石蠟包埋中骨髓標(biāo)準(zhǔn)化脫鈣的應(yīng)用

沈吟芳，王 謙，郭凌川

骨髓活檢是用一支特制的穿刺針在患者髂前上棘或髂后上棘處取出1.0～2.0 cm長、直徑0.1～0.2 cm的圓柱形骨髓。骨髓富含鈣鹽、一定量的脂肪及少許纖維支架，具有組織小而硬、脆、松的特點(diǎn)，必須經(jīng)過脫鈣后才能進(jìn)行石蠟包埋，制成骨髓切片。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過長期實(shí)踐，總結(jié)出一套骨髓標(biāo)準(zhǔn)化脫鈣處理方法，操作安全簡便，不僅制成了高質(zhì)量的石蠟切片，而且在HE染色、網(wǎng)狀纖維染色及免疫組化標(biāo)記中，均取得了滿意的效果，現(xiàn)將方法介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集2017年6月～2020年2月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科送至病理科的骨髓活檢標(biāo)本1 775例。

1.2 試劑固定液：35%～40%甲醛100 mL，無水磷酸氫二鈉6.5 g，磷酸二氫鈉4.0 g，蒸餾水900 mL；復(fù)合脫鈣液：甲酸120 mL，36%～38%鹽酸80 mL，蒸餾水800 mL。

1.3 方法(1)從患者體內(nèi)穿刺出骨髓后立即放入固定液中密閉固定，固定液的用量是骨髓體積的5～10倍，送至病理科后固定12～24 h；(2)12～24 h后開始取材，骨髓組織迅速脫鈣，在裝滿脫鈣液的棕色玻璃瓶內(nèi)，室溫(20 ℃左右)避光密封脫鈣1～3 h，脫鈣液的用量是骨髓組織體積的30倍，完全脫鈣的骨髓組織放入固定液中繼續(xù)固定1～3 h，與其它常規(guī)標(biāo)本一起進(jìn)入全自動脫水機(jī)內(nèi)，按工作日程序進(jìn)行脫水、透明、浸蠟；(3)第3天開始石蠟包埋、切片、HE染色(切片厚2 μm[1])，鏡下閱片，初步診斷；(4)第4天，根據(jù)初步診斷的需求，繼續(xù)骨髓石蠟切片，切出3 μm厚[2]的切片，進(jìn)行Gomori網(wǎng)狀纖維染色；切出2 μm厚[1]的切片，操作步驟嚴(yán)格按免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行，DAB顯色。

2 結(jié)果

骨髓石蠟切片完整無刀痕、光滑平整，厚薄均勻一致。HE染色顯示骨髓形態(tài)結(jié)構(gòu)全面，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)紅藍(lán)適度，對比度好(圖1)；網(wǎng)狀纖維染色中粗細(xì)網(wǎng)狀纖維清晰，背景干凈(圖2)；免疫組化染色顯示核抗原、漿抗原和膜抗原均表達(dá)良好，陽性信號定位準(zhǔn)確清楚(圖3)。

3 討論

骨髓通過標(biāo)椎化脫鈣，保存了完整的細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)，保留了細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核抗原，進(jìn)行HE染色及免疫組化標(biāo)記等檢測結(jié)果均可靠準(zhǔn)確，為白血病、漿細(xì)胞瘤等血液疾病診斷和鑒別診斷提供技術(shù)上的支持，并且可以判斷轉(zhuǎn)移癌、淋巴瘤等的骨髓浸潤情況從而引導(dǎo)臨床為患者進(jìn)行有效地精準(zhǔn)治療。標(biāo)準(zhǔn)化脫鈣處理中固定液及脫鈣液的選擇、用量的多少、時間的長短及終止脫鈣后的處理等均是關(guān)鍵因素：(1)骨髓取材前，必須及時充分固定并在密閉容器內(nèi)進(jìn)行，防止固定液揮發(fā)對人體造成刺激。骨髓固定與脫鈣不能同步進(jìn)行[3]，因?yàn)樵跊]有正確固定之前，脫鈣液就開始破壞組織結(jié)構(gòu)，引起蛋白質(zhì)缺失，直接影響病理診斷的正確性。固定液選用10%中性緩沖福爾馬林，固定均勻，滲透力強(qiáng)，甲醛與蛋白質(zhì)的氨基結(jié)合，凝固蛋白質(zhì)，保持免疫活性。骨髓組織立即放入固定液中固定；固定液的用量是骨髓體積的5～10倍[4]；固定時間要充分，確保固定12～24 h。只有在取材前骨髓組織給予正確固定，才能保持組織結(jié)構(gòu)完整，保存蛋白質(zhì)抗原。(2)骨髓組織脫鈣應(yīng)在室溫下1～3 h內(nèi)完成充分脫鈣，短時間內(nèi)低濃度的酸處理，對細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核染色影響小[5]。脫鈣液未選用優(yōu)良的脫鈣液乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)，因其價(jià)格昂貴，脫鈣溫和但作用緩慢；也未選擇最常用的脫鈣劑硝酸[6]，硝酸對骨髓結(jié)構(gòu)破壞較大。10%硝酸脫鈣速度快，但會造成蛋白質(zhì)抗原的缺失，特別是對核陽性的抗原降解最明顯，造成假陰性[7]。本實(shí)驗(yàn)選用的是復(fù)合脫鈣液，其中甲酸作用較慢，使骨髓組織膨脹、脂質(zhì)溶解、促進(jìn)鹽酸均勻滲入到骨髓組織內(nèi)，快速溶解堅(jiān)硬的鈣鹽。每天脫鈣前必須更換新鮮的復(fù)合脫鈣液，脫鈣液的用量應(yīng)是骨髓體積的30倍[8]，在密閉容器內(nèi)進(jìn)行脫鈣，以減少脫鈣液的揮發(fā)。當(dāng)骨髓組織密度相同，長度不同時，一般1.0 cm長的骨髓組織脫鈣時間約1 h，1.5 cm長的骨髓組織脫鈣時間為1.5 h，2.0 cm長的骨髓組織脫鈣時間為2.0 h，目前為止，最硬最長的骨髓組織在室溫下約3 h便可徹底脫鈣。脫鈣時間太短，骨髓切片時有刀痕，易損壞刀片；脫鈣時間過長，易脫片，HE染色顯示不佳，免疫組化染色出現(xiàn)假陰性。判斷脫鈣是否成功，可用手捏骨髓組織，無硬感；用手指掐，骨髓組織能彎曲、富有彈性為脫鈣成功。復(fù)合脫鈣液在室溫短時間內(nèi)的脫鈣處理，最大限度的保留組織抗原[9]，對抗原無影響。(3)脫鈣成功的骨髓組織，應(yīng)繼續(xù)放入固定液中再固定1～3 h。脫鈣1 h的骨髓組織，繼續(xù)固定約1 h；2 h脫鈣的骨髓繼續(xù)固定約2 h。充分脫鈣后的骨髓再固定，稀釋中和組織內(nèi)的各種酸性液體，消除各種酸性液體的破壞作用，同時繼續(xù)保證組織結(jié)構(gòu)的完整性及抗原物質(zhì)的有效性。本實(shí)驗(yàn)在常規(guī)取材工作中，骨髓在室溫下3 h內(nèi)完成脫鈣，脫鈣后再固定3 h的期間內(nèi)，其它常規(guī)標(biāo)本正在有序取材，待取材結(jié)束，骨髓標(biāo)準(zhǔn)化脫鈣處理也恰好完成，體現(xiàn)出高效率的工作流程。在進(jìn)行骨髓標(biāo)準(zhǔn)化脫鈣中，同時做好自身的防護(hù)和周圍環(huán)境的保護(hù)。本實(shí)驗(yàn)在我科負(fù)二樓污染區(qū)的取材室內(nèi)完成取材、脫鈣、脫水等一系列組織處理；在三樓半污染區(qū)的切片室內(nèi)完成石蠟包埋、切片、染色出片。近年文獻(xiàn)[5]報(bào)道表面脫鈣法逐步應(yīng)用于骨髓制片中，脫鈣時間短，效果好。表面脫鈣法即“包埋后脫鈣”[9]，固定不脫鈣的骨髓組織先石蠟包埋，在蠟塊粗修暴露出組織最大面后，再把蠟塊浸泡在脫鈣液中脫鈣，脫鈣完成后及時切片。后脫鈣法在切片室進(jìn)行脫鈣處理，更應(yīng)謹(jǐn)慎操作，避免酸性脫鈣液的揮發(fā)，造成人體傷害及腐蝕儀器等意外事件發(fā)生。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過骨髓標(biāo)準(zhǔn)化脫鈣處理，高效地制成高質(zhì)量的石蠟切片，有利于病理組織學(xué)圖像的觀察及抗原表達(dá)的分析，更有助于做出精準(zhǔn)的診斷、預(yù)后判斷及治療方案。目前，骨髓標(biāo)準(zhǔn)化脫鈣處理獲得江蘇省血液研究所專家們的認(rèn)可，已在血液研究所骨髓病理檢查室的日常工作中推廣運(yùn)用。如今國內(nèi)已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，運(yùn)用進(jìn)口酸類脫鈣劑RapidCal[7]，能較好保存蛋白質(zhì)和DNA；國外也有文獻(xiàn)[10]報(bào)道，使用EDTA脫鈣劑亦獲得良好的抗原及理想的DNA含量，本實(shí)驗(yàn)亦從骨髓內(nèi)取得了達(dá)到分子檢測要求的核酸含量及質(zhì)量，但例數(shù)不足，隨著分子檢測的實(shí)例不斷增多，本實(shí)驗(yàn)后期會不斷完善骨髓標(biāo)準(zhǔn)化脫鈣，最終會達(dá)到甚至超越進(jìn)口脫鈣液及EDTA脫鈣的優(yōu)勢，從組織內(nèi)提取出優(yōu)質(zhì)且量多的染色質(zhì)，進(jìn)行分子檢測。