基于Ki-67增殖指數(shù)判定的數(shù)字化分析在胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤分級中的應(yīng)用

涂 軼，曹 毅，徐 姍，鄭紫純，周志斌，梅金紅

神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(neuroendocrine neoplasm, NEN)是一組起源于肽能神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的異質(zhì)性腫瘤[1]。胃腸胰分布多種神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞，是NEN最常發(fā)生的部位，約占所有NEN的75%，目前已成為消化道常見的惡性腫瘤[2]。NEN增殖活性的級別判定主要采用核分裂象和(或)Ki-67增殖指數(shù)兩項指標(biāo)，在國內(nèi)，大多采用Ki-67增殖指數(shù)對NEN進(jìn)行分級，準(zhǔn)確的腫瘤分級對于指導(dǎo)NEN患者的治療及預(yù)后評估具有重要作用。人工精確計數(shù)法對Ki-67增殖指數(shù)判讀較為準(zhǔn)確，但其需計數(shù)500～2 000個細(xì)胞，耗時長，診斷效率低。因此，目前對于Ki-67增殖指數(shù)評估仍以病理醫(yī)師目測估計顯微鏡下的組織切片為主，該方法簡單、方便，但具有較強主觀性，結(jié)果可重復(fù)性差，造成Ki-67增殖指數(shù)判讀不準(zhǔn)確[1]。騰訊精準(zhǔn)醫(yī)療開放平臺通過一體化全自動掃描平臺，將傳統(tǒng)的玻璃切片進(jìn)行掃描，生成包括傳統(tǒng)玻璃切片內(nèi)的所有信息的數(shù)字化切片，通過軟件對切片信息進(jìn)行分析，進(jìn)行Ki-67增殖指數(shù)的判讀，具有高效、結(jié)果可重復(fù)等優(yōu)點。本實驗擬驗證基于Ki-67增殖指數(shù)判定的數(shù)字化NEN分析的精確性，及與人工精確算法的一致性，探討采用數(shù)字化手段對Ki-67增殖指數(shù)判定的可行性，以解決當(dāng)前Ki-67人工目測評估進(jìn)行腫瘤分級所存在的結(jié)果可重復(fù)性差、耗時、主觀性強等問題。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源選取2016年1月～2020年11月南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科確診的349例胃腸胰NEN的Ki-67免疫組化病理切片，包括分級在G1、G2、G3的各級胃腸胰NEN。其中G1期278例，G2期20例，G3期51例。腫瘤位于直腸232例，胃67例，胰腺31例，乙狀結(jié)腸8例，右半結(jié)腸7例，十二指腸3例，回盲部1例。

導(dǎo)入各病例原病理報告Ki-67增殖指數(shù)判斷結(jié)果作為病理醫(yī)師目測評估腫瘤細(xì)胞Ki-67增殖指數(shù)。

1.2 數(shù)據(jù)處理及分析使用尼康顯微鏡進(jìn)行NEN Ki-67免疫組化切片觀察。每張切片先在低倍鏡(40×)下確認(rèn)陽性率最高的區(qū)域，再調(diào)整為中倍鏡(200×)精確定位Ki-67陽性率最高的區(qū)域，運用數(shù)字化切片掃描儀(Motic EasyScanner)記錄數(shù)字化切片圖像。為保證足夠的細(xì)胞數(shù)目，對于神經(jīng)內(nèi)分泌組織細(xì)胞比較多且存在明顯Ki-67熱點的切片，選取2～3幅包含陽性率最高區(qū)域的圖片；對于NEN細(xì)胞比較少或無明顯Ki-67熱點的切片，則選取包含切片中全部腫瘤組織的圖片，確保每例至少500個腫瘤細(xì)胞進(jìn)行評估。運用Photoshop CS5進(jìn)行圖像處理，主要對圖片中非腫瘤區(qū)域(如間質(zhì)及正常胃腸黏膜組織)進(jìn)行切割，調(diào)節(jié)圖片的亮度以滿足騰訊精準(zhǔn)醫(yī)療開放平臺軟件對于圖像的要求，去除圖片中較明顯的非細(xì)胞污點(如切片久置被污染所致的污點等)。通過騰訊精準(zhǔn)醫(yī)療開放平臺軟件數(shù)字化分析(簡稱數(shù)字化分析)進(jìn)行Ki-67增殖指數(shù)分析，每例均上傳其對應(yīng)的圖片及背景色圖片，然后保存分析結(jié)果圖片(圖1、2)。

圖1 Ki-67增殖指數(shù)，人工精準(zhǔn)計數(shù)結(jié)果分別為：<1%(A)、5%(B)、30%(C)；病理醫(yī)師目測Ki-67增殖指數(shù)結(jié)果分別為3%、4%、35% 圖2 騰訊精準(zhǔn)醫(yī)療開放平臺軟件數(shù)字化分析Ki-67增殖指數(shù)結(jié)果，分別為<1%(A)、5%(B)、31%(C)

對每個NEN病例的Ki-67免疫組化圖片進(jìn)行人工計數(shù)精確評估Ki-67增殖指數(shù)。選取Ki-67陽性率最高的圖片進(jìn)行人工計數(shù)，分別數(shù)出Ki-67陽性核(褐色著色)的個數(shù)和陰性核(藍(lán)色著色)的個數(shù)。如果1幅圖片的總細(xì)胞數(shù)目小于500，則選取余下幾張圖片里Ki-67陽性率最高的圖片繼續(xù)進(jìn)行人工計數(shù)，直至累計總細(xì)胞數(shù)目超過500。計算Ki-67陽性核腫瘤細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比并記錄。

用Excel軟件繪制人工精確計數(shù)與數(shù)字化分析結(jié)果的散點圖。再運用Excel軟件散點圖中“添加趨勢線”，選擇“線性”對圖像進(jìn)行線性擬合，并顯示公式。運用SPSS 20.0軟件對兩種計數(shù)結(jié)果進(jìn)行配對t檢驗。運用Graphpad 8.0軟件分別對G1、G2及G3期的數(shù)字化分析與人工精確計數(shù)，病理醫(yī)師目測與人工精確計數(shù)進(jìn)行Bland-Altman一致性檢驗分析。

2 結(jié)果

從分析時間上看，數(shù)字化分析出結(jié)果的時間是3～5 s，不同組織大小掃描時間不一，500個腫瘤細(xì)胞掃描時間約在1 min以內(nèi)，截圖及上傳圖片時間約10 s；人工精確計數(shù)的時間是3～5 min；醫(yī)師目測法判定Ki-67增殖指數(shù)結(jié)果約10 s。

在時效上數(shù)字化分析效率優(yōu)于人工精確計數(shù)。

數(shù)字化分析結(jié)果與人工精確計數(shù)的比較結(jié)果顯示兩者具有較好的相關(guān)性，其線性相關(guān)系數(shù)為0.985，且SPSS軟件t檢驗結(jié)果顯示兩者Pearson相關(guān)系數(shù)為0.997，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.000 1)。

數(shù)字化分析與人工精確計數(shù)相比，G1期278例配對數(shù)據(jù)差值的均數(shù)d=-0.028 8，差值的標(biāo)準(zhǔn)=0.267 6，95%一致性界限為[-0.553 4，0.495 7]。G2期20例配對數(shù)據(jù)差值的均數(shù)d=-0.400 0，差值的標(biāo)準(zhǔn)=1.231，95%一致性界限為[-2.813，2.013]。G3期51例配對數(shù)據(jù)差值的均數(shù)d=0.902 0，差值的標(biāo)準(zhǔn)=5.155，95%一致性界限為[-9.201，11.01]。

病理醫(yī)師目測與人工精確計數(shù)相比，G1期278例配對數(shù)據(jù)差值的均數(shù)d=0.083 0，差值的標(biāo)準(zhǔn)=0.356 6，95%一致性界限為[-0.615 8，0.781 9]。G2期20例配對數(shù)據(jù)差值的均數(shù)d=1.850，差值的標(biāo)準(zhǔn)=0.933 3，95%一致性界限為[0.020 7，3.679]。G3期51例配對數(shù)據(jù)差值的均數(shù)d=-4.020，差值的標(biāo)準(zhǔn)=10.03，95%一致性界限為[-23.68，15.64]。

數(shù)字化分析與病理醫(yī)師目測法相比，G1期278例配對數(shù)據(jù)差值的均數(shù)d=0.111 9，差值的標(biāo)準(zhǔn)=0.479 8，95%一致性界限為[-0.828 4，1.052]。G2期20例配對數(shù)據(jù)差值的均數(shù)d=2.250，差值的標(biāo)準(zhǔn)=1.293，95%一致性界限為[-0.283 7，4.784]。G3期51例配對數(shù)據(jù)差值的均數(shù)d=-4.902，差值的標(biāo)準(zhǔn)=10.75，95%一致性界限為[-25.97，16.17]。

由此可見，數(shù)字化分析與人工精確計數(shù)在G1、G2及G3期均具有較好的一致性，其中G1期的一致性高于G2期，G2期的一致性高于G3期。且數(shù)字化分析與人工精確計數(shù)的一致性均高于病理醫(yī)師目測與人工精確計數(shù)以及數(shù)字化分析與病理醫(yī)師目測的一致性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

NEN是一類起源于肽能神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的異質(zhì)性腫瘤，可發(fā)生于全身多器官和組織，包括胃腸道、胰腺、膽道、肝臟、肺支氣管、甲狀腺及甲狀旁腺等部位。NEN的早期診斷率低，確診時往往出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，病死率居高不下，近年來受到越來越廣泛的重視。此前較長一段時間內(nèi)，對NEN的命名、分類、診斷及治療均缺乏統(tǒng)一和規(guī)范，仍存在諸多尚待解決的問題[3]。

WHO(2010)消化系統(tǒng)腫瘤分類對NEN命名、分類和分級進(jìn)行了修訂，將NEN分為高分化的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(neuroendocrine tumor, NET)G1期(Ki-67增殖指數(shù)<3%)、G2期(Ki-67增殖指數(shù)為3%～20%)和分化差的神經(jīng)內(nèi)分泌癌(neuroendocrine carcinoma, NEC)G3期(Ki-67增殖指數(shù)>20%)三部分，認(rèn)為高分級G3即為分化差的NEN[4]。WHO(2017)消化系統(tǒng)腫瘤分類進(jìn)一步將NEN G3分級細(xì)化為高增殖活性的NET G3及NEC G3。高增殖活性NET G3 Ki-67增殖指數(shù)通常為20%～50%，NEC G3期Ki-67增殖指數(shù)>50%[5]。指南明確指出完整的病理報告中需要包括確切的Ki-67增殖指數(shù)[6]，這對指導(dǎo)NEN患者的治療及預(yù)后評估具有重要意義。

目前對Ki-67增殖指數(shù)的判讀主要人工判讀為主，傳統(tǒng)的人工判讀Ki-67增殖指數(shù)存在以下缺點：(1)精確性低，病理醫(yī)師通過肉眼在顯微鏡下短時間內(nèi)判讀一張病理切片，準(zhǔn)確性不高；(2)主觀性強，選取的視野不同，對陽性信號的判讀不同，均可導(dǎo)致判讀結(jié)果有差異；(3)重復(fù)性差，不同病理醫(yī)師之間、同一病理醫(yī)師不同時期的閱片均存在明顯差異[7-8]。此外，新版診治標(biāo)準(zhǔn)中強調(diào)了組織標(biāo)本量對分級判斷可靠性的影響，腫瘤細(xì)胞數(shù)量不足，分級可能會被低估，從而難以得到準(zhǔn)確的評估分級結(jié)果。病理醫(yī)師目測估計計數(shù)存在上述的諸多問題，可能導(dǎo)致Ki-67增殖指數(shù)判定誤差，從而影響NEN的分級及術(shù)后治療、預(yù)后判斷。相比傳統(tǒng)的人工判讀，數(shù)字化分析在以下幾方面具有優(yōu)勢：(1)與病理醫(yī)師目測估計計數(shù)相比，采用數(shù)字化分析方法，對Ki-67增殖指數(shù)進(jìn)行判讀，準(zhǔn)確率高，因此Ki-67增殖指數(shù)的判讀結(jié)果更可靠；(2)省時省力，在完成切片掃描后，對于選定的視野只需數(shù)秒就可完成閱片過程；(3)客觀性好，判斷標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一，在判斷陽性標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定后，所有切片均會按相同條件進(jìn)行判讀，計算陽性率；(4)重復(fù)性好，可以進(jìn)行多視野計數(shù)，雖然本實驗僅選取2～3個視野進(jìn)行計數(shù)，但在實際工作中，機器判讀可以選取任意更多的有代表性的區(qū)域，甚至可以進(jìn)行整片計數(shù)，最大限度的保證了閱片結(jié)果的穩(wěn)定性。機器判讀更注重細(xì)節(jié)且更易進(jìn)行質(zhì)控[9]。

本組共納入349例確診為胃腸胰NEN并進(jìn)行Ki-67免疫組化的病理切片，通過Pearson相關(guān)系數(shù)檢測數(shù)字化分析與人工精確計數(shù)對診斷Ki-67的相關(guān)性，結(jié)果顯示數(shù)字化分析與人工精確計數(shù)具有良好相關(guān)性。其次，通過Bland-Altman一致性檢驗分析數(shù)字化分析與人工計數(shù)對G1、G2及G3期的Ki-67增殖指數(shù)精確度比較，結(jié)果顯示數(shù)字化分析與人工精確計數(shù)在G1、G2及G3期均具有較好的一致性，其中G1期的一致性高于G2期，G2期的一致性高于G3期，且G1、G2、G3期數(shù)字化分析與人工精確計數(shù)的一致性均高于病理醫(yī)師目測與人工精確計數(shù)以及數(shù)字化分析與病理醫(yī)師目測的一致性。因此，通過上述結(jié)果，可以初步得出，數(shù)字化分析Ki-67增殖指數(shù)并協(xié)助診斷NEN具有很好的臨床應(yīng)用價值，其準(zhǔn)確性優(yōu)于人工精確計數(shù)。因本實驗是單中心、小樣本的回顧性分析，則需要更大樣本量、多中心、前瞻性研究進(jìn)一步證明通過機器數(shù)字化分析Ki-67增殖指數(shù)對確診和分級NEN的價值，從而為病理科醫(yī)師診斷NEN提供更加準(zhǔn)確、快速的檢測方法和循證學(xué)依據(jù)。

綜上所述，本實驗初步認(rèn)為數(shù)字化分析進(jìn)行NEN的Ki-67增殖指數(shù)判斷，相比病理醫(yī)師目測估計，能夠更好地保證有效的腫瘤細(xì)胞數(shù)，數(shù)字化判定結(jié)果較病理醫(yī)師目測估計更為精確，與金標(biāo)準(zhǔn)人工精確計數(shù)相比具有很好的一致性。數(shù)字化分析可能成為精確評估Ki-67增殖指數(shù)的新方法，從而進(jìn)行腫瘤惡性程度的準(zhǔn)確分級，解決當(dāng)前Ki-67增殖指數(shù)人工目測評估精確性差、費時、主觀性強、可重復(fù)性差的問題，并有望在診斷其他惡性實體腫瘤的免疫組化指標(biāo)判定上進(jìn)行推廣。