RNA干擾CD151基因?qū)ψ訉m頸癌細(xì)胞增殖和遷移的影響

曹錦濤，陳劉成，李 然，閔 銳，唐明洋，范星宇，李 楠

子宮頸癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，全球每年有53萬(wàn)新發(fā)病例和31萬(wàn)死亡病例，絕大多數(shù)子宮頸癌是由于人乳頭瘤病毒(human papilloma virus, HPV)感染引起[1-2]。近年來(lái)，隨著子宮頸細(xì)胞學(xué)篩查(巴式涂片)和接種HPV疫苗等預(yù)防措施的開展，其發(fā)病率已顯著降低[3]。但對(duì)于晚期轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性患者，臨床上尚缺乏有效的治療方法[4]。CD151(cluster of differentiation 151)是四跨膜蛋白家族(transmember four super family, TMASF)的重要成員，影響細(xì)胞的黏附、遷移與增殖，可在腫瘤血管形成中發(fā)揮重要作用，與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展呈正相關(guān)[5-6]。王麗等[7]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CD151蛋白表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖反應(yīng)有較強(qiáng)的相關(guān)性，下調(diào)細(xì)胞中CD151蛋白表達(dá)，可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，但CD151基因在子宮頸癌組織中作用的相關(guān)機(jī)制目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化EnVision法檢測(cè)了CD151蛋白在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌及慢性子宮頸炎組織中的表達(dá)情況，并采用RNA干擾(RNAi)技術(shù)沉默子宮頸癌細(xì)胞中CD151基因表達(dá)，通過(guò)檢測(cè)其增殖、遷移、侵襲能力的改變進(jìn)一步探究CD151基因在子宮頸癌中的作用，為CD151基因作為治療子宮頸癌潛在靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系和試劑將子宮頸腺癌細(xì)胞株Hela(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)，培養(yǎng)于37 ℃ 5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。CCK-8試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、Transwell小室、4%多聚甲醛、瑞氏-吉姆薩染料(上海碧云天公司)，Matrigel基質(zhì)膠(美國(guó)BD公司)。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 收集2016～2019年蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理科存檔的子宮頸癌標(biāo)本58例，慢性子宮頸炎標(biāo)本34例。采用免疫組化EnVision法檢測(cè)CD151蛋白表達(dá)。組織切片常規(guī)脫蠟脫水，使用3%H2O2甲醇滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，依次滴加一抗、二抗和三抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封固，鏡下觀察。陽(yáng)性結(jié)果判定以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。

1.2.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 從Genebank中檢索人CD151全長(zhǎng)cDNA序列，設(shè)計(jì)siRNA-CD151序列，用以上確認(rèn)的siRNA-CD151干擾序列為基礎(chǔ)，合成shRNA-CD151。用脂質(zhì)體Lipofectamine介導(dǎo)重組質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的子宮頸癌細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)分3組，即Psciencer2.0-shRNA-CD151質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染Psciencer2.0-shRNA-CD151的子宮頸癌細(xì)胞，簡(jiǎn)稱CD151 siRNA組)、空載體組(轉(zhuǎn)染Psciencer2.0-shRNA空載體的子宮頸癌細(xì)胞)及空白對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的子宮頸癌細(xì)胞)。

1.2.3Western blot法檢測(cè)CD151的表達(dá) 取上述3組細(xì)胞2×105個(gè)/孔細(xì)胞接種在6孔板中，待生長(zhǎng)至密度達(dá)到80%后，將細(xì)胞用冷PBS洗滌2次，加入100 μL的RIPA細(xì)胞裂解液，用細(xì)胞刮刮下。采用BCA法定量蛋白，將含有蛋白的細(xì)胞裂解液按4 ∶1比例與5XSDS上樣緩沖液混合，100 ℃煮沸10 min，然后進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育過(guò)夜。將膜用TBST洗滌3次，每次10 min，在室溫下與合適的HRP標(biāo)記的二抗孵育1 h。通過(guò)增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)蛋白條帶。

1.2.4細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取上述3組細(xì)胞，將細(xì)胞以每孔5×103個(gè)均勻接種于96孔板中，并設(shè)置調(diào)零組(只含有細(xì)胞培養(yǎng)基不含有細(xì)胞)，培養(yǎng)于37 ℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后,每孔加入10 μL的CCK-8，再孵育2 h后用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處的吸光度。細(xì)胞活力計(jì)算公式：細(xì)胞活力=(實(shí)驗(yàn)組-調(diào)零組)/(空白對(duì)照組-調(diào)零對(duì)照組)×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 用不含有EDTA的胰酶消化細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，收集2×105個(gè)細(xì)胞，PBS洗2次，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶染料室溫避光孵育30 min，用100 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至流式管流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 每組離心收集2×105個(gè)細(xì)胞，PBS洗2次，將細(xì)胞加入提前預(yù)冷的75%乙醇，4 ℃固定24 h。1 000g離心5 min收集細(xì)胞，用PBS洗細(xì)胞1次，每組加入配置好的碘化丙啶染液0.535 mL(含有0.5 mL染色緩沖液、25 μL的20×PI染色液、10 μL的50×RNase A)，于37 ℃避光孵育30 min，轉(zhuǎn)移至流式管流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.7細(xì)胞遷移、侵襲實(shí)驗(yàn) 先使用無(wú)血清培養(yǎng)基將細(xì)胞饑餓化處理24 h后再行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。使用胰酶消化細(xì)胞后，用不含有胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升1×105個(gè)，每組取200 μL細(xì)胞懸液加入Transwell小室Matrigel基質(zhì)膠表面，24孔板下室每孔內(nèi)加入含0.1%BSA的RPMI-1640培養(yǎng)基600 μL。在37 ℃ 5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后，使用棉試紙擦去濾膜表面的細(xì)胞，再用4%多聚甲醛固定20 min，并用吉姆薩染色5 min。于400倍鏡下計(jì)數(shù)穿過(guò)濾膜的細(xì)胞數(shù)，每膜隨機(jī)計(jì)數(shù)上、下、左、右、中5個(gè)不同視野，每組設(shè)3個(gè)平行濾膜。遷移實(shí)驗(yàn)不需要鋪Matrigel基底膠。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 子宮頸癌和子宮頸慢性炎組織中CD151蛋白的表達(dá)子宮頸癌組織中CD151蛋白陽(yáng)性，定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒樣；子宮頸慢性炎組織中CD151蛋白陰性(圖1)。

圖1 A.子宮頸鱗狀細(xì)胞癌HE染色，癌細(xì)胞呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)；B.子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中CD151陽(yáng)性，EnVision法；C.子宮頸慢性炎上皮組織HE染色，鱗狀上皮層次清晰，結(jié)構(gòu)完整；D.子宮頸慢性炎上皮組織中CD151陰性，EnVision法

2.2 Western blot法檢測(cè)各組中CD151蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CD151 siRNA組的CD151蛋白表達(dá)水平顯著低于空載體組及空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。空載體組及空白對(duì)照組的CD151表達(dá)量約為CD151 siRNA組的9倍(圖2)。上述結(jié)果表明，CD151 siRNA組的CD151表達(dá)水平顯著下降。

圖2 Western blot法檢測(cè)各組中CD151蛋白表達(dá)水平：A.電泳圖；B.直方圖；與空載體組及空白對(duì)照組相比，*P<0.05

2.3 沉默CD151基因表達(dá)對(duì)子宮頸癌細(xì)胞增殖能力的影響CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)CD151在體外對(duì)子宮頸癌細(xì)胞增殖的作用，結(jié)果表明，CD151 siRNA組細(xì)胞在450 nm處的OD值明顯低于空載體組及空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3)。此外CD151 siRNA組的細(xì)胞活力明顯低于空載體組及空白對(duì)照組(圖4)，由此確定通過(guò)RNAi介導(dǎo)的CD151基因沉默可顯著抑制子宮頸癌細(xì)胞系的增殖與活力。

圖3 CCK-8法檢測(cè)CD151對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響與空載體組及空白對(duì)照組相比，*P<0.05

圖4 CD151對(duì)細(xì)胞活力的影響與空載體組及空白對(duì)照組相比，*P<0.05

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD151對(duì)細(xì)胞凋亡與周期的影響細(xì)胞凋亡流式圖顯示，在細(xì)胞周期早期，CD151 siRNA組細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯高于空載體組及空白對(duì)照組(圖5)，表明CD151低表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞早期凋亡；流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，CD151 siRNA組G1期細(xì)胞數(shù)量高于空載體組及空白對(duì)照組，CD151 siRNA組的S期細(xì)胞數(shù)量則明顯低于空載體組及空白對(duì)照組(圖6)，提示CD151表達(dá)水平降低可使細(xì)胞發(fā)生G1/S抑制；柱狀圖顯示CD151 siRNA組G1期細(xì)胞數(shù)量明顯高于空載體組及空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖7)，進(jìn)一步證實(shí)CD151低表達(dá)可將細(xì)胞周期阻滯在G1期。

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

圖6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

圖7 CD151表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期的影響與空載體組及空白對(duì)照組相比，*P<0.05

2.5 沉默CD151基因表達(dá)對(duì)子宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響Transwell法檢測(cè)不同分組中癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，結(jié)果顯示，CD151 siRNA組細(xì)胞穿過(guò)濾膜的細(xì)胞數(shù)明顯低于空載體組和空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖8、9)，空載體組和空白對(duì)照組之間穿膜細(xì)胞數(shù)差異無(wú)顯著性。表明CD151表達(dá)缺失可顯著降低癌細(xì)胞的遷移及侵襲能力。

圖8 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移能力與空載體組和空白對(duì)照組相比，*P<0.05

3 討論

子宮頸癌位居全球女性癌癥發(fā)病率和病死率的第4位，基因治療作為治療子宮頸癌的新方法而倍受關(guān)注[8]。鑒于CD151在子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，在慢性子宮頸炎組織中呈陰性，推斷CD151基因的激活可能是子宮頸癌癌變過(guò)程中的重要因素，而CD151過(guò)表達(dá)可能會(huì)促進(jìn)子宮頸細(xì)胞的增殖及惡性轉(zhuǎn)化。

CD151是最早發(fā)現(xiàn)的與腫瘤轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)的四跨膜蛋白，是整合素依賴性細(xì)胞運(yùn)動(dòng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中必不可少的分子連接物，整合素定位的變化被認(rèn)為是癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移的決定因素[9-10]。整合素受體(即α6β1、α3β1和α6β4)與CD151結(jié)合可形成牢固且極其穩(wěn)定的CD151-整合素復(fù)合體，后者可能通過(guò)調(diào)節(jié)FAK、ERK、Akt、Wnt等信號(hào)分子的活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，破壞該復(fù)合體的形成可有效減弱腫瘤的惡性生物學(xué)作用[11-13]。FAK是一種非受體酪氨酸激酶，其磷酸化后，可將上游信號(hào)整合并傳遞，參與調(diào)控細(xì)胞骨架重組、收縮、黏著斑解聚與形成，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，是腫瘤細(xì)胞侵襲的關(guān)鍵[14]。楊秀婷等[15]在肺腺癌的研究中亦證實(shí)了該結(jié)果，認(rèn)為CD151可促使FAK-P130Cas信號(hào)通路磷酸化表達(dá)增加，而破壞CD151-整合素復(fù)合體，則會(huì)減少該信號(hào)通路的激活，提示CD151可能通過(guò)激活FAK-P130Cas通路參與癌細(xì)胞的遷移。此外，CD151還可通過(guò)激活ERK信號(hào)通路促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在體外基質(zhì)膠上的管型結(jié)構(gòu)形成，促進(jìn)體外血管的生成[16]。另有研究證明，在肝細(xì)胞癌中CD151可通過(guò)激活PI3K/Akt/GSK-3β/Snail信號(hào)通路，調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)對(duì)肝癌的促進(jìn)作用[17-18]。研究證實(shí)，Wnt信號(hào)通路與腫瘤轉(zhuǎn)移以及腫瘤內(nèi)部微血管的形成密切相關(guān)，而CD151與整合素α3β1結(jié)合可通過(guò)Wnt通路以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用調(diào)節(jié)卵巢癌的生長(zhǎng)[19]。由此可見(jiàn)，CD151參與了細(xì)胞黏附、細(xì)胞外基質(zhì)黏附并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的移行及微血管形成，推動(dòng)了腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。因此CD151被認(rèn)為是潛在的藥物靶點(diǎn)，用于開發(fā)免疫療法、生物制劑等[20-21]。如CD151肽作為腫瘤疫苗在小鼠乳腺癌和肝癌模型中激活CD8+IFN-γ+淋巴細(xì)胞抑制腫瘤增殖，提示CD151肽引發(fā)的抗腫瘤活性免疫可能成為抑制腫瘤進(jìn)展的有效方法[22]。有研究證實(shí)CD151基因在皮膚鱗狀細(xì)胞癌組織中高表達(dá)，激活轉(zhuǎn)錄因子STAT3以支持角質(zhì)形成細(xì)胞的存活和增殖；沉默CD151基因表達(dá)可導(dǎo)致皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，裸鼠實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)了CD151基因沉默可有效減緩腫瘤的生長(zhǎng)，其機(jī)制可能與促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)[23]。值得注意的是，有些研究發(fā)現(xiàn)CD151、CD9和CD63四跨膜蛋白的表達(dá)降低可與腫瘤更惡性的表型有關(guān)，另一些研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌中CD151表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)展之間呈反比關(guān)系[24-26]。

圖9 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲能力與空載體組和空白對(duì)照組相比，*P<0.05

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法檢測(cè)子宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中CD151蛋白的表達(dá)，并通過(guò)RNAi介導(dǎo)CD151基因沉默，觀察其對(duì)子宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和侵襲的影響。結(jié)果顯示，CD151在子宮頸癌組織中陽(yáng)性；CD151低表達(dá)可抑制子宮頸癌細(xì)胞的增殖；CD151 siRNA組中的癌細(xì)胞比空載體組和空白對(duì)照組更多地進(jìn)入了早期凋亡并且多數(shù)細(xì)胞周期停滯于G1期，這提示CD151表達(dá)缺失可顯著促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡且能阻滯癌細(xì)胞周期的進(jìn)展。CD151 siRNA組癌細(xì)胞較空載體組和空白對(duì)照組細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著降低，提示沉默CD151基因表達(dá)可抑制子宮頸癌細(xì)胞的遷移、侵襲，但其相關(guān)分子機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為臨床治療子宮頸癌提供新思路，如針對(duì)CD151的特性，利用RNA干擾、免疫治療等技術(shù)結(jié)合新的藥物遞送系統(tǒng)靶向殺傷易侵襲轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞。CD151既參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的正常生理過(guò)程，如細(xì)胞黏附、運(yùn)動(dòng)、活化和增殖，又參與促進(jìn)腫瘤病理過(guò)程的發(fā)生、發(fā)展。由于侵襲和轉(zhuǎn)移是造成惡性腫瘤患者死亡的主要原因，因此，本實(shí)驗(yàn)下一步著重探討CD151參與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制，探尋子宮頸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程所處微環(huán)境中復(fù)雜的信號(hào)通路，再通過(guò)激活或沉默相關(guān)信號(hào)分子，抑制腫瘤進(jìn)展，為臨床診治提供更多有效的方法。

綜上所述，CD151蛋白在子宮頸癌組織中高表達(dá)，將其基因沉默后可以使子宮頸癌的細(xì)胞增殖和遷移能力受抑制，CD151檢測(cè)有望成為子宮頸癌預(yù)后評(píng)價(jià)的一種新分子生物學(xué)指標(biāo)。