疊氮溴化丙錠篩選環(huán)境活性微生物的原理及其應(yīng)用

胡曉婧,白 鑫,曲娟娟,劉俊杰,孔令輝,王光華

(1.中國(guó)科學(xué)院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150081; 2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

0 引 言

環(huán)境微生物是自然生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，是驅(qū)動(dòng)地球各圈層物質(zhì)循環(huán)與能量交換的引擎。微生物介導(dǎo)的特定生態(tài)功能過(guò)程主要通過(guò)活性微生物來(lái)執(zhí)行[1]。活性微生物是指具有或潛在具有生長(zhǎng)代謝特性和適應(yīng)改變既定環(huán)境能力的微生物[2]，也是微生物生態(tài)學(xué)中微生物分離培養(yǎng)或功能鑒定的主要目標(biāo)。盡管高通量測(cè)序已成為研究環(huán)境微生物多樣性及其結(jié)構(gòu)功能的主流技術(shù)[3]，但環(huán)境樣品中DNA的直接擴(kuò)增測(cè)序無(wú)法反映出真實(shí)的活性微生物群，很可能高估了環(huán)境中活性微生物的種類和數(shù)量[4]。這是因?yàn)?，環(huán)境微生物總DNA主要包括：(1)活性細(xì)胞DNA，具有代謝活性且可培養(yǎng)的完整細(xì)胞DNA[5]；(2)休眠細(xì)胞DNA，低代謝活性且不可培養(yǎng)的活細(xì)胞和抗生素持留菌細(xì)胞，但在一定條件下或可恢復(fù)其代謝活性和可培養(yǎng)性的完整細(xì)胞DNA[6]；(3)死細(xì)胞DNA，包括細(xì)胞膜受損且正在裂解的和已死亡的非完整細(xì)胞DNA[7]；(4)胞外DNA，包括游離DNA和附著于其他物質(zhì)上的DNA[8]。盡管細(xì)胞死亡后，其所含DNA可能被環(huán)境中的脫氧核糖核酸酶(Deoxyribonuclease,DNase)快速降解，但這種降解是不充分的，仍有大量死細(xì)胞DNA和胞外DNA長(zhǎng)期存留于環(huán)境中[9]。因此，如何準(zhǔn)確區(qū)分并量化環(huán)境活性微生物群，是當(dāng)前環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)研究中亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

目前，國(guó)際上對(duì)活性微生物的判定主要有三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：(1)具有完整且有功能的細(xì)胞膜；(2)存在細(xì)胞代謝和能量流動(dòng)過(guò)程；(3)具有能夠自我復(fù)制的DNA并能轉(zhuǎn)錄成RNA，進(jìn)而翻譯成蛋白[10]。在此基礎(chǔ)上，多種活性微生物篩選區(qū)分方法被逐步開發(fā)出來(lái)(圖1)，它們的相對(duì)優(yōu)缺點(diǎn)見表1，主要分為兩大類：可培養(yǎng)法和不可培養(yǎng)法[2]?？膳囵B(yǎng)法已遠(yuǎn)不能滿足探究環(huán)境微生物多樣性的需求。而ATP生物發(fā)光技術(shù)、微生物呼吸法、酶活性檢測(cè)法以及基于等溫微熱量法的熱流動(dòng)技術(shù)等都受到通量的限制，對(duì)環(huán)境活性微生物的檢測(cè)沒(méi)有普適性[11-13]。在滿足高通量檢測(cè)的基礎(chǔ)上，基于RNA轉(zhuǎn)錄組學(xué)或蛋白組學(xué)技術(shù)、穩(wěn)定性同位素示蹤技術(shù)(DNA-SIP)已被廣泛用于檢測(cè)具有代謝活性的微生物類群，并適用于多種環(huán)境樣品[14-16]。然而，這些方法的實(shí)驗(yàn)步驟較為繁瑣，實(shí)驗(yàn)成本較高，且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中也存在很多限制因素，如RNA極易降解從而增加了實(shí)驗(yàn)操作難度[17]；穩(wěn)定性同位素示蹤技術(shù)通常針對(duì)某些特定的功能微生物，且存在培養(yǎng)周期長(zhǎng)、同位素耗材昂貴等問(wèn)題[18]。因此，急需建立更加普適性且操作簡(jiǎn)便的環(huán)境活性微生物的研究方法。

圖1 活性微生物篩選方法概括[2]Fig.1 Highlight of techniques to distinguish live from dead microbes

表1 活性微生物檢測(cè)的常用技術(shù)手段Table 1 Comparison of commonly used techniques to examine viable microbes

維持細(xì)胞膜的完整性是保持微生物活性的必要條件[19]，因此，細(xì)胞膜也可以被當(dāng)作活性微生物細(xì)胞的分子標(biāo)記物。針對(duì)細(xì)胞膜完整性的檢測(cè)，一系列核酸熒光染料應(yīng)運(yùn)而生，也為基于DNA的活性微生物檢測(cè)開辟了新的思路。其中，碘化丙錠(Propidium iodide,PI)、疊氮溴化乙錠(Ethidium monoazide,EMA)和疊氮溴化丙錠(Propidium monoazide,PMA)是常用的光敏性核酸染料[20-22]。這類染料自身的熒光非常微弱，但與核酸結(jié)合后熒光信號(hào)增強(qiáng)，它們通常不能穿透活性細(xì)胞完整的細(xì)胞膜，但能夠進(jìn)入膜損傷后的死細(xì)胞，修飾鈍化其DNA[22]。PI染料法只能在熒光顯微鏡、激光共聚焦掃描顯微鏡或流式細(xì)胞儀等儀器輔助下進(jìn)行活性細(xì)胞的檢測(cè)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)樣品的高通量測(cè)定，而PMA和EMA可與熒光定量PCR及高通量測(cè)序等技術(shù)相結(jié)合，更適合于復(fù)雜環(huán)境樣品中活性微生物組的檢測(cè)[23]。

1 PMA篩選活性微生物的基本原理

PMA染料法是一種簡(jiǎn)便、快速的篩選區(qū)分活性微生物的方法。它對(duì)DNA具有高度親和性，在暗培養(yǎng)過(guò)程中可高效穿透死細(xì)胞的細(xì)胞膜，與暴露出來(lái)的DNA產(chǎn)生共價(jià)交聯(lián)。在可見光(最大吸收波長(zhǎng)460 nm左右)的作用下，PMA所攜帶的光敏性疊氮基團(tuán)會(huì)轉(zhuǎn)化為高反應(yīng)性的氮賓自由基，并與其結(jié)合位點(diǎn)附近的任意碳?xì)浠衔锓磻?yīng)形成穩(wěn)定的共價(jià)碳氮鍵，致使DNA分子被永久修飾，最后阻斷DNA分子后續(xù)的PCR擴(kuò)增等反應(yīng)(圖2)。同時(shí)那些殘留在溶液中沒(méi)有與DNA分子發(fā)生交聯(lián)的PMA，在強(qiáng)光照射下可與水分子反應(yīng)生成沒(méi)有活性的羥胺[22,24-25]。以上過(guò)程均在環(huán)境樣品DNA提取之前完成，由于PMA不能穿透活性細(xì)胞完整的細(xì)胞膜，故不會(huì)影響后續(xù)活性微生物的DNA提取和PCR擴(kuò)增，最終使relic DNA在核酸純化中被選擇性剔除。PMA篩選后的活性微生物樣品可用于后續(xù)的高通量測(cè)序等多組學(xué)研究[26-27]。

圖2 PMA染料法選擇性檢測(cè)活性微生物細(xì)胞的流程Fig.2 Procedure of PMA dye in selectively detecting viable microbial cells

需要說(shuō)明的是，EMA與PMA的工作原理基本類似，但EMA在隨后的實(shí)驗(yàn)中被發(fā)現(xiàn)可穿透一些活性微生物的細(xì)胞膜，如EscherichiacoliO157:H7、Streptococcussobrinus、Micrococcusluteus、Staphylococcusaureus和Mycobacteriumavium等都能夠吸收EMA[22]，致使這些活性細(xì)胞被當(dāng)作死亡的細(xì)胞而造成了假陰性結(jié)果。此外，由于EMA比PMA多攜帶一個(gè)正電荷，更易穿透活細(xì)胞的細(xì)胞膜，與帶負(fù)電荷的DNA結(jié)合[27]，因此，EMA被發(fā)現(xiàn)較PMA具有更高的細(xì)胞毒性，可能會(huì)殺死一些本來(lái)具有完整細(xì)胞膜的活性微生物[28-29]，如EMA對(duì)Listeriamonocytogenes和Legionellapneumophila的細(xì)胞毒性就要比PMA強(qiáng)[24-25]。相比而言，PMA因其較高的活性細(xì)胞選擇特異性，更適用于復(fù)雜環(huán)境樣品中活性微生物的研究。

目前，基于光敏性核酸染料篩選區(qū)分活性微生物的方法大多應(yīng)用于臨床診斷、食品安全和動(dòng)植物病原菌檢驗(yàn)檢疫等方面[26,29-30]，并初步應(yīng)用在復(fù)雜環(huán)境樣品中活性微生物群的研究中，但仍處于起步階段。本文結(jié)合最新國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展，從底泥、土壤和水體等環(huán)境樣品方面綜述了目前PMA染料法在微生物生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用，并提出PMA技術(shù)現(xiàn)存的一些問(wèn)題及改進(jìn)對(duì)策，為切實(shí)有效地開展環(huán)境活性微生物多樣性及功能研究提供參考。

2 PMA在底泥研究中的應(yīng)用

微生物是底泥生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，驅(qū)動(dòng)著底泥中養(yǎng)分循環(huán)與轉(zhuǎn)化，是底泥生物活性的源泉[31]。Nocker等[32]首次將PMA應(yīng)用于海洋和水庫(kù)的底泥樣品研究，結(jié)合PCR-DGGE技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，與未處理樣品相比，PMA能夠有效地抑制底泥樣品中relic DNA的PCR擴(kuò)增，導(dǎo)致微生物群落的DGGE指紋圖譜和條帶密度產(chǎn)生改變，從而篩選區(qū)分出底泥樣品中活性微生物。Ramirez等[33]采集了北冰洋和太平洋區(qū)域多個(gè)地點(diǎn)的海洋底泥，用PMA去除樣品中relic DNA，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)樣品處理前后的細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)沒(méi)有顯著差異；基于細(xì)菌16S rRNA基因的測(cè)序結(jié)果顯示，盡管有個(gè)別地點(diǎn)的relic DNA含量相對(duì)較高，但它們對(duì)原核微生物的群落組成并未造成顯著影響；物種水平分析表明，原位的relic DNA可能來(lái)源于不同時(shí)期海洋底泥中的微生物，顯示了PMA染料法也有助于海洋底泥微生物起源與演化的研究。Wagner等[34]采用PMA染料法篩選發(fā)酵罐底泥中活性微生物，發(fā)現(xiàn)與處理前樣品相比，PMA處理降低了底泥微生物的DNA產(chǎn)量，且底泥中活性微生物數(shù)量與傳統(tǒng)平板培養(yǎng)法得到的結(jié)果存在很大差異；底泥質(zhì)地的復(fù)雜性可能對(duì)微生物DNA或PMA分子產(chǎn)生吸附作用，從而影響DNA與PMA的結(jié)合，導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性；而發(fā)酵底泥暗黑色的表面也可能會(huì)阻礙可見光的透射性，進(jìn)而使DNA與PMA無(wú)法發(fā)生有效的交聯(lián)反應(yīng)。因此，應(yīng)用PMA染料法篩選區(qū)分環(huán)境底泥中活性微生物群具有可行性，但現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)方法還需進(jìn)一步優(yōu)化改進(jìn)。

3 PMA在土壤研究中的應(yīng)用

微生物在陸地生物地球化學(xué)循環(huán)和維持土壤肥力方面扮演著重要角色[35]。土壤微生物總DNA中除活性微生物DNA外，還包括大量relic DNA[36]，它們能夠與土壤礦物質(zhì)和腐殖質(zhì)結(jié)合并可長(zhǎng)期存留于土壤中[8,37]。Carini等[38]首次利用PMA對(duì)采自美國(guó)地區(qū)大尺度下不同生態(tài)類型的31份土壤樣品進(jìn)行活性微生物的研究，他們對(duì)去除relic DNA的土壤樣品提取微生物DNA，以細(xì)菌16S rRNA和真菌ITS基因?yàn)榘袠?biāo)，進(jìn)行熒光定量PCR測(cè)定和高通量測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)PMA處理的土壤相比，去除relic DNA后的土壤微生物豐度平均降低達(dá)40%，微生物群落多樣性降低最高達(dá)到55%，表明土壤中relic DNA的存在明顯干擾了樣品處理對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)影響的解讀，以及空間尺度上微生物群落分布與環(huán)境條件之間關(guān)系的建立。需要說(shuō)明的是，盡管該研究發(fā)現(xiàn)，relic DNA對(duì)微生物物種相對(duì)豐度影響的偏差最高能達(dá)到25%，但該研究也顯示絕大多數(shù)土壤優(yōu)勢(shì)微生物物種在去除relic DNA后仍然可被檢測(cè)到，并且不同的土壤類型對(duì)微生物群落的影響要明顯大于relic DNA的影響，表明relic DNA的存在對(duì)土壤微生物的群落組成并未產(chǎn)生實(shí)質(zhì)性的改變。Heise等[39]將PMA應(yīng)用于土壤活性產(chǎn)甲烷古菌的研究中，發(fā)現(xiàn)PMA篩選活性產(chǎn)甲烷古菌的有效性與土壤質(zhì)地緊密相關(guān)，黏土和粉土中的relic DNA不能被PMA有效地去除，而PMA可以成功地抑制砂土中relic DNA擴(kuò)增。Gustave等[40]針對(duì)裝配有微生物燃料電池的稻田土壤，經(jīng)PMA處理后發(fā)現(xiàn)，盡管微生物燃料電池運(yùn)行過(guò)程中增加了土壤中relic DNA的含量，且影響了一些物種(如Geobacter和CandidatusMethanoperedens)的相對(duì)豐度，但relic DNA對(duì)活性微生物的群落組成和結(jié)構(gòu)并沒(méi)有產(chǎn)生顯著影響，這可能是由于土壤中微生物活性細(xì)胞和非活性殘?bào)w的周轉(zhuǎn)速率始終保持著動(dòng)態(tài)平衡。盡管PMA在篩選土壤活性微生物群及評(píng)估relic DNA殘留對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響程度方面已有一定報(bào)道，但PMA對(duì)不同類型土壤和微生物類群的適用性及其最佳實(shí)驗(yàn)條件仍需大量數(shù)據(jù)的積累。例如，某些微生物細(xì)胞死亡后可能仍保持有完整的細(xì)胞膜，而濃度尚不充足的PMA或許無(wú)法有效地穿透這些完整的細(xì)胞[41]。因此，PMA在復(fù)雜土壤樣品的應(yīng)用中仍存在許多問(wèn)題亟待解決。

4 PMA在水體研究中的應(yīng)用

相比底泥和土壤樣品，水體中的relic DNA可能會(huì)更快速地被脫氧核糖核酸酶降解，因而其含量相對(duì)較少，如Dell′Anno和Danovaro[42]報(bào)道過(guò)水體中relic DNA的降解比其相應(yīng)的底泥中的所需時(shí)間少7～100倍之多。目前，針對(duì)水體樣品，PMA染料法大多應(yīng)用于選擇性檢測(cè)飲用水等水體中活性病原菌的研究。仝鐵錚等[43]以大腸桿菌(Escherichiacoli)作為模式菌，應(yīng)用PMA-qPCR技術(shù)研究了氯和一氯胺消毒對(duì)飲用水中病原菌的滅活效果，結(jié)果表明，PMA能夠鈍化99.94%和99.99%的分別來(lái)自非活性大腸桿菌和沙門氏菌(Salmonella)的DNA，說(shuō)明PMA-qPCR技術(shù)可有效區(qū)分活性菌與非活性菌，并有助于更準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)氯和一氯胺消毒對(duì)飲用水病原菌的滅菌效果。Singh等[44]采用PMA-qPCR技術(shù)對(duì)印度北部昌迪加爾市的飲用水及其源頭水中活性沙門氏菌進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)飲用水及其源頭水中活性沙門氏菌含量分別為2～7 160 CFU·100 mL-1和2.1×104～2.6×106CFU·100 mL-1，而凈化處理后的飲用水中未檢出活性沙門氏菌，表明該技術(shù)能夠有效地用于城市飲用水污染的監(jiān)管。Yuan等[45]采集了美國(guó)密蘇里地區(qū)城市管道飲用水和多處河流水樣品，并對(duì)這些水樣接種動(dòng)物糞便大腸桿菌，研究發(fā)現(xiàn)添加5 μmol的PMA并曝光處理10 min，即可抑制1×105CFU·mL-1大腸桿菌死細(xì)胞DNA的擴(kuò)增。該研究還顯示，PMA的添加濃度和曝光時(shí)間根據(jù)采樣季節(jié)的不同而有所差異，表明需確定合適的PMA前處理方法才能較為準(zhǔn)確地量化水樣中的活性病原菌，從而有效地評(píng)估水樣質(zhì)量。

5 PMA在其他環(huán)境樣品研究中的應(yīng)用

除底泥、土壤和水體等常見環(huán)境樣品外，PMA染料法在篩選區(qū)分其他環(huán)境樣品活性微生物的應(yīng)用僅有少量報(bào)道。Vaishampayan等[46]采用PMA結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)國(guó)際空間站宇航員居住艙內(nèi)的活性微生物進(jìn)行檢測(cè)，研究發(fā)現(xiàn)，太空艙內(nèi)總微生物和活性微生物的群落組成差異很大，這可能是由于艙內(nèi)屬極度潔凈區(qū)域，僅有的微生物大多屬于稀有物種，而PMA會(huì)完全結(jié)合某些稀有物種的全部DNA(它們可能只以relic DNA形式存在)，如加入PMA后，無(wú)法再檢測(cè)到一些具有抗性生理特性的細(xì)菌。Seidel等[47]等利用PMA對(duì)人和多種動(dòng)物糞便中活性擬桿菌(Bacteroides)進(jìn)行檢測(cè)，研究發(fā)現(xiàn)添加0.5%的二甲基亞砜(DMSO)能夠顯著增強(qiáng)PMA對(duì)擬桿菌死細(xì)胞PCR擴(kuò)增信號(hào)的抑制效果；同時(shí)，增加目的片段的擴(kuò)增長(zhǎng)度，可提高PMA去除擬桿菌死細(xì)胞DNA的效率。由此可見，除PMA添加濃度、暗培養(yǎng)和曝光時(shí)間等應(yīng)用條件需進(jìn)一步優(yōu)化外，還應(yīng)對(duì)后續(xù)的定量PCR和高通量測(cè)序等結(jié)合技術(shù)進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整和改進(jìn)，以期進(jìn)一步提高PMA篩選區(qū)分環(huán)境樣品活性微生物的有效性和準(zhǔn)確性。

6 存在的問(wèn)題及展望

PMA染料法用于環(huán)境活性微生物的篩選研究尚處于起步階段，由于環(huán)境樣品的復(fù)雜性，該方法的廣泛應(yīng)用仍受到很多限制，還需大量研究加以改進(jìn)和完善：

(1)針對(duì)不同類型的環(huán)境樣品，需首先確定最佳的PMA添加濃度、暗培養(yǎng)和曝光時(shí)間。在暗培養(yǎng)和曝光過(guò)程中，需輕微震蕩離心管以避免局部染料過(guò)多破壞細(xì)胞的活性，同時(shí)使PMA與relic DNA充分結(jié)合并產(chǎn)生共價(jià)交聯(lián)，以及多余的PMA與溶液中水分子發(fā)生結(jié)合形成羥胺，避免影響后續(xù)活菌裂解及其DNA的擴(kuò)增反應(yīng)。也可通過(guò)多循環(huán)PMA處理加以改進(jìn)，即樣品添加PMA后曝光之后再次添加PMA并曝光。

(2)可見光類型和光照強(qiáng)度也是影響PMA處理效果的因素之一。目前絕大多數(shù)基于PMA染料法的研究，在其曝光步驟中，都是采用500～650 W鹵素?zé)魧?duì)樣品進(jìn)行照射10～20 min，同時(shí)將樣品放置距離鹵素?zé)?5～20 cm左右的冰面上，以避免溫度過(guò)高對(duì)活性微生物造成損傷。然而，鹵素?zé)艨勺兊墓鈴?qiáng)度和未知的光譜特性，可能會(huì)造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果難以解釋或產(chǎn)生偏差，加之鹵素?zé)舻臏囟确浅８?，?dāng)樣品受熱不均時(shí)可能會(huì)造成完整細(xì)胞膜的破損或是塑料管子的熔化，存在一定實(shí)驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)。目前可應(yīng)用專業(yè)的PMA LED光解儀來(lái)代替鹵素?zé)簦渥詣?dòng)的冷卻循環(huán)系統(tǒng)和適當(dāng)?shù)腜MA光解波長(zhǎng)有助于提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

(3)環(huán)境樣品的濁度、pH和鹽分含量等也會(huì)影響PMA篩選活性微生物的有效性。如土壤樣品，可通過(guò)稀釋土樣使土壤顆粒充分分散于緩沖液中，從而提高PMA與relic DNA的結(jié)合效率。與此同時(shí)，稀釋后的土壤懸液可能存在微生物濃度較低、定量不準(zhǔn)確等問(wèn)題，或可采用數(shù)字PCR對(duì)樣品中微生物的絕對(duì)豐度進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

(4)適當(dāng)增加目的基因的片段擴(kuò)增長(zhǎng)度和PCR循環(huán)次數(shù)也可提高PMA去除環(huán)境樣品中relic DNA的準(zhǔn)確性。擴(kuò)增較長(zhǎng)的目的基因片段有助于減少實(shí)驗(yàn)中relic DNA的假陽(yáng)性結(jié)果。此外，也可采用兩步擴(kuò)增的巢式PCR法，以達(dá)到準(zhǔn)確檢測(cè)活性微生物數(shù)量的目的。

(5)添加適當(dāng)?shù)腜MA促進(jìn)劑也可提高其處理效果，如脫氧膽酸鹽可促進(jìn)PMA對(duì)革蘭氏陰性死細(xì)菌的結(jié)合效率，同時(shí)不會(huì)對(duì)活性細(xì)胞產(chǎn)生影響[48]。二甲基亞砜(DMSO)和乙二胺四乙酸(EDTA)可增強(qiáng)PMA對(duì)細(xì)胞膜的穿透性[49]。盡管如此，這些促進(jìn)劑的使用需在保證不損傷活性細(xì)胞的前提下進(jìn)行。

(6)盡管PMA染料法的廣泛應(yīng)用尚存在一些問(wèn)題，但它具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高和低成本等優(yōu)點(diǎn)，不僅能增強(qiáng)人們對(duì)復(fù)雜環(huán)境樣品中活性微生物類群的認(rèn)識(shí)，還可與高通量測(cè)序等多組學(xué)技術(shù)相結(jié)合，在環(huán)境微生物的種質(zhì)資源挖掘與功能開發(fā)利用等方面具有較大的應(yīng)用前景。