伴放線聚集桿菌感染加重小鼠心肌缺血再灌注損傷*

王冬青 許 晴 任 爽

冠心病及由其引發(fā)的急性心肌梗死是全世界死亡及致殘的主要原因之一[1]。近年來(lái)，我國(guó)冠心病的患病率、發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。冠心病的治療臨床以血運(yùn)重建為主。然而，缺血心肌組織突然恢復(fù)血流供應(yīng)后會(huì)出現(xiàn)心肌的二次損傷，缺血再灌注(ischemia/ reperfusion,I/ R)損傷心肌可占全部梗死心肌面積的50%[2]。研究顯示炎癥反應(yīng)可造成心肌損傷和纖維化，導(dǎo)致心功能進(jìn)行性損害[3]。幾種炎癥狀態(tài)被認(rèn)為會(huì)增加冠狀動(dòng)脈炎癥負(fù)擔(dān)。而牙周炎正是一種常見的慢性炎性疾病，以牙齒周圍組織的附著喪失，牙槽骨吸收為特征，定植在牙周袋內(nèi)的以革蘭氏陰性菌為主的菌斑微生物引發(fā)的一系列炎性免疫反應(yīng)[4]。

越來(lái)越多的研究顯示，牙周炎是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。微生物從發(fā)炎的牙周位點(diǎn)持續(xù)轉(zhuǎn)移到冠狀動(dòng)脈被認(rèn)為會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定，并最終增加急性心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)[5,6]。伴放線聚集桿菌(Aa)是一種革蘭氏陰性、兼性厭氧桿菌，包含內(nèi)毒素、白細(xì)胞毒素等多種致病毒力因子，在牙周炎中起重要作用。我們之前的研究指出Aa 在急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACS)患者的口腔樣本中有發(fā)現(xiàn)，而在慢性冠心病患者中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。同時(shí)，ACS 患者的血清抗Aa 特異性抗體水平高于慢性冠心病患者[7]。赫爾辛基大學(xué)的團(tuán)隊(duì)[8]發(fā)現(xiàn)Aa 陽(yáng)性患者中，與“無(wú)顯著冠心病”患者相比，“穩(wěn)定的冠心病”和“ACS”患者Aa 水平分別增加了6 倍和2.6 倍。同時(shí)“穩(wěn)定的冠心病”和“ACS”Aa 陽(yáng)性患者的唾液Aa 抗體水平也顯著高于“無(wú)顯著冠心病”患者。但是，Aa 對(duì)心肌缺血再灌注后心室重構(gòu)的病理影響并不很清楚。因此，本研究的目的是探討Aa 系統(tǒng)性感染對(duì)實(shí)驗(yàn)性心肌缺血再灌注損傷的影響。

1.材料與方法

1.1 主要儀器及試劑 小動(dòng)物呼吸機(jī)(Minivent 845,Harvard)，氣管插管(一次性靜脈留置針，型號(hào)22G)，自制小動(dòng)物開胸器，超高分辨率小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)(Vevo 770,High Resolution Imaging System，VisualSonicsInc,Canada)。氯化三苯四氮唑(TTC,Sigma)，伊文思藍(lán)(Evans blue，Sigma)，Masson 三色染色試劑盒(Sigma)。胰蛋白胨-大豆-血清-桿菌肽-萬(wàn)古霉素(TSBV)選擇性瓊脂固體和液體培養(yǎng)基(自制)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性C57BL/ 6(野生型)小鼠，6～8 周，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小鼠皮下腔室制備及分組 根據(jù)之前的實(shí)驗(yàn)方法制備皮下腔室[9]。用0.5mm 不銹鋼絲制備線圈，并通過(guò)手術(shù)植入全部小鼠的背部皮下。小鼠隨機(jī)分為2 組：A 組12 只，皮下腔室內(nèi)磷酸鹽緩沖液(PBS)注射；B 組12 只，皮下腔室內(nèi)Aa 注射。本研究獲首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院動(dòng)物倫理審查批準(zhǔn)。

1.3.2 細(xì)菌培養(yǎng)及免疫 Aa ATCC29524 來(lái)自北京口腔醫(yī)學(xué)研究所。Aa 于TSBV 瓊脂固體培養(yǎng)基微需氧培養(yǎng)7 天，選取菌落傳至液體培養(yǎng)基中微需氧培養(yǎng)3 天，液體培養(yǎng)至3代。收集菌液，獲取細(xì)菌濃度在108-9Colony-forming units(CFU)/ ml左右，最終調(diào)整注射濃度為108CFU/ ml。螺旋管埋入2 周后管內(nèi)注射Aa 活菌0.1ml，每周1 次,共4 次。對(duì)照組用PBS 溶液同樣處理。最后1 次注射后行心臟手術(shù)。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)量抗Aa 特異性抗體水平，測(cè)量處死時(shí)及螺旋管埋入前取血。

1.3.3 皮下腔室內(nèi)微生物學(xué)分析 在小鼠背部腔室內(nèi)注入Aa 后，第2 天至第7 天均抽取0.1ml腔室內(nèi)液體，涂于TSBV 培養(yǎng)基微需氧培養(yǎng)，5～7 天后觀察菌落的形成。

1.3.4 心肌缺血再灌注模型制備 小鼠稱重后用3.6%水合氯醛溶液(劑量：0.1ml/ 10g)腹腔注射麻醉，備皮，碘伏消毒。小鼠仰臥，心電圖機(jī)針形電極插于小鼠四肢皮下行心電監(jiān)測(cè)，自制拉鉤撐開口腔，小型嚙齒動(dòng)物呼吸器插管。在胸骨正中剪開皮膚，在小鼠左側(cè)分開肌層，找到2、3 肋，從第三肋的上緣打開胸腔，暴露心臟及左心室表面血管。用8-0 無(wú)損傷絲線活接結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支(left anterior descending coronary artery，LAD)。結(jié)扎前用靜脈留置針后的軟管，裁成1mm的小環(huán)，穿入8-0的無(wú)損傷帶線縫合，至心臟表面。結(jié)扎LAD，心電圖的ST 段明顯抬高，并且肉眼觀察心肌結(jié)扎線到心尖這段范圍有明顯的顏色變白，說(shuō)明心肌已經(jīng)缺血。缺血30min 后軟管被移出LAD 重新開放，再灌注開始后肋骨到皮膚逐層縫合。待小鼠蘇醒四肢有力時(shí)，方可拔出氣管插管。

圖1 心肌缺血再灌注模型制備

1.3.5 心臟超聲心功能評(píng)價(jià) 實(shí)驗(yàn)小鼠仰臥位固定，進(jìn)行二維超聲心動(dòng)圖檢查。應(yīng)用超高分辨率小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)(Vevo 770)，RMV-704 單晶片機(jī)械扇掃探頭，中心頻率30MHz。經(jīng)胸左心室短軸切面獲得二維M 型超聲圖像。測(cè)量左心室舒張末期、收縮末期內(nèi)徑與室壁厚度，計(jì)算左心室縮短分?jǐn)?shù)(fractional shortening，F(xiàn)S)和心臟射血分?jǐn)?shù)(Ejection Fraction，EF)。以此指標(biāo)評(píng)價(jià)各組動(dòng)物左室功能。

1.3.6 心肌梗死面積評(píng)價(jià) TTC-Evans Blue雙染：再灌24h 后，將小鼠麻醉接呼吸機(jī)維持呼吸，開胸后重新結(jié)扎LAD。將帶有Evans-blue 溶液0.1ml的注射器，從左心耳穿入，保證針尖注射孔進(jìn)入左心耳即可。注射伊文思藍(lán)溶液0.1ml。略等2s 后將心臟整體取出，放置-20°冰箱冷凍30min 后切割心臟。一般在結(jié)扎部位向心尖處依次約2mm 切割三片。分離右心室，統(tǒng)一切斷右心室一側(cè)。隨后，放入2%的TTC 溶液染色，保持在37℃15min 觀察缺血心肌的存活和壞死區(qū)。每片心肌組織稱重照相，用Image J 軟件計(jì)算梗死區(qū)(infarct area，IA)、缺 血 危 險(xiǎn) 區(qū)(area at risk，AAR)、遠(yuǎn)端區(qū)及總面積(左心室面積，LV)。參考文獻(xiàn)[10]方法，用IA/ AAR 來(lái)評(píng)價(jià)心肌梗死的面積，用AAR/ LV 評(píng)價(jià)缺血區(qū)面積。每組10 只動(dòng)物的樣本用于統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.7 病理組織學(xué)觀察 再灌注24h 后小鼠處死后快速取出心臟，稱重后10%福爾馬林固定，石蠟包埋，每個(gè)心臟獲取心尖、中段、心底三個(gè)切面行蘇木素-伊紅(HE)和Masson 三色染色壓片，顯微鏡觀察。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0 專業(yè)統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，用Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)評(píng)估數(shù)據(jù)的正態(tài)分布。組間比較用方差分析或t 檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 皮下腔室內(nèi)液體微生物分析 皮下螺旋管注入活菌后無(wú)小鼠死亡，第2～7 天的腔室內(nèi)液體培養(yǎng)后均可以見到菌落的出現(xiàn)，并成下降趨勢(shì)。

2.2 血清抗Aa-IgG 抗體滴度 Aa 感染組I/ R小鼠的血清抗Aa-IgG 抗體水平明顯高于未感染Aa的對(duì)照組I/ R 小鼠(圖2)。

圖2 血清抗Aa-IgG 抗體水平

2.3 心臟超聲影像檢查 圖3A 和3B 是對(duì)照組I/ R 小鼠(I/ R+PBS)和感染組I/ R 小鼠(I/ R+Aa)左心室M 模式下的代表性超聲心動(dòng)圖。如表1所示，Aa 感染的I/ R 小鼠左心室收縮末期內(nèi)徑增大，舒張期末期內(nèi)徑有所減小，但兩組間并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與對(duì)照組的I/ R 小鼠相比，感染組的I/ R 小鼠的EF 和FS 明顯下降，兩組間有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)。

圖3 小鼠胸骨旁左心室短軸切面M 型超聲圖像

表1 感染組和對(duì)照組的左室功能比較()

表1 感染組和對(duì)照組的左室功能比較()

**，P＜0.01，與對(duì)照組相比感染組EF(%)和FS(%)明顯下降。

2.4 心肌梗死面積 Evans blue-TTC 染色后梗死區(qū)呈白色、缺血危險(xiǎn)區(qū)呈紅色和非缺血區(qū)呈藍(lán)色(圖4A)。圖4B 顯示與對(duì)照組(PBS)組相比，感染組(Aa)小鼠冠脈缺血30min，再灌注24h 后梗死面積/ 危險(xiǎn)區(qū)面積明顯增加(P＜0.05)，兩組間危險(xiǎn)區(qū)面積/ 總面積具有可比性。

圖4 小鼠心肌組織TTC 染色

2.5 組織病理學(xué) Aa 感染組小鼠心肌炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖5)和心肌纖維化(圖6)相較于對(duì)照組未感染小鼠更明顯。

圖5 小鼠心肌組織病理圖(HE 染色)

圖6 小鼠心肌組織病理圖(Masson 染色)

3.討論

中國(guó)心血管病患病率處于持續(xù)上升階段，根據(jù)生命損失年估計(jì)，卒中和缺血性心臟病是我國(guó)人群死亡和過(guò)早死亡的主要原因[11]。建立穩(wěn)定有效的小鼠I/ R 模型有助于研究急性心肌梗死和心肌缺血再灌注的損傷和修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)采用常規(guī)呼吸機(jī)支持改進(jìn)的心臟原位結(jié)扎法[12]制作小鼠心肌缺血再灌注模型，準(zhǔn)確性強(qiáng)，操作相對(duì)簡(jiǎn)單，模型較為穩(wěn)定,術(shù)后小鼠的存活率為87.5%(感染組死亡2 只，對(duì)照組1 只)。

牙周炎促進(jìn)全身炎癥[13]與冠心病相關(guān)聯(lián)[14,15]。對(duì)牙周主要致病菌的高血清抗體水平與冠心病有關(guān)[6,14,16]。參照以往經(jīng)驗(yàn)和方法[9]，我們成功建立了皮下螺旋管腔慢性牙周致病菌慢性感染模型。該模型中，管腔內(nèi)細(xì)菌附著于金屬管表面，不斷向外釋放細(xì)菌，引起持續(xù)性感染。本實(shí)驗(yàn)中管腔內(nèi)可持續(xù)監(jiān)測(cè)到Aa 活菌，同時(shí)Aa 感染小鼠血清抗Aa 抗體顯著升高，表明Aa的感染確實(shí)出現(xiàn)在本模型。

以前研究發(fā)現(xiàn)，急性冠脈綜合征患者血清抗Aa 抗體水平升高[7]。本研究發(fā)現(xiàn)Aa 感染小鼠缺血再灌注后，相較于未感染組的小鼠，血清抗Aa-IgG 抗體水平升高的同時(shí)，HE 和Masson 染色顯示炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增加，心肌間質(zhì)纖維化加重。心臟超聲顯示感染組小鼠左心室室壁變薄，短軸縮短率(FS)及射血分?jǐn)?shù)(EF)下降。這些結(jié)果提示Aa 感染加重缺血再灌注后的心肌損傷，牙周炎會(huì)影響心肌缺血再灌注后的心室重塑。

Aa 可促進(jìn)凝血[17]，侵入血管內(nèi)皮細(xì)胞[18]。Aa感染引起血清脂多糖和TLR2/ TLR4 表達(dá)顯著增加[19]，活化炎性細(xì)胞釋放基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMP)9[20]。MMP 是調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)主要成分，不僅能直接降解基質(zhì)，還能調(diào)控心肌梗死后的細(xì)胞因子和趨化因子濃度，參與炎癥反應(yīng)，在心肌組織重構(gòu)中起重要作用[21,22]。在心肌I/ R 損傷動(dòng)物模型[23,24]和臨床患者[25,26]中，均發(fā)現(xiàn)MMP-2 和MMP-9的表達(dá)增加，且隨著損傷時(shí)間的延長(zhǎng)而增加更加明顯。鈴木淳一的團(tuán)隊(duì)[27]通過(guò)皮下螺旋管腔管感染模型發(fā)現(xiàn)Aa 通過(guò)激活MMP-2引起壓力造成的小鼠心肌肥大的惡化。該團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)另一重要牙周致病菌牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)通過(guò)CD11b 陽(yáng)性細(xì)胞、細(xì)胞因子和MMP-9的表達(dá)加重小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性心肌炎[28]。我們之前的研究[9]發(fā)現(xiàn)Pg 通過(guò)上調(diào)S100A9、MMP-9的表達(dá)來(lái)促進(jìn)小鼠實(shí)驗(yàn)性腹主動(dòng)脈瘤的形成和發(fā)展。綜上所述，伴放線聚集桿菌感染加重小鼠實(shí)驗(yàn)性心肌缺血再灌注損傷，MMPs 可能是其中的關(guān)鍵因素，但還需要進(jìn)一步探討。