高效液相色譜法測(cè)定拉莫三嗪片中的有關(guān)物質(zhì)

姜金生，石笑弋，劉軼*，歐陽冬生，陳俊，陳開義，胡杰（.三金集團(tuán)湖南三金制藥有限責(zé)任公司，湖南 常德 4500；.湖南省藥品檢驗(yàn)研究院（湖南藥用輔料檢驗(yàn)檢測(cè)中心），長(zhǎng)沙 4000；3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院臨床藥理研究所，長(zhǎng)沙 4000；4.復(fù)雜基質(zhì)樣本生物分析湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 40000）

拉莫三嗪（lamotrigine）是新一代的抗癲癇藥，在臨床上可單獨(dú)使用也可聯(lián)合使用治療癲癇，療效顯著，基本上沒有致畸性。臨床上拉莫三嗪還可用于雙相情感障礙的治療，安全性較好[1]。在合成拉莫三嗪原料藥中可能引入工藝雜質(zhì)，比如2，3-二氯苯甲酰氯、2，3-二氯苯甲酰氰、2，3-二氯苯甲酸（拉莫三嗪雜質(zhì)I，文中稱為雜質(zhì)B）等，在拉莫三嗪制劑儲(chǔ)存過程中可能產(chǎn)生一些降解雜質(zhì)，如2，3-二氯苯甲酸（雜質(zhì)B）、3-氨基-6-（2，3-二氯苯基）-1，2，4-三嗪-5-（4H）-酮（雜質(zhì)C）、6-（2，3-二氯苯基）-1，2，4-三嗪-3，5-（2H，4H）-二酮（雜質(zhì)E）等（見表1）。目前關(guān)于這些雜質(zhì)檢測(cè)方法的文獻(xiàn)報(bào)道不多[2-3]，且各國(guó)藥典與國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)雜質(zhì)的命名各不相同。

表1 拉莫三嗪片有關(guān)物質(zhì)Tab 1 Related impurity in lamotrigine tablets

英國(guó)藥典（BE2018）[4]與歐洲藥典（EP9.0）[5]中拉莫三嗪原料藥與片劑的檢測(cè)方法相同，均采用兩個(gè)不同的液相色譜方法分別測(cè)定拉莫三嗪的有關(guān)物質(zhì)，美國(guó)藥典（USP41）[6]對(duì)拉莫三嗪原料藥與片劑的有關(guān)物質(zhì)采用不同的液相色譜方法分別偏重于工藝雜質(zhì)與降解雜質(zhì)的檢測(cè)。黃諾哲等[7]在EP9.0 的基礎(chǔ)上，把150 mm 長(zhǎng)度的色譜柱改為250 mm 色譜柱同步改變洗脫持續(xù)時(shí)間并采用雙波長(zhǎng)的高效液相色譜方法，該方法雖能同時(shí)檢測(cè)雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D，但對(duì)BP 藥典中雜質(zhì)G 與某氧化降解雜質(zhì)的分離度不理想，工藝雜質(zhì)2，3-二氯苯甲酰氰、2，3-二氯苯甲酰氯和可能的降解雜質(zhì)E 未見檢測(cè)報(bào)道。Emami 等[8]以高效液相色譜等度洗脫的方法能同時(shí)檢測(cè)雜質(zhì)C和雜質(zhì)D，但對(duì)雜質(zhì)B、雜質(zhì)E 以及工藝雜質(zhì)等未能有效檢出。文獻(xiàn)采用以甲醇-0.5%三乙胺溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH 值至4.0）為流動(dòng)相的高效液相色譜等度洗脫法對(duì)拉莫三嗪片進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)[2-3]，與企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[9-10]一樣，由于流動(dòng)相pH 值相同，雜質(zhì)B 與拉莫三嗪主峰分離不好，雜質(zhì)D與雜質(zhì)E 出峰時(shí)間在100 min 左右，不能有效對(duì)拉莫三嗪有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。

本文在企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)YBH0245 2014[9]、WS1-（X-119）-2012Z[10]、YBH04392010[11]的基礎(chǔ)上結(jié)合國(guó)內(nèi)外拉莫三嗪相關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)以及文獻(xiàn)報(bào)道[2-7]，參照《中國(guó)藥典》2020年版四部[12]、《化學(xué)藥物質(zhì)量控制分析方法驗(yàn)證技術(shù)指導(dǎo)原則》[13]和《化學(xué)藥物雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》[14]，進(jìn)一步開發(fā)出能同時(shí)檢測(cè)可能的工藝雜質(zhì)和降解雜質(zhì)的高效液相色譜方法，并對(duì)主要控制雜質(zhì)進(jìn)行相對(duì)保留時(shí)間和校正因子研究，為拉莫三嗪原料藥與制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

MS205DU 十萬分之一電子天平（Mettler Toledo 公司）；LC-20A 島津高效液相色譜儀（日本島津公司）；PHSJ-4F pH 計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）。

1.2 試藥

拉莫三嗪片（批號(hào)：181208、181209、181210，自制）；拉莫三嗪對(duì)照品（批號(hào)：100775-201902，中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度：99.7%）；雜質(zhì)B（拉莫三嗪雜質(zhì)I）對(duì)照品（批號(hào)：510086-201401，中國(guó)食品藥品檢定研究院，供有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)用）；拉莫三嗪雜質(zhì)C 對(duì)照品（批號(hào)：F3L329，USP，供有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)用）；2，3-二氯苯甲酰氯（批號(hào)：170037，自制）；2，3-二氯苯甲酰氰（雜質(zhì)F，批號(hào)：1703007，自制）；縮合物（雜質(zhì)A1，批號(hào)：10901-1806005y，自制）；拉莫三嗪雜質(zhì)D 對(duì)照品（批號(hào)：F1H279，USP，供有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)用）；拉莫三嗪雜質(zhì)E 對(duì)照品（批號(hào)：L2011011，U.K，供有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)用）；甲醇（色譜純，TEDIA）、磷酸（色譜純）、三乙胺（色譜純）、鹽酸（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、30% 過氧化氫（分析純）（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；純化水（自制）。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱為Kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相A 為甲醇，流動(dòng)相B 為 0.5%三乙胺溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH 值至4.5），梯度洗脫（見表2）；流速為0.8 mL·min－1；檢測(cè)波長(zhǎng)為230 nm；柱溫為40℃；進(jìn)樣量為20 μL。

表2 梯度洗脫程序Tab 2 Gradient elution program

2.2 溶液配制

2.2.1 供試品溶液 取本品細(xì)粉適量（相當(dāng)于拉莫三嗪約20 mg），精密稱定，置于50 mL 量瓶中，加入稀釋液（甲醇-0.1 mol·L－1鹽酸溶液＝20∶80，V/V）適量，制成每1 mL 中約含拉莫三嗪0.4 mg 的溶液，搖勻，作為供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照溶液 精密量取供試品溶液適量，加稀釋液定量稀釋制成每1 mL 中約含拉莫三嗪0.8 μg 的溶液，作為對(duì)照溶液。

2.2.3 空白溶劑 以稀釋液作為空白溶劑。

2.2.4 對(duì)照品儲(chǔ)備溶液 分別稱取拉莫三嗪、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、雜質(zhì)D、雜質(zhì)E、雜質(zhì)A1、雜質(zhì)F 自制對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇適量溶解，再以稀釋液稀釋成適當(dāng)濃度的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

2.2.5 系統(tǒng)適用性溶液 取拉莫三嗪約10 mg，加適量6 mol·L－1氫氧化鈉溶液，置90℃加熱約1 h，用6 mol·L－1鹽酸溶液中和，再加入10 mL 雜質(zhì)B 對(duì)照品溶液（精密稱取雜質(zhì)B 對(duì)照品適量，加甲醇溶解并稀釋成 0.1 mg·mL－1）和雜質(zhì)E 對(duì)照品溶液約2 mL（精密稱取雜質(zhì)E 對(duì)照品適量，加甲醇溶解并稀釋成 0.1 mg·mL－1），用稀釋液稀釋至每1 mL 中約含拉莫三嗪0.4 mg、雜質(zhì)B 0.04 mg、雜質(zhì)E 0.008 mg 的混合溶液，作為系統(tǒng)適用性溶液。

2.3 專屬性試驗(yàn)

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取系統(tǒng)適應(yīng)性溶液及空白溶劑，空白輔料溶液按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，雜質(zhì)B、拉莫三嗪、雜質(zhì)C、雜質(zhì)E 依次出峰，分離度符合要求，拉莫三嗪理論塔板數(shù)不低于5000，雜質(zhì)B 峰相對(duì)保留時(shí)間約為0.8，與拉莫三嗪峰分離度達(dá)到1.5，相對(duì)保留時(shí)間1.0 ～2.0 的雜質(zhì)C（主要降解雜質(zhì)）的相對(duì)保留時(shí)間約為1.7，系統(tǒng)適應(yīng)性良好（見圖1）。

圖1 系統(tǒng)適應(yīng)性色譜圖Fig 1 Chromatogram of system suitability test

取雜質(zhì)A1、雜質(zhì)D、雜質(zhì)F 對(duì)照品儲(chǔ)備液用稀釋液稀釋至適當(dāng)濃度后按“2.1”項(xiàng)下條件測(cè)定，結(jié)果各雜質(zhì)出峰時(shí)間分別約為46.61、48.96、50.36 min，分離度均大于6.5，能較好地檢測(cè)分離。

2.3.2 破壞性試驗(yàn)

① 未破壞：取拉莫三嗪片（規(guī)格：50 mg，批號(hào)：181208）按“2.2.1”項(xiàng)下方法配制未破壞溶液。

② 酸、堿破壞：分別取本品粉末適量（約相當(dāng)于拉莫三嗪20 mg），精密稱定，分別加入1 mL 6 mol·L－1鹽酸溶液或6 mol·L－1氫氧化鈉溶液，90℃水浴加熱分別約3 h（酸破壞）和1 h（堿破壞），放冷至室溫，取6 mol·L－1氫氧化鈉溶液或6 mol·L－1鹽酸溶液中和，加稀釋液溶解并稀釋成每1 mL 約含拉莫三嗪0.4 mg 的溶液，濾過，取續(xù)濾液作酸、堿降解樣品溶液；稱取處方量空白輔料，同法配制，作為空白輔料降解溶液。

③ 氧化破壞：取本品粉末適量（約相當(dāng)于拉莫三嗪20 mg），精密稱定，加入30%過氧化氫溶液1 mL，90℃水浴加熱約1 h，放置室溫，加稀釋液溶解并稀釋成每1 mL 約含拉莫三嗪0.4 mg 的溶液，濾過，取續(xù)濾液作氧化降解樣品溶液；稱取處方量空白輔料，同法配制，作為空白輔料降解溶液。

④ 光照、高溫破壞：分別取本品粉末適量，分別置105℃烘烤8 h、（4500±500）Lx 強(qiáng)度下光照3 d，精密稱取細(xì)粉適量（約相當(dāng)于拉莫三嗪20 mg），加適量稀釋液溶解并稀釋成每1 mL 中約含拉莫三嗪0.4 mg 的溶液，濾過，取續(xù)濾液即得光照、高溫降解樣品溶液；稱取處方量空白輔料，同法配制，作為空白輔料降解溶液。

取上述各溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果空白輔料不干擾主成分峰、特定雜質(zhì)峰的檢測(cè)。拉莫三嗪峰與雜質(zhì)B 和雜質(zhì)C 分離較好。在高溫、光照條件下，拉莫三嗪片較穩(wěn)定，在酸、堿、氧化條件下所產(chǎn)生雜質(zhì)均能與主峰良好分離，不干擾本品有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定（見圖2）。

圖2 樣品破壞性試驗(yàn)色譜圖Fig 2 Chromatogram of sample destruction test

2.4 相對(duì)保留時(shí)間

分別精密移取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加稀釋液稀釋成每1 mL 約含雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 和拉莫三嗪均為0.5 μg 的混合液。對(duì)雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 相對(duì)拉莫三嗪的保留時(shí)間在不同色譜柱[Welch、thermo、Agela、Kromasil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]進(jìn)行研究，雜質(zhì)B 相對(duì)拉莫三嗪主峰保留時(shí)間（RRT）較穩(wěn)定，均為0.8；雜質(zhì)C 相對(duì)拉莫三嗪RRT 在1.5 ～1.7，其中Agela 色譜柱和Kromasil色譜柱的RRT 均為1.7?？紤]到不同色譜柱對(duì)雜質(zhì)C 的相對(duì)保留時(shí)間有一定的影響，對(duì)同一品牌（Kromasil）不同批次填料（色譜柱1 和色譜柱2）及不同序列號(hào)的色譜柱（色譜柱2 和色譜柱3）進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果雜質(zhì)B 和雜質(zhì)C 的相對(duì)保留時(shí)間都較穩(wěn)定，相對(duì)拉莫三嗪主峰RRT 約為0.8、1.7，同時(shí)以系統(tǒng)適應(yīng)性溶液按“2.3.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行雜質(zhì)定位與驗(yàn)證。

2.5 線性關(guān)系與校正因子

根據(jù)“2.4”項(xiàng)下不同色譜柱考察結(jié)果，以Kromasil 色譜柱考察雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 的校正因子。分別精密移取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，稀釋成一系列濃度的混合對(duì)照品溶液，取3 根不同色譜柱按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果雜質(zhì)B、雜質(zhì)C與拉莫三嗪質(zhì)量濃度在0.5 ～5 μg·mL－1與峰面積呈較好的線性關(guān)系，計(jì)算拉莫三嗪相對(duì)于雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 的校正因子F（F＝K雜質(zhì)線性斜率/K拉莫三嗪線性斜率），結(jié)果雜質(zhì)B 的平均校正因子為2.7，雜質(zhì)C 的平均校正因子為1.4，結(jié)果見表3。

表3 雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 和拉莫三嗪線性關(guān)系考察結(jié)果Tab 3 Linearity of impurity B，impurity C and lamotrigine

2.6 定量限和檢測(cè)限

取“2.2.4”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，精密移取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，再用稀釋液稀釋成適當(dāng)濃度的對(duì)照品溶液，照“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣。以信噪比（S/N）＝3 為檢測(cè)限，以S/N＝10 為定量限，結(jié)果拉莫三嗪、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 的定量限分別為3.9、9.1、10.6 ng；檢測(cè)限分別為1.3、2.7、3.3 ng。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下供試品溶液和對(duì)照溶液于室溫下放置，另取雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 對(duì)照品適量，精密稱定，加適量甲醇溶解并用稀釋液稀釋成每1 mL 約含0.8 μg 雜質(zhì)B 和2 μg 雜質(zhì)C 的混合溶液，于室溫下放置。供試品溶液于0、2、4.5、7、9.5、14、17.5、26 h 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣；對(duì)照溶液于0、2、4.5、7、9.5、17.5、23.5、26 h 分別進(jìn)樣測(cè)定，雜質(zhì)B 和雜質(zhì)C 的混合溶液于0、2、4.5、6、8、10.5、13、19.5 h 分別進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果供試品溶液、對(duì)照溶液放置26 h，拉莫三嗪峰面積RSD分別為0.050%、1.7%，穩(wěn)定性均較好。雜質(zhì)B、雜質(zhì)C 溶液放置19.5 h，峰面積RSD分別為0.90%、0.60%，穩(wěn)定性均較好。

2.8 精密度與準(zhǔn)確度

2.8.1 精密度試驗(yàn) 按“2.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液和對(duì)照溶液各 6 份，另取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液適量，分別加稀釋液稀釋成每1 mL 含雜質(zhì)B 約0.8 μg、雜質(zhì)C 約2 μg 的對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果供試品溶液拉莫三嗪、對(duì)照溶液拉莫三嗪、對(duì)照品溶液中雜質(zhì)B 和雜質(zhì)C 的保留時(shí)間和峰面積RSD均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.8.2 中間精密度試驗(yàn) 由不同操作人員在不同時(shí)間和不同儀器分別按“2.8.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，結(jié)果各成分峰面積RSD均小于2.0%，表明本法的中間精密度較好。

2.8.3 雜質(zhì)回收試驗(yàn)與重復(fù)性 稱取9 份拉莫三嗪片細(xì)粉（約相當(dāng)于拉莫三嗪20 mg），置50 mL量瓶中，加適量稀釋液溶解，再分別加每1 mL含雜質(zhì)B 約 0.8 μg，雜質(zhì)C 約2 μg 的對(duì)照品溶液1、2、3 mL（相當(dāng)于雜質(zhì)對(duì)照品溶液濃度的50%、100%、150%），各3 份，加入稀釋液稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算回收率并考察方法的重復(fù)性，結(jié)果各已知雜質(zhì)回收率均滿足0.1%雜質(zhì)限度的回收率范圍（90%～108%），回收率及重復(fù)性RSD均在5%以內(nèi)，說明該方法的準(zhǔn)確度及重復(fù)性較好。

2.9 耐用性試驗(yàn)

2.9.1 相對(duì)保留時(shí)間耐用性 取每1 mL 含雜質(zhì)B約0.8 μg、雜質(zhì)C 約2 μg、雜質(zhì)E 0.4 μg 的對(duì)照品溶液，對(duì)流動(dòng)相比例、柱溫、流速、鹽濃度、pH 值、色譜柱進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，考察方法的耐用性。結(jié)果表明主峰和各雜質(zhì)峰均能達(dá)到良好的分離效果；雜質(zhì)C 的相對(duì)保留時(shí)間主要受流動(dòng)相的比例、柱溫、流動(dòng)相pH 值的影響，雜質(zhì)B 的相對(duì)保留時(shí)間受的影響均較少。從耐用性試驗(yàn)的數(shù)據(jù)看，雜質(zhì)B 和雜質(zhì)C 的相對(duì)保留時(shí)間均較穩(wěn)定，結(jié)果見表4。

表4 耐用性試驗(yàn)結(jié)果匯總Tab 4 Summary of durability test

2.9.2 校正因子重現(xiàn)性 在確定好雜質(zhì)B 和雜質(zhì)C相對(duì)保留時(shí)間的基礎(chǔ)上進(jìn)行了校正因子的研究。對(duì)比了3 個(gè)實(shí)驗(yàn)室的方法學(xué)驗(yàn)證與校正因子復(fù)核數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在擬定的液相色譜條件下，流動(dòng)相種類和初始比例、檢測(cè)波長(zhǎng)、鹽濃度、經(jīng)系統(tǒng)適應(yīng)性溶液驗(yàn)證后的儀器狀態(tài)和色譜柱對(duì)校正因子的賦值沒有明顯影響，該方法的校正因子重現(xiàn)性主要受流動(dòng)相pH 值以及實(shí)驗(yàn)員稱量對(duì)照品的細(xì)微偏差的影響，但各實(shí)驗(yàn)室計(jì)算所得的校正因子數(shù)值均未高于本方法擬定的值，數(shù)據(jù)顯示雜質(zhì)B 和雜質(zhì)C 校正因子在流動(dòng)相pH 值4.45 ～4.55 內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定。

2.10 有關(guān)物質(zhì)的檢查

照“2.1”項(xiàng)下方法，對(duì)3 批拉莫三嗪片長(zhǎng)期穩(wěn)定性（22 個(gè)月）考察樣品進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定，按“2.2”項(xiàng)下方法配制供試品溶液、對(duì)照溶液、空白溶液進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各雜質(zhì)的含量、其他單個(gè)雜質(zhì)的含量和雜質(zhì)總量。結(jié)果3 批樣品的雜質(zhì)檢查均符合規(guī)定，見表5。

表5 拉莫三嗪片中有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果(%，校正因子法)Tab 5 Determination of related substances in lamotrigine tablets(%，calibration factor method)

3 討論

3.1 流動(dòng)相pH 值的考察

前期研究中發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相為甲醇-0.5%三乙胺溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH 值至3.0 ～5.0）時(shí)，拉莫三嗪與雜質(zhì)B 分離度隨流動(dòng)相pH 值增加而增大，流動(dòng)相調(diào)節(jié)pH 值至4.2 ～5.0 時(shí)拉莫三嗪與雜質(zhì)B的分離度在5.61 ～13.08，本文選擇pH 4.5 作為本方法流動(dòng)相pH 值，能有效分離拉莫三嗪主峰與雜質(zhì)B，且該pH 值條件下色譜柱的耐受性較好。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的考察

通過對(duì)氧化降解樣品進(jìn)行DAD 全波長(zhǎng)掃描，發(fā)現(xiàn)在230 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)的雜質(zhì)個(gè)數(shù)較多且基線平穩(wěn)，結(jié)合各已知雜質(zhì)的紫外掃描圖，優(yōu)選230 nm 作為本品有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 破壞試驗(yàn)方法的考察

拉莫三嗪在常規(guī)的高溫、光照條件下，未見明顯的雜質(zhì)產(chǎn)生，說明拉莫三嗪在常規(guī)環(huán)境中相對(duì)較穩(wěn)定。拉莫三嗪在加酸或堿的同時(shí)置90℃水浴中高溫破壞，能生成雜質(zhì)C 和少量的雜質(zhì)E，氧化降解雖然能夠同時(shí)產(chǎn)生雜質(zhì)C、雜質(zhì)B和少量的雜質(zhì)E，但產(chǎn)生雜質(zhì)C、雜質(zhì)B 的量較少且氧化降解的產(chǎn)物復(fù)雜。本研究中以拉莫三嗪10 mg 加6 mol·L－1NaOH 溶液1 ～5 mL 置90 ℃水浴30 ～90 min 降解產(chǎn)生雜質(zhì)C，放冷后用6 mol·L－1HCl 溶液中和，并加雜質(zhì)B 對(duì)照品溶液的方法來制備系統(tǒng)適用性溶液，從而節(jié)省了從國(guó)外購(gòu)買雜質(zhì)C 的時(shí)間和成本。該系統(tǒng)適用性溶液可用于雜質(zhì)B 和雜質(zhì)C 相對(duì)保留時(shí)間的驗(yàn)證，進(jìn)而用于拉莫三嗪原料藥和制劑的有關(guān)物質(zhì)分析。黃諾哲等[7]取拉莫三嗪加30%過氧化氫溶液3 mL 在80 ℃水浴15 min，色譜圖顯示可能氧化降解產(chǎn)生了少量的雜質(zhì)D，本研究取拉莫三嗪加30%過氧化氫溶液1 mL 在90 ℃水浴1 h，在約49 min 雜質(zhì)D 出峰處未見明顯出峰或低于檢測(cè)限，而在約37 min 處檢出了少量的雜質(zhì)E。本研究與文獻(xiàn)報(bào)道不同[7]，可能是由于氧化降解試驗(yàn)方法或者液相色譜檢測(cè)方法不同引起的。

3.4 雜質(zhì)含量的限定

拉莫三嗪片長(zhǎng)期穩(wěn)定性樣品的檢測(cè)數(shù)據(jù)顯示雜質(zhì)C 有增長(zhǎng)趨勢(shì)，從0 個(gè)月時(shí)的未檢出到22 個(gè)月時(shí)檢出0.01%，但未檢出雜質(zhì)E，最大單雜0.05%，總雜質(zhì)0.06%，均符合企業(yè)制訂的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和國(guó)外藥典標(biāo)準(zhǔn)，即雜質(zhì)B（相對(duì)保留時(shí)間約0.8）按校正后的峰面積計(jì)算（乘以校正因子2.7），不得大于對(duì)照溶液主峰面積（0.2%）；雜質(zhì)C（相對(duì)保留時(shí)間約1.7）按校正后的峰面積計(jì)算（乘以校正因子1.4），不得大于對(duì)照溶液主峰面積的2.5 倍（0.5%）；其他單個(gè)雜質(zhì)峰面積不得大于對(duì)照溶液主峰面積（0.2%）；各雜質(zhì)峰面積的和按校正后的峰面積計(jì)算不得大于對(duì)照溶液主峰面積的3.75 倍（0.75%）。

3.5 本研究的不足

本試驗(yàn)中氧化降解還產(chǎn)生了4 個(gè)未知雜質(zhì)，文獻(xiàn)報(bào)道[7]氧化降解未知雜質(zhì)，可能是3，5-二氨基-6-（2，3-二氯苯基）-2-氧基-1，2，4-三嗪或3，5-二氨基-6-（2，3-二氯苯基）-4-氧基-1，2，4-三嗪。本方法分離檢測(cè)到的4 個(gè)未知氧化降解雜質(zhì)有待進(jìn)一步的LC-MS/MS 結(jié)構(gòu)確證。拉莫三嗪雖然在60 ℃以內(nèi)的條件下仍較穩(wěn)定[7]，但在加強(qiáng)酸或強(qiáng)堿或30%雙氧水情況下并90 ℃水浴破壞試驗(yàn)中，可產(chǎn)生少量的雜質(zhì)E，考慮到該雜質(zhì)有降解途徑，后續(xù)將對(duì)雜質(zhì)E 進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂的研究。此外，基于企業(yè)生產(chǎn)檢驗(yàn)實(shí)際考慮，本研究未對(duì)影響雜質(zhì)B 和雜質(zhì)C 相對(duì)保留時(shí)間和校正因子的流動(dòng)相比例、柱溫、流動(dòng)相pH 值進(jìn)行更廣泛、更深入的耐用性與驗(yàn)證研究。

3.6 小結(jié)

綜上所述，本方法專屬性強(qiáng)，能有效分離和檢測(cè)樣品中可能的工藝雜質(zhì)和降解雜質(zhì)，采用相對(duì)保留時(shí)間和校正因子來定量相關(guān)雜質(zhì)，可應(yīng)用于拉莫三嗪片和拉莫三嗪原料藥中有關(guān)物質(zhì)的質(zhì)量控制。