好氧反硝化菌的固定化及其效能研究

尹超 李瑩 張婷月 劉佳敏 陳體達(dá) 崔丹 黃民生

摘要： 為了提高好氧反硝化菌的環(huán)境耐受性和脫氮效率， 采用聚乙烯醇（PVA）、海藻酸鈉（SA）和稻殼粉作為載體對(duì)好氧反硝化菌進(jìn)行固定化， 并對(duì)固定化顆粒的性能進(jìn)行評(píng)價(jià). 結(jié)果如下： 固定化顆粒最佳配比為12%聚乙烯醇（PVA）、8%海藻酸鈉（SA）、0.5 g稻殼粉和10 mL菌液; 固定化顆粒具有較好的穩(wěn)定性和傳質(zhì)性， 48 h的總氮（TN）去除率為89.35% ～ 90.12%. 固定化顆粒對(duì)pH值和轉(zhuǎn)速具有良好的耐受性， pH值為11時(shí)， TN去除率為90%; 120 r/min時(shí)TN和NH4+-N去除率最高， 分別為91.29%和93.30%; 固定化顆粒不耐低溫（10℃和15℃）， 在10℃時(shí)， TN去除率僅為20%左右; 但是在30℃時(shí)， TN去除率可達(dá)90.59%.

關(guān)鍵詞： 好氧反硝化菌; 固定化; 脫氮

中圖分類(lèi)號(hào)： X522 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A DOI： 10.3969/j.issn.1000-5641.2021.04.001

Immobilization and efficacy of an aerobic denitrifier

YIN Chao1，2，3，4， LI Ying1，2，3，4， ZHANG Tingyue1，2，3，4， LIU Jiamin1，2，3，4， CHEN Tida1，2，3，4， CUI Dan1，2，3，4， HUANG Minsheng1，2，3，4

（1. Shanghai Key Laboratory for Urban Ecological Processes and Eco-Restoration， School of Ecological and Environmental Sciences， East China Normal University， Shanghai 200241， China; 2. Institute of EcoChongming， Shanghai 202162， China; 3. Shanghai Engineering Rearch Center of Biotransformation of Organic Solid Waste， Shanghai 200241， China; 4. Technology Innovation Center for Land Spatial EcoRestoration in Metropolitan Area （Ministry of Natural Resources）， Shanghai 200062， China）

Abstract： To improve the environmental tolerance and nitrogen removal efficiency of an aerobic denitrifier， polyvinyl alcohol （PVA）， sodium alginate （SA）， and rice hull powder were used as immobilized carriers for an aerobic denitrifier and the performance was subsequently evaluated. The results showed that the optimal ratio of immobilized particles was a mixture of 12% PVA， 8% sodium alginate （SA）， 0.5 g rice hull powder， and 10 mL bacterial solution. The immobilized particles had strong stability and mass transfer capability; the removal efficiency of TN was 89.35% ～ 90.12% over 48h. The immobilized particles had good tolerance to pH and rotating speed. When the pH was 11， the removal efficiency of TN was 90%. The removal efficiency of TN and NH4+-N was the highest （91.29% and 93.30%， respectively） when the speed was 120 r/min. The immobilized particles were not resistant to low temperatures （10℃ and 15℃）， and the TN removal efficiency was only about 20% at 10℃. The TN removal efficiency， however， achieved 90.59% at 30℃.

Keywords： aerobic denitrifer; immobilization; denitrification

0 引 言

好氧反硝化菌因同時(shí)具有硝化-反硝化功能、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)而逐漸成為處理氮污染水體的新生力量[1-4]. 但是實(shí)際工程中若直接利用好氧反硝化菌修復(fù)水體， 很可能會(huì)因?yàn)樗坎▌?dòng)、雨水沖刷、噬菌體吞噬、有毒物質(zhì)抑制等因素導(dǎo)致菌體流失、死亡， 使得水體的修復(fù)效果變差[5-6]. 研究表明，利用包埋固定化技術(shù)固定微生物能夠提高微生物抗沖擊能力、防止微生物流失、提高脫氮效率[7-9]. 例如， 將海藻酸鈉（SA）與Klebsiella sp. FC61細(xì)菌混合固定， NH4+-N去除率由61.37%提高到72.15%[10];利用固定化技術(shù)包埋活性污泥后， NH4+-N去除率能達(dá)100%[11]. Zhou等[12]利用氧化石墨烯（GO）對(duì)聚乙烯醇（PVA）進(jìn)行改性， 發(fā)現(xiàn)改性組的COD去除率比未改性組提高10%. 現(xiàn)階段研究微生物固定化主要還集中于價(jià)格昂貴的材料， 大規(guī)模使用的可操作性仍值得商榷. 探索利用廉價(jià)添加劑（稻殼粉）作為固定化材料， 不僅降低固定化成本、提供碳源、增加孔隙率， 而且能有效解決農(nóng)林廢棄物的問(wèn)題.

基于此， 本研究以前期篩選出的好氧反硝化菌群LHJ-1為研究對(duì)象， 探討以PVA、SA和稻殼粉為主要固定化材料對(duì)好氧反硝化菌的脫氮性能進(jìn)行提升; 并探究固定化材料的最佳配比及固定化顆粒對(duì)環(huán)境因子（轉(zhuǎn)速、pH值、溫度）的耐受性進(jìn)行分析， 旨在為好氧反硝化菌固定化技術(shù)在實(shí)際氮超標(biāo)的城鎮(zhèn)污水的應(yīng)用上提供一定的理論指導(dǎo).

1 材料與方法

1.1 好氧反硝化菌及DTM培養(yǎng)基

好氧反硝化菌主要來(lái)自龍泓澗底泥的富集培養(yǎng). DTM液體培養(yǎng)基由C4H4Na2O4 0.405 1 g/L、KNO3 1.000 0 g/L、KH2PO4 0.007 0 g/L、K2HPO4 0.027 0 g/L、MgSO4 0.005 0 g/L和微量元素溶液（2.000 0 mL/L）組成. 其中， 微量元素溶液組成由EDTA 100.0 mg/L、ZnSO4 4.4 mg/L、CaCl2 11.0 mg/L、MnCl2·7H2O 10.2 mg/L、FeSO4·7H2O 10.0 mg/L、（NH4）6Mo7O24·4H2O 2.2 mg/L、CuSO4·5H2O 3.2 mg/L、CoCl2·6H2O 3.2 mg/L組成[13].

1.2 固定化顆粒制備

向含100 mL水燒杯中加入定量的PVA、SA、稻殼粉， 用無(wú)菌封口膜封住并置于水浴鍋（85℃）中溶解. 待冷卻至室溫后加入定量菌液并緩慢攪拌， 避免產(chǎn)生氣泡， 然后放入生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h. 同時(shí)， 向飽和硼酸溶液中加入3%的CaCl2， 并調(diào)節(jié)pH值至6.5 ～ 7.0， 配制成交聯(lián)劑. 培養(yǎng)4 h后用醫(yī)用注射器將PVA-SA-稻殼粉混合液緩慢加入CaCl2-硼酸飽和溶液中， 并使用玻璃棒緩慢攪拌， 防止顆粒粘連， 交聯(lián)4 h后轉(zhuǎn)入0.5 mol/L的Na2SO4溶液中再交聯(lián)1 h. 取出后用0.9% NaCl溶液沖洗， 放入冰箱中保存.

1.3 固定化顆粒性能評(píng)價(jià)

（1）穩(wěn)定性： 向含100 mL蒸餾水的錐形瓶中加入30顆固定化顆粒， 于120 r/min（高速）、30℃搖床中培養(yǎng)48 h， 然后觀察顆粒破裂情況.

（2）傳質(zhì)性能： 向高溫滅菌的DTM液體培養(yǎng)基中加入30顆固定化顆粒， 于120 r/min、30℃搖床中培養(yǎng)48 h， 測(cè)定OD600.

（3） TN去除率： 向高溫滅菌的DTM液體培養(yǎng)基中加入30顆固定化顆粒， 于120 r/min、30℃搖床中培養(yǎng)48 h， 測(cè)定TN去除率.

1.4 固定化顆粒環(huán)境因子耐受性分析

向100 mL滅菌DTM液體培養(yǎng)基（以NH4Cl為唯一氮源， 碳氮比為8）中加入30顆固定化顆粒，并放入恒溫?fù)u床中進(jìn)行培養(yǎng). 實(shí)驗(yàn)中設(shè)置不同的搖床轉(zhuǎn)速（0、30、60、90、120 r/min）、不同的實(shí)驗(yàn)溫度（10、15、20、25、30℃）、不同的實(shí)驗(yàn)pH值（5、6、7、9、11）. 考察48 h后， TN、NH4+-N、NO3–-N、NO2–-N的濃度變化、細(xì)菌生長(zhǎng)情況和顆粒破裂情況， 進(jìn)一步探究固定化顆粒對(duì)環(huán)境因子的耐受性.

1.5 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)分析

OD600由紫外分光光度法測(cè)定， TN采用堿式過(guò)硫酸鉀消解紫外分光光度法， NH4+-N采用納氏試劑法， NO3–-N采用紫外分光光度法， NO2–-N采用N-（1-萘基）-乙二胺光度法測(cè)定.

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化載體配比優(yōu)化

為了確定固定化載體質(zhì)量分?jǐn)?shù)的范圍， 首先進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)表1）. 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果， 最終設(shè)置參數(shù)： PVA 濃度為8%、9%、10%， SA濃度為0.4%、0.6%、0.8%， 稻殼粉為0 g、0.5 g、1 g， 菌液量為5 mL、10 mL、15 mL， 進(jìn)行正交試驗(yàn)， 以TN去除率作為響應(yīng)值. 固定化載體配比優(yōu)化正交試驗(yàn)見(jiàn)表2，其中因素A為PVA（%），因素B為SA（%），因素C為稻殼粉（g），因素D為菌液（mL）. 由表3實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，， 最優(yōu)配比組合為8%的PVA、0.6%的SA、0.5 g的稻殼粉和10 mL的菌液， TN去除率為79.02%.而根據(jù)極差結(jié)果顯示當(dāng)配比組合為8%的PVA、0.6%的SA、0.5 g的稻殼粉和5 mL的菌液時(shí)， TN去除率最高. 但是實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 理論最佳配比組合的TN去除率為77.81%， 小于以TN去除率為基準(zhǔn)的最佳配比組合. 因此， 實(shí)驗(yàn)最終以8%的PVA、0.6%的SA、0.5 g的稻殼粉和10 mL的菌液為最佳載體配比. 此外， 由極差（R）分析可知， 4個(gè)因素對(duì)TN去除率的貢獻(xiàn)程度為稻殼粉 > PVA > SA >菌液， 說(shuō)明碳源是好氧反硝化過(guò)程中最重要的影響因素.

2.2 固定化顆粒性能評(píng)價(jià)

2.2.1 穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

穩(wěn)定性是固定化效果的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)之一. 固定化顆粒需具有一定的機(jī)械強(qiáng)度以抵抗外界環(huán)境的沖擊， 保護(hù)體內(nèi)微生物不被破壞， 維持較高的微生物濃度， 提高其重復(fù)利用率. 因此， 對(duì)固定化顆粒進(jìn)行48 h的高速（120 r/min）機(jī)械強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)， 通過(guò)肉眼觀察結(jié)果表明， 實(shí)驗(yàn)組中30顆固定化顆粒的外觀未出現(xiàn)破裂、變形現(xiàn)象. 通過(guò)游標(biāo)卡尺測(cè)量顆粒平均直徑發(fā)現(xiàn)， 實(shí)驗(yàn)前和實(shí)驗(yàn)后的30顆固定化顆粒平均直徑并未發(fā)生明顯增大現(xiàn)象. 用玻璃片夾住小球進(jìn)行按壓， 發(fā)現(xiàn)顆粒仍具有與新鮮顆粒相同的彈性. 綜上所述， 固定化顆粒具有良好的穩(wěn)定性和一定的機(jī)械強(qiáng)度.

2.2.2 傳質(zhì)性能評(píng)價(jià)

固定化顆粒的傳質(zhì)性能直接影響顆粒內(nèi)外部的物質(zhì)交換， 從而影響微生物活性和污染物的去除速率. 將顆粒和1 mL菌液分別接種于液體培養(yǎng)基中， 置于恒溫?fù)u床進(jìn)行實(shí)驗(yàn)， 通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)中OD600值的大小分析顆粒的傳質(zhì)性能. 48 h后測(cè)得顆粒組OD600值為0.121， 而游離菌組OD600值為0.116. 說(shuō)明顆粒不僅具有良好的傳質(zhì)性能， 同時(shí)還能促進(jìn)微生物的生長(zhǎng).

2.2.3 TN去除率評(píng)價(jià)

提高固定化顆粒的脫氮效率是對(duì)微生物進(jìn)行固定化最重要的原因， 因此將顆粒移至液體DTM培養(yǎng)基中進(jìn)行實(shí)驗(yàn). 3組平行樣中顆粒均未破裂， 且菌液OD600值分別為0.123、0.118、0.107， TN的去除率分別為90.59%、89.37%、88.16% （平均值為89.37%）， 比未固定化的游離菌脫氮效率（76.73%）高12.64%. 將上述3組顆粒再進(jìn)行相同實(shí)驗(yàn)， 菌液OD600值分別為0.108、0.089、0.101， TN的去除率分別為91.08%、90.12%、89.35% （平均值為90.18%）， 比游離菌脫氮效率高13.45%. 以上實(shí)驗(yàn)說(shuō)明， 固定化顆粒不僅具有良好的脫氮能力， 還具有重要的重復(fù)利用率， 具有很大的應(yīng)用潛力.

2.3 固定化顆粒的環(huán)境因子耐受性分析

環(huán)境因子的變化不但能影響固定化顆粒物理性能（機(jī)械強(qiáng)度、傳質(zhì)性能等）， 而且能通過(guò)影響微生物的活性、濃度來(lái)影響好氧反硝化菌脫氮效率. 因此， 有必要研究不同環(huán)境因子（轉(zhuǎn)速、溫度、pH值）下固定化顆粒的耐受性， 通過(guò)分析微生物的生長(zhǎng)、氮轉(zhuǎn)化來(lái)評(píng)價(jià)固定化顆?？箾_擊性能和對(duì)微生物的保護(hù)能力.

2.3.1 轉(zhuǎn)速耐受性分析

對(duì)于好氧反硝化菌來(lái)說(shuō)， 溶解氧濃度直接影響好氧反硝化酶活性， 從而影響反硝化速率. 因此， 在實(shí)驗(yàn)中通過(guò)提高轉(zhuǎn)速來(lái)增加液體培養(yǎng)基內(nèi)溶解氧的濃度[14-16]. 提高轉(zhuǎn)速還可以使微生物與培養(yǎng)基充分接觸， 促進(jìn)微生物的生長(zhǎng). 此外， 提高轉(zhuǎn)速還會(huì)提高固定化顆粒之間的碰撞概率， 用以考察固定化顆粒的機(jī)械強(qiáng)度. 因此， 研究固定化顆粒在不同轉(zhuǎn)速下的耐受性是十分必要的.

圖1為不同轉(zhuǎn)速對(duì)顆粒脫氮效果的影響。由圖可知， TN去除率和NH4+-N去除率隨著轉(zhuǎn)速的增大而增大. 當(dāng)轉(zhuǎn)速為120 r/min時(shí)TN去除率和NH4+-N去除率最高， 分別為91.29%和93.30%. 但轉(zhuǎn)速增大到150 r/min時(shí)， TN去除率略有下降. 這可能是因?yàn)椋?①當(dāng)轉(zhuǎn)速較大時(shí)， 顆粒間碰撞機(jī)率增大，產(chǎn)生較大的摩擦力， 影響顆粒穩(wěn)定性， 導(dǎo)致TN去除率降低; ②過(guò)快的轉(zhuǎn)速會(huì)使細(xì)胞相互碰撞、破碎，細(xì)胞胞內(nèi)氮溢出， 導(dǎo)致TN去除率下降. 此外， 實(shí)驗(yàn)中硝化作用不明顯， NO3–-N和NO2–-N幾乎沒(méi)有積累. 當(dāng)轉(zhuǎn)速為0時(shí)， OD600值為0.003， 微生物幾乎不生長(zhǎng). 當(dāng)轉(zhuǎn)速提高到60 r/min時(shí)， 菌液OD600值最大（0.134）， 可能是因?yàn)榇藭r(shí)產(chǎn)生的溶解氧適合LHJ-1混合菌群中的兼性反硝化菌生長(zhǎng).

2.3.2 溫度耐受性分析

微生物的新陳代謝速率是由體內(nèi)的酶活性決定的， 而酶活性與外界的溫度息息相關(guān)， 溫度過(guò)低或者過(guò)高， 都會(huì)抑制酶活性[17-19]. 圖2為不同溫度對(duì)顆粒脫氮效果的影響。由圖2可知， 隨著溫度的增大， TN和NH4+-N去除率也隨之增大. 當(dāng)溫度小于20℃時(shí)， 細(xì)菌幾乎不生長(zhǎng)， TN去除率均在20%左右;硝化作用也不明顯， NO3–-N和NO2–-N積累較少. 說(shuō)明過(guò)低的溫度會(huì)抑制微生物的酶活性. 當(dāng)溫度為25℃時(shí)， OD600值增長(zhǎng)到0.098， TN和NH4+-N去除率分別達(dá)到77.40%和65.55%. 當(dāng)溫度為30℃時(shí)， TN和NH4+-N去除率分別可達(dá)90.59%和92.86%. 與游離菌相比， TN去除率提高約10%， 可能是固定顆粒中的稻殼粉為微生物生長(zhǎng)提供了額外的碳源[13].

2.3.3 pH耐受性分析

圖3為不同pH值對(duì)顆粒脫氮效果的影響。從圖3可以看出， 當(dāng)pH值為5時(shí)， 菌液OD600值最小0.003， 細(xì)菌幾乎不生長(zhǎng)， TN和NH4+-N去除率也低. 可能是因?yàn)檫^(guò)低的pH環(huán)境會(huì)導(dǎo)致微生物的核酸和表面蛋白發(fā)生水解， 影響微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收， 抑制微生物新陳代謝[20-21]. 此外， 實(shí)驗(yàn)中觀察到固定化顆粒發(fā)生自溶， 這會(huì)對(duì)微生物的保護(hù)作用減弱， 導(dǎo)致脫氮效率偏低. 當(dāng)pH值為6時(shí)， 固定化菌群表現(xiàn)出較高的脫氮效率， TN和NH4+-N去除率分別為84.00%和85.55%; 說(shuō)明微生物能夠很好地利用外部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖， 也說(shuō)明固定化載體對(duì)低pH環(huán)境起到緩沖作用. 當(dāng)pH值超過(guò)7時(shí)， TN去除率隨pH值增大而增大， 且均超過(guò)90%. 說(shuō)明好氧反硝化菌對(duì)中堿性環(huán)境有較好的適應(yīng)性且具有高效的脫氮性能[22]. pH值為7時(shí)， NO3–-N積累濃度為1.97 mg/L， 但是隨著pH值增大， NO3–-N積累濃度不明顯. 原因可能是硝化作用是一個(gè)產(chǎn)酸過(guò)程， 當(dāng)溶液為弱堿性時(shí)， 能中和產(chǎn)生的H+， 加速硝化作用的進(jìn)行.

3 結(jié) 論

利用交聯(lián)法固定微生物不僅可以避免微生物流失， 還可以提高微生物的穩(wěn)定性和處理效能， 但是交聯(lián)材料價(jià)格昂貴、孔隙率低、傳質(zhì)性能低等缺點(diǎn)是其難以應(yīng)用的主要原因. 本研究將農(nóng)林廢棄物與交聯(lián)法結(jié)合， 不僅可以發(fā)揮傳統(tǒng)固定化材料的優(yōu)點(diǎn)， 還可以降低生產(chǎn)成本、提供碳源、提高材料孔隙率、提升微生物耐惡劣環(huán)境沖擊能力等.

本文通過(guò)將PVA、SA、稻殼粉以及菌液進(jìn)行優(yōu)化配比作為好氧反硝化菌載體材料， 以期獲得的固定化顆粒具有一定的穩(wěn)定性、傳質(zhì)性和環(huán)境耐受性， 具體結(jié)果如下.

（1）利用正交試驗(yàn)分析可知， 實(shí)際最佳載體配比為8%的PVA、0.6%的SA、0.5 g的稻殼粉以及10 mL菌液， TN去除率為79.02%， 且固定化顆粒具有良好的穩(wěn)定性、傳質(zhì)性和較高的脫氮效率.

（2）固定化顆粒的脫氮效率隨轉(zhuǎn)速和溫度的增大而增大， 120 r/min時(shí)TN去除率達(dá)到最大（91.29%）; 固定化顆粒受溫度影響較大， 隨著溫度的升高， 脫氮效率明顯提高， 溫度為30℃時(shí)， TN和NH4+-N去除率分別可達(dá)90.59%和92.86%. 此外， 固定化顆粒酸度耐受性提高， 當(dāng)pH值為6時(shí)， TN和NH4+-N去除率分別為84.00%和85.55%. 因此， 固定化顆粒能夠耐酸， 但是不耐低溫. 此外， 溶解氧濃度也是影響其效率的因素之一.

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（責(zé)任編輯： 張 晶）