulmonary microvascular endothelial cell， MPMVEC)和EPC中，增加miR-10a/b-5p的表達(dá)或降低靶蛋白整合素金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase15, ADAM15)的表達(dá)，促進(jìn)MPMVEC增殖而發(fā)揮治療ALI的作用[29]。敲除ADAM15可以降低肺高通透性和緩解ALI，表明ADAM15在ALI中是一種促炎蛋白[63]。抑制了ADAM15的表達(dá)改善了ALI的炎癥反應(yīng)。

7 與COVID-19相關(guān)miRNAs

自2019年12月以來(lái)，新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)引起的新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019, COVID-19)正在全球迅速蔓延。新型冠狀病毒傳染性強(qiáng)，死亡率高，同時(shí)癥狀隱匿，極大威脅人類(lèi)生命健康。SARS-CoV-2在人類(lèi)中的致病性是由于重要生理途徑改變,包括與“細(xì)胞因子風(fēng)暴”和廣泛的肺部病理學(xué)改變相關(guān)。免疫應(yīng)答對(duì)于控制SARS-CoV-2感染至關(guān)重要，但過(guò)度反應(yīng)反而導(dǎo)致細(xì)胞損傷。miRNAs在天然免疫和獲得性免疫中調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的分化、發(fā)育和激活起著關(guān)鍵作用。

多項(xiàng)研究分析了SARS-CoV-2基因組，以確定哪些區(qū)域可以作為病毒編碼的miRNA種子海綿，潛在地與人miRNA種子位點(diǎn)結(jié)合，并阻止其與天然靶標(biāo)相互作用，從而緩解天然miRNA抑制的區(qū)域。Guterres等[64]發(fā)現(xiàn)34個(gè)miRNA為順義病毒RNA，45個(gè)miRNA為反義病毒RNA，它們可以與某些關(guān)鍵的SARS-CoV-2基因緊密結(jié)合。miRNA的破壞和功能異常可能會(huì)擾亂免疫反應(yīng)并刺激炎性細(xì)胞因子的釋放，從而改變細(xì)胞對(duì)病毒感染的反應(yīng)。

8 展 望

目前ALI的有效防治策略仍然是當(dāng)前重點(diǎn)和難點(diǎn)問(wèn)題，而miRNA可通過(guò)影響其靶基因，調(diào)控肺泡上皮細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及巨噬細(xì)胞功能，在ALI或ARDS發(fā)揮重要作用。此外，miRNA可作為生物標(biāo)記志物，在ALI或ARDS不同病程和病情的診斷中作為重要參考指標(biāo)。由于機(jī)體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性，同種或不同種細(xì)胞中，不同的miRNA可能調(diào)控同一個(gè)信號(hào)通路，同時(shí)在一種或多種細(xì)胞中同一個(gè)miRNA可能參與不同信號(hào)通路的調(diào)控，由于ALI或ARDS的病情進(jìn)展迅速、在不同時(shí)間點(diǎn)呈現(xiàn)不同病理生理特點(diǎn)，因此miRNA可能在不同時(shí)間點(diǎn)或不同細(xì)胞中起著完全相反的作用。miRNA與靶基因結(jié)合影響多種信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞凋亡、血管生成和免疫等多種病理生理過(guò)程，此外miRNA在不同細(xì)胞、組織及各種體液中都穩(wěn)定存在，故而特異性升高或降低利于病情發(fā)展的miRNA的表達(dá)可能成為ALI新的治療方法。miRNA現(xiàn)處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，暫時(shí)還沒(méi)有miRNA用于臨床試驗(yàn)，有待進(jìn)一步探索，為臨床應(yīng)用提供堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。