卵巢癌類器官的建立及其在藥物測(cè)試中的應(yīng)用進(jìn)展

陳 棟，時(shí)艷芳，劉宇辰

1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院甲狀腺乳腺外科（廣東深圳 518036）

2.深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院深圳市轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院（廣東深圳 518035）

3.平邑縣中醫(yī)醫(yī)院婦科（山東臨沂 276000）

卵巢癌是嚴(yán)重威脅生命健康的惡性腫瘤，死亡率居女性惡性腫瘤首位。由于早期臨床癥狀的隱匿性或非特異性，超過80%的患者直到癌轉(zhuǎn)移或晚期才被診斷出來。大多數(shù)卵巢癌表現(xiàn)為上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC），其中75%的EOC患者被診斷為高級(jí)別漿液性卵巢癌（high-grade serous ovarian cancer，HGSOC），死亡率高達(dá)80%[1]。早期診斷的缺乏以及術(shù)后化療效果差等原因，導(dǎo)致過去幾十年卵巢癌患者的整體生存率提升有限[2]，尋找與開發(fā)新的治療方案是當(dāng)前卵巢癌研究和治療的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。

傳統(tǒng)二維培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系和腫瘤異種移植動(dòng)物模型作為臨床前研究模型被廣泛使用，但都存在一定的缺陷。二維培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞操作簡(jiǎn)單，適用于高通量藥物篩選，但在長(zhǎng)期的培養(yǎng)過程中喪失了腫瘤的異質(zhì)性，無法模擬患者體內(nèi)腫瘤的復(fù)雜結(jié)構(gòu)、病理特征、基因型以及細(xì)胞間的信號(hào)通路[3]。源自患者的異種移植模型雖然能夠模擬親本腫瘤的特征，維持腫瘤異質(zhì)性和基因組穩(wěn)定性，但其構(gòu)建效率低、耗時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用昂貴、存在種屬差異，也不適合高通量藥物篩選[4]。

近年來，腫瘤類器官培養(yǎng)技術(shù)的出現(xiàn)與發(fā)展為腫瘤研究帶來了全新的臨床前研究模型。類器官是在體外對(duì)干細(xì)胞或器官祖細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化形成的，在結(jié)構(gòu)和功能上類似目標(biāo)器官或組織的三維細(xì)胞復(fù)合體,具有穩(wěn)定的表型和遺傳學(xué)特征，能夠在體外長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)。腫瘤類器官模型不僅能夠展現(xiàn)其來源腫瘤的病理學(xué)特征，保持基因表達(dá)的穩(wěn)定性，還能精確地預(yù)測(cè)患者對(duì)抗腫瘤藥物的反應(yīng)。目前已經(jīng)報(bào)道了膀胱癌[5]、胃癌[6]、前列腺癌[7]、胰腺癌[8]、肝癌[9]、乳腺癌[10]、子宮內(nèi)膜癌[11]、結(jié)腸癌[12]等多種腫瘤類器官模型。研究表明這些腫瘤類器官?gòu)慕M織病理學(xué)特征、基因拷貝數(shù)變化和基因突變類型等方面都能夠高度還原在體腫瘤的特征，是目前腫瘤基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用相互轉(zhuǎn)換的橋梁。借助于腫瘤類器官庫(kù)的建立，及其對(duì)藥物殺傷效果預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，可以在制定腫瘤患者治療策略前，一方面通過檢測(cè)腫瘤類器官的突變類型，確定可能起作用的候選藥；另一方面利用腫瘤類器官對(duì)藥物進(jìn)行篩選，獲得在類器官上對(duì)腫瘤有殺傷作用而對(duì)健康組織毒副作用較小的藥物，進(jìn)而應(yīng)用于臨床，實(shí)現(xiàn)腫瘤的個(gè)體化治療。近年來，卵巢癌類器官的構(gòu)建及應(yīng)用研究取得了重要成果（圖1）。本文圍繞卵巢癌類器官模型的建立、鑒定及其在藥物測(cè)試中的最新研究進(jìn)展作一綜述。

圖1 卵巢癌類器官模型的建立、鑒定以及在藥物測(cè)試中的應(yīng)用研究流程圖Figure 1.The establishment and identification of ovarian cancer organoid model and its application research model diagram in drug testing

1 卵巢癌類器官的建立

與細(xì)胞系的培養(yǎng)方式不同，類器官是將從組織或器官分離出的多能干細(xì)胞或器官祖細(xì)胞置于基質(zhì)膠中進(jìn)行三維培養(yǎng)。培養(yǎng)基中需要添加多種生長(zhǎng)因子、抑制因子、激素等為類器官提供類似在體的生長(zhǎng)環(huán)境。2009年，Hans等通過向培養(yǎng)基中加入表皮生長(zhǎng)因子、Wnt（wingless/integration-1）信號(hào)激動(dòng)劑、R-脊椎蛋白 1（roof plate-specific spondin 1，R-spondin-1）和骨形成蛋白信號(hào)抑制劑頭蛋白（noggin）等培養(yǎng)出小腸類器官[13]。2011年，其團(tuán)隊(duì)再次通過引入煙酰胺、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胃泌素、p38抑制劑SB202190、間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，Alk）抑制劑A83-01等成功培養(yǎng)出小腸和結(jié)腸的多種疾病類器官模型[12]。

近年來相繼報(bào)道了卵巢癌類器官培養(yǎng)體系的建立和應(yīng)用。2018年，Hill等利用22名HGSOC患者的腫瘤標(biāo)本建立了33個(gè)類器官系，這些類器官來源于原發(fā)性、轉(zhuǎn)移性以及復(fù)發(fā)性腫瘤部位提取的實(shí)體瘤，同時(shí)，他們從提取的腹水或胸膜液中培養(yǎng)出類器官，成功率接近100%，與其他腫瘤類器官培養(yǎng)組分相似，HGSOC類器官培養(yǎng)基中也需要添加R-spondin-1，這表明該類器官的生長(zhǎng)是Wnt通路依賴的[14]。2019年，Kopper等利用32位患者的腫瘤樣本分別建立了56個(gè)類器官系，幾乎涵蓋了EOC的所有亞型[15]。除了建立常見的HGSOC類器官，該團(tuán)隊(duì)也成功培養(yǎng)出低級(jí)別惡性亞型如低級(jí)別漿液性癌（low-grade serous carcinoma，LGSC）類器官和透明細(xì)胞癌（clear cell carcinoma，CCC）類器官?；颊叩脑l(fā)腫瘤以及不同位置的轉(zhuǎn)移灶都可以用于構(gòu)建類器官，表明該模型是卵巢癌異質(zhì)性研究的潛在材料[15]。研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加皮質(zhì)醇、毛喉素和神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1因子能夠顯著提高卵巢癌類器官構(gòu)建的成功率，但Wnt因子不是必需的[15]。優(yōu)化后的培養(yǎng)基可使卵巢癌類器官長(zhǎng)期、穩(wěn)定傳代培養(yǎng)，并像細(xì)胞系一樣低溫凍存和高效復(fù)蘇[15]。Maenhoudt等測(cè)試多種培養(yǎng)基成分發(fā)現(xiàn)神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1是EOC類器官生長(zhǎng)的關(guān)鍵因子，而且還能增加EOC類器官的傳代數(shù)[16]。Hoffmann等發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)途徑的激活會(huì)導(dǎo)致HGSOC類器官生長(zhǎng)停滯，表明低量的Wnt環(huán)境有利于HGSOC類器官的長(zhǎng)期穩(wěn)定生長(zhǎng)[17]。另一項(xiàng)研究成功培養(yǎng)出I-III期不同亞型的卵巢癌類器官，建系成功率約為80%，其與先前報(bào)道的主要區(qū)別在于培養(yǎng)基中沒有添加煙酰胺、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1、皮質(zhì)醇和毛喉素因子，而加入了胃泌素和胰島素生長(zhǎng)因子[18]。卵巢癌類器官的構(gòu)建方法并不唯一，不同的培養(yǎng)基組分會(huì)導(dǎo)致建系效率和成功率有所差異。個(gè)性化的培養(yǎng)方式也有利于建立不同亞型的卵巢癌類器官用于科學(xué)研究和臨床試驗(yàn)。

2 卵巢癌類器官重現(xiàn)腫瘤組織的表型和基因型

類器官是由不同類型細(xì)胞構(gòu)成的復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)，需對(duì)培養(yǎng)的腫瘤類器官進(jìn)行身份驗(yàn)證以確定其是否能夠維持親本腫瘤的特征。通常從基因型和表型兩個(gè)方面來鑒定類器官與原始腫瘤的同源性?；蛐蜕铣Ｓ萌蚪M或者全外顯子組測(cè)序的方法來表征腫瘤組織和對(duì)應(yīng)類器官在拷貝數(shù)改變和體細(xì)胞突變上的一致性。表型上可以通過蘇木精和伊紅（hematoxylin-eosin staining，H&E）染色和免疫組織化學(xué)染色對(duì)腫瘤組織和對(duì)應(yīng)的類器官進(jìn)行組織病理學(xué)分析，以確定類器官的表型是否與其來源的腫瘤一致。

Hill等根據(jù)H&E染色發(fā)現(xiàn)HGSOC類器官與親本腫瘤在形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)上相匹配，親本腫瘤和其產(chǎn)生的類器官都表現(xiàn)出廣泛的核多態(tài)性以及突出的核仁和致密的染色質(zhì)，重現(xiàn)了HGSOC的細(xì)胞學(xué)特征[14]。免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)類器官和親本腫瘤在標(biāo)志蛋白的表達(dá)上也相符。例如，大多數(shù)HGSOC的腫瘤組織以及對(duì)應(yīng)的類器官對(duì)苗勒管的標(biāo)志物配對(duì)盒基因8（paired-box 8，PAX8）都呈陽(yáng)性反應(yīng)，在HGSOC類器官中檢測(cè)到突變型p53的免疫陽(yáng)性顯色同樣也存在于其對(duì)應(yīng)的腫瘤樣本中。通過全外顯子測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，HGSOC類器官與親本腫瘤中基因突變相似度的中位數(shù)為98.2%。卵巢癌和類器官在基因突變譜上的高度一致性表明HGSOC類器官可作為評(píng)估親本腫瘤DNA損傷修復(fù)缺陷的模型。另一項(xiàng)研究建立的不同病理學(xué)亞型的EOC類器官表現(xiàn)出廣泛的形態(tài)學(xué)差異，轉(zhuǎn)移癌產(chǎn)生的類器官也與在體的癌灶在病理學(xué)上表現(xiàn)出高度的一致性[15]。EOC類器官重現(xiàn)了親本腫瘤的基因突變和拷貝數(shù)變異模式，即使經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間傳代培養(yǎng)后，親本腫瘤中的基因突變和基因拷貝數(shù)變異在類器官中仍然得到了較好的維持[15]。EOC類器官還能夠重現(xiàn)疾病的細(xì)胞和分子表型，并顯示出親本腫瘤中存在的非典型性和蛋白質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)[16]。低覆蓋率的全基因組測(cè)序表明，腫瘤中的絕大多數(shù)體細(xì)胞拷貝數(shù)改變同樣保留在相應(yīng)的類器官中。全外顯子測(cè)序發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)遺傳改變都同時(shí)存在于原發(fā)腫瘤和對(duì)應(yīng)的類器官中[16]。此外，近期兩項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)患者來源的卵巢癌類器官高度重現(xiàn)了原始腫瘤的基因組學(xué)特征[18-19]。以上研究表明，患者卵巢癌衍生的類器官能夠高度還原體內(nèi)腫瘤的形態(tài)特征、疾病特征和基因組構(gòu)成。

異質(zhì)性被認(rèn)為是癌癥治療失敗的主要原因，建立個(gè)體化的臨床前模型對(duì)于預(yù)測(cè)癌癥的藥物反應(yīng)和制定有效的治療策略至關(guān)重要。腫瘤異質(zhì)性不僅表現(xiàn)在不同患者之間的差異，還表現(xiàn)在同一患者體內(nèi)不同腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的差異，其導(dǎo)致患者的腫瘤生長(zhǎng)速度、侵襲能力、藥物敏感性和預(yù)后都存在顯著差異[20]。異質(zhì)性同樣是卵巢癌的重要臨床特征，研究表明卵巢癌類器官能夠反映患者體內(nèi)腫瘤的異質(zhì)性特征[15,21]。Kopper等通過對(duì)原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性的卵巢癌類器官進(jìn)行拷貝數(shù)變異分析發(fā)現(xiàn)，患者腫瘤的拷貝數(shù)變化只存在于轉(zhuǎn)移部位，而且這些拷貝數(shù)變異在腫瘤和相應(yīng)的類器官之間高度保守，說明卵巢癌在進(jìn)化過程中的不同時(shí)間點(diǎn)基因組發(fā)生了改變，而且卵巢癌類器官可以精確反映腫瘤的異質(zhì)性[15]。通過單細(xì)胞DNA測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)卵巢癌類器官本身的異質(zhì)性與原始腫瘤樣本具有很大的相似性，表明類器官可以用作研究卵巢癌異質(zhì)性的有效工具[15]。

3 卵巢癌類器官在抗腫瘤藥物測(cè)試中的應(yīng)用

新藥研發(fā)是一個(gè)復(fù)雜、漫長(zhǎng)、耗資巨大，且失敗率較高的過程。由于缺乏可靠的疾病模型，利用腫瘤細(xì)胞系和動(dòng)物模型開發(fā)的大多數(shù)藥物在臨床試驗(yàn)中被證實(shí)無效[22-23]。化療是臨床治療卵巢癌的重要手段，近年來針對(duì)卵巢癌患者的分子靶向治療也顯示出了廣闊的應(yīng)用前景，然而，靶向藥物僅對(duì)部分患者有效，患者對(duì)化學(xué)藥物的敏感度也存在差異。腫瘤類器官作為新的臨床前疾病模型在臨床治療藥物篩選上具有巨大的潛力和價(jià)值?；蚪M分析發(fā)現(xiàn)高達(dá)50%的HGSOC患者具有DNA修復(fù)缺陷，通常是乳腺癌1號(hào)基因（breast cancer 1，BRCA1）或乳腺癌 2號(hào)基因（breast cancer 2，BRCA2）突變引起的。Hill等通過測(cè)試22名患者腫瘤組織制備的33例HGSOC類器官在同源重組和復(fù)制叉保護(hù)上的缺陷發(fā)現(xiàn)，無論發(fā)生哪一種DNA修復(fù)基因突變，類器官中同源重組功能的缺陷都與聚腺苷二磷酸核糖聚合酶 [poly(ADP-ribose)polymerase，PARP] 抑制劑的敏感性相關(guān)，因此PARP抑制劑可能是這些患者的潛在治療藥物[14]。此外，復(fù)制叉保護(hù)的功能缺陷也與卡鉑、細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶1（checkpoint kinase 1，CHK1）和共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變基因Rad3相關(guān)激酶（ataxia telangiectasia and Rad3 related，ATR）抑制劑的敏感性相關(guān)[14]。與基因組分析方法相比，基于類器官模型進(jìn)行功能測(cè)定能更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)臨床治療效果。將卵巢癌類器官的基因組分析和功能測(cè)試相結(jié)合，可以更好地識(shí)別靶向DNA損傷和修復(fù)缺陷。Kopper等利用56例患者的卵巢癌類器官，測(cè)定了其對(duì)臨床治療方案中常用的鉑類與紫杉醇類和非鉑類藥物的敏感性，以及在復(fù)發(fā)性疾病中獲得的化學(xué)耐藥性，研究發(fā)現(xiàn)不同患者來源的卵巢癌類器官對(duì)藥物的反應(yīng)存在明顯差異，顯示出類器官對(duì)藥物反應(yīng)的多樣化，表明卵巢癌類器官有望作為預(yù)測(cè)患者臨床化療效果的臨床前模型[15]。

近期的幾項(xiàng)研究也顯示了卵巢癌類器官作為臨床前模型的潛在價(jià)值。Maenhoudt等通過測(cè)試臨床常用的化療藥物（紫杉醇、卡鉑、阿霉素、吉西他濱）在HGSOC類器官中的反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，卵巢癌類器官對(duì)化療藥物表現(xiàn)出特異的敏感性，不同藥物對(duì)同一患者來源的類器官也產(chǎn)生差異化的效果，表明卵巢癌衍生的類器官對(duì)于藥物篩選具有潛在的適用性[16]。另一項(xiàng)研究納入了23名經(jīng)全基因組測(cè)序的卵巢癌患者，他們的卵巢癌類器官維持了原始腫瘤病變的基因組特征，并重現(xiàn)了患者對(duì)新輔助卡鉑與紫杉醇聯(lián)合治療的反應(yīng)，研究還發(fā)現(xiàn)卵巢癌類器官對(duì)化療藥物和靶向藥物的反應(yīng)表現(xiàn)出患者間和腫瘤內(nèi)部對(duì)藥物反應(yīng)的異質(zhì)性[19]。此外，Nanki等利用23種FDA批準(zhǔn)的藥物在原發(fā)性卵巢癌患者制備的類器官上進(jìn)行了敏感性測(cè)試，表明這些類器官培養(yǎng)物可用于篩選有效的個(gè)性化的治療藥物[18]。Chen等開發(fā)了以HGSOC惡性滲出標(biāo)本為原料的類器官培養(yǎng)模型，這種標(biāo)本可以在體外快速產(chǎn)生類器官，并至少能存活6天[24]。使用這些類器官進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)可以篩選出具有治療潛力的藥物，有助于篩選新藥或?yàn)楝F(xiàn)有的治療方案提供個(gè)性化的選擇。

近年來，卵巢癌類器官的相關(guān)研究都顯示出其在臨床藥物治療效果預(yù)測(cè)上的巨大潛力，表明以卵巢癌類器官進(jìn)行藥物測(cè)試指導(dǎo)個(gè)體化臨床治療的思路具有實(shí)踐價(jià)值。鑒于卵巢癌類器官對(duì)體內(nèi)腫瘤的基因表達(dá)譜和臨床特征的保持，可以對(duì)患者腫瘤來源的類器官進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，并進(jìn)行高通量藥物篩選，以找到適合每位患者的最佳治療方案。

4 結(jié)語(yǔ)

卵巢癌類器官是卵巢癌病變組織的潛在“替身”，它能夠精確還原患者體內(nèi)腫瘤的復(fù)雜結(jié)構(gòu)、功能特征以及對(duì)藥物的反應(yīng)，進(jìn)而成為患者個(gè)性化治療的臨床前模型，極大推動(dòng)卵巢癌轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展進(jìn)程。類器官培養(yǎng)技術(shù)還可從正常組織、癌前病變、低度惡性腫瘤到高度惡性腫瘤的過程中培養(yǎng)不同類型的類器官，用于分析基因突變和病理特征，實(shí)現(xiàn)早預(yù)防、早發(fā)現(xiàn)、早治療，對(duì)于卵巢癌的早期篩查具有重要意義。

目前的類器官模型仍存在缺陷，如其本質(zhì)仍是體外模型，缺乏與腫瘤微環(huán)境成分（如基質(zhì)、血管、免疫細(xì)胞、微生物群等）的相互作用。相關(guān)研究提出通過類器官與生物工程技術(shù)相結(jié)合（如類器官芯片）來克服上述缺陷。未來的挑戰(zhàn)是將微環(huán)境的成分與卵巢癌類器官進(jìn)行共培養(yǎng)，開發(fā)出更貼合生理狀態(tài)的模型，以分析感染物、免疫系統(tǒng)和癌癥進(jìn)展之間的聯(lián)系。盡管目前腫瘤類器官技術(shù)仍存在一定局限，尚需進(jìn)一步優(yōu)化以用于疾病建模和個(gè)性化醫(yī)療，但類器官仍是腫瘤基礎(chǔ)研究和轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中的重要工具，有助于推動(dòng)卵巢癌個(gè)體化精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展。