高效液相色譜法測定肉制品中胭脂紅的不確定度評定

周秀娟

摘 要：依據(jù)《肉制品 胭脂紅著色劑測定》（GB/T 9695.8—2008）建立數(shù)學模型，結合《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）評價測定過程產(chǎn)生的不確定度。經(jīng)分析，標準溶液定值、標準曲線的配制、重復性檢測、加標回收產(chǎn)生的不確定較大，而定容體積、稱量樣品引入的不確定度相對較小。

關鍵詞：高效液相色譜法;肉制品;胭脂紅;不確定度

胭脂紅，又名食用赤色102號，為水溶性偶氮類人工合成著色劑。作為食品色素，胭脂紅可用于果汁飲料、配制酒、碳酸飲料和糖果等食品的著色，而肉干、肉脯制品、水產(chǎn)品等食品中是不允許添加的，但胭脂紅在食品中過量添加或違規(guī)添加的食品安全事件時有發(fā)生，嚴重威脅著消費者的身體健康與安全。本文參考國家標準《肉制品 胭脂紅著色劑測定》（GB/T 9695.6—2008）[1] HPLC法，對肉制品中胭脂紅測定結果的不確定度進行評定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品為市場購買腌臘肉。胭脂紅標準品（濃度為0.5 mg/mL，中國計量科學研究院）、水（二級水）、甲醇（色譜純）、甲酸、石油醚、無水乙醇、鎢酸鈉、檸檬酸和乙酸銨。

1.2 儀器與設備

1260高效液相色譜儀（二極管陣列檢測器）、色譜柱、精密天平、恒溫水浴鍋、聚酰胺小柱和超聲波清洗機。

1.3 分析方法

整個檢測過程均在（205）℃環(huán)境條件下進行。

1.3.1 前處理過程

采用萬分之一天平稱取5.0 g肉制品樣品，置于50 mL離心管中，加30 mL石油醚，攪拌、靜置，棄去石油醚，去除脂肪。加無水乙醇+氨水+水，溶液提取胭脂紅，收集提取液于250 mL錐形瓶中，70 ℃水浴濃縮至約10 mL，加入1 mL硫酸溶液和1 mL鎢酸鈉溶液，混勻，繼續(xù)70 ℃水浴5 min，取上清液全部過聚酰胺小柱，用約15 mL甲醇-甲酸水淋洗，最后用15 mL無水乙醇+氨水+水洗脫，收集洗脫液，氮吹至近干，用水定容至10 mL，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，用高校液相色譜檢測。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：甲醇和0.02 mol/L乙酸銨溶液，梯度洗脫;流速1.0 mL/min;柱溫35 ℃;檢測波長508 nm;進樣量20 μL。

1.3.3 標準溶液的配制過程

（1）50 μg/mL標準溶液的配制。用1 mL的分度吸量管流出式（A級）從0.5 mg/mL的標準儲備液中移取1 mL于10 mL的單標線容量瓶（A級）中，用水定容至刻度。

（2）配制標準系列溶液，濃度分別為0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、3.0 μg/mL、5.0 μg/mL和8.0 μg/mL。①8.0 μg/mL標準溶液配制。用1 mL分度吸量管從50 μg/mL的標準儲備液中移取0.8 mL于5 mL容量瓶中，用水定容。②5.0 μg/mL標準溶液配制。用1 mL分度吸量管從50 μg/mL的標準儲備液中移取1 mL于10 mL容量瓶中，用水定容。③0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、3.0 μg/mL標準溶液配制。用1 mL分度吸量管從5 μg/mL標準溶液中分別移取0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL于4個1 mL容量瓶中，用水定容。

1.3.4 重復測定與加標回收率

按照1.3中前處理方法和色譜條件。取一陽性樣品，在重復性條件測定6次，取平均值為最終檢測結果;采用陰性樣品添加濃度為3 μg/mL進行回收率試驗，測定6次計算其回收率。

2 數(shù)學模型

試樣中胭脂紅含量的數(shù)學模型為：

（1）

式（1）中，x-試樣中胭脂紅的含量，單位mg/kg;c-從標準工作曲線計算得到的試樣溶液中胭脂紅的濃度，單位μg/mL;v-待測樣液最終定容體積，單位mL;m-待測樣品質量，單位g;-加標回收率校正因子。

3 不確定度來源分析

從測定過程和數(shù)學模型分析，胭脂紅含量測定的不確定度來源有：①標準溶液引入的不確定度urel（c）;②樣品稱樣量引入的不確定度urel（m）;③樣品最終定容體積引入的不確定度urel（v）;④樣品前處理過程產(chǎn)生的不確定度urel（x）;⑤測量回收率校正因子引入的不確定度urel（R）[2]。

4 不確定度的評定

4.1 標準溶液引入的不確定度

標準溶液引入的不確定度分為標準溶液定值、標準儲備液的稀釋、標準工作曲線的配制和標準曲線擬合4個部分。

（1）標準溶液定值引入的相對標準不確定度urel（c1）。由標準物質證書提供信息得知，標液濃度為0.5 mg/mL，其相對擴展不確定度為2%（k=2），即相對標準不確定度urel（c1）=0.01。

（2）稀釋得到50 μg/mL標準儲備液引入的相對不確定度urel（c2）。該不確定度包括定容時容器的容量和環(huán)境溫度變化兩方面引入的不確定度。按照《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJF 196—2006）[3]規(guī)定的容量允許誤差，定容時玻璃器具容量誤差見表1，因溫度變化產(chǎn)生的誤差見表2。按三角分布，即。

定容過程中，實驗室環(huán)境溫度波動為±5 ℃。20 ℃時，水的膨脹系數(shù)2.1×10-4 ℃，玻璃的膨脹系數(shù)為1.5×

10-5 ℃，則：

（2）

（3）

式中：α水-水的膨脹系數(shù)，α玻璃-玻璃的膨脹系數(shù)，v20-20 ℃時誰的體積，T溫度，-水的體積差。

即

（3）標準工作曲線配制產(chǎn)生的相對標準不確定度urel（c3）。根據(jù)1.3.3配制過程中使用的一系列玻璃量具，其產(chǎn)生相對標準不確定度分量見表3和表4。

由容量誤差引入的合成相對不確定度

因環(huán)境溫度變化引入的合成相對不確定度

標準工作曲線配制產(chǎn)生的相對標準不確定度

（4）標準曲線擬合產(chǎn)生不確定度[4]urel（c4）。用最小二乘法擬合標準溶液質量濃度-峰面積曲線，分別測定6種質量濃度的胭脂紅標準液0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、

3.0 μg/mL、5.0 μg/mL和8.0 μg/mL，每種質量濃度測定2次，得到相應的峰面積A測定結果見表5。

重復測定樣品6次，將其峰面積代入線性回歸方程計算測定濃度，再根據(jù)公式（1）計算待測物含量，其由標準工作曲線擬合所引入的標準不確定度為urel（c4）。

峰面積測量的標準偏差s為：

其相對標準不確定度，p=6為樣品測定次數(shù)，本次試驗中6個濃度各測定2次，n=12，=3.3 μg/mL為標準系列溶液的平均濃度，x0=4.1 μg/mL為樣品測定液平均濃度。

標準溶液引入的相對不確定度

4.2 樣品的稱量產(chǎn)生的不確定度urel（m）

根據(jù)JJG 1036—2008，其最大允許誤差1 mg，，

則標準不確定度mg，稱樣質量為5.001 2 g，其相對標準不確定度。

4.3 樣品的最終定容體積產(chǎn)生的不確定度urel（v）

根據(jù)1.3.1中前處理方法，最終定容體積為10 mL，產(chǎn)生不確定度如下。

（1）10 mL容量瓶產(chǎn)生的最大允許誤差，0.008 16 mL，

其相對標準不確定度為

。

（2）環(huán)境溫度變化引起溶劑體積變化，玻璃容量瓶體積的變化。

Δv=v1-v20=（a水-a玻璃）×v×（T1-T2），，則相對

標準不確定度0.000 398，

。

4.4 樣品前處理過程產(chǎn)生的不確定度通過重復性檢測評

定urel（x）

該不確定度為A類不確定度，按照1.3的分析方法對同一樣品重復測定6次，測定結果見表6。

標準不確定度，其相對標準不確定度0.015 2。

4.5 加標回收率產(chǎn)生的相對標準不確定度urel（R）

按照1.3.1的前處理方法進行加標回收測定，回收率（R）測定結果見表7，該不確定度為A類不確定度。

標準不確定度=1.203，其相對標準不確定度=0.011 7。

為了確定回收率是否計入研制和含量的計算中，將回收率進行顯著性t檢驗，，

說明與1.0無顯著性差異，則計算中不需采用回收率校正因子對結果進行修正，回收率產(chǎn)生的相對標準不確定度不應納入合成不確定度的計算[5]。

4.6 擴展不確定度評定和測定結果表示

合成相對標準不確定度0.022，其標準不確定u=0.022×8.2=0.18 mg//kg，取置信水平95%，則k=2，其擴展不確定度為0.36 mg/kg，即樣品中胭脂紅含量表示為（8.2±0.36）mg/kg（k=2）。

5 結論

從對肉制品中胭脂紅測量不確定度的分析可看出，每一步操作都會產(chǎn)生測量不確定度，其中標準溶液、樣品重復性測量、加標回收引入的不確定度較大。標液的配制、稀釋、標線的配制過程中，過程越復雜、使用器具越多，最后產(chǎn)生的不確定度越大。樣品重復性測量產(chǎn)生不確定較大，可以通過關注固相萃取柱的回收率、提高樣品的均勻性及人員的操作技能減小測量結果的不確定度。

參考文獻

[1]國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.肉制品 胭脂紅著色劑測定：GB/T 9695.6—2008[S].北京：中國標準出版社，2008.

[2]楊洋，徐春祥，車文軍.高效液相色譜法測定奶粉中的三聚氰胺及其不確定度分析[J].食品科學，2010，31（4）：250-253.

[3]國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.常用玻璃量器檢定規(guī)程：JJG 196—2006[S].北京：中國計量出版社，2006.

[4]國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局.測量不確定度評定與表示：JJ F 1059.1—2012[S].北京：中國計量出版社，2012.

[5]黃坤，郭嘉.高效液相色譜-熒光法測定谷物及其制品中苯并（α）芘的不確定度評定[J].食品研究與開發(fā)，2019，40（4）：185-190.