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    牛蒡根提取物指紋圖譜研究

    2021-09-04 07:22:00吳瓊馬群胡北崔亞玲何靜王卓許子華北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院沈陽110016
    中南藥學(xué) 2021年8期
    關(guān)鍵詞:牛蒡產(chǎn)地指紋

    吳瓊,馬群,胡北,崔亞玲,何靜,王卓,許子華(北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院,沈陽 110016)

    牛蒡根,又稱惡實根,為菊科牛蒡?qū)僦参锱]駻rctium lappaL.的肉質(zhì)直根,牛蒡主要分布于廣西、山東、安徽、遼寧、湖北、浙江等地,有去熱、消腫的功效[1],常用于感冒、頭痛、咳嗽、咽喉腫痛等疾病。中藥是以多組分多靶點的作用方式對機體代謝網(wǎng)絡(luò)綜合作用而產(chǎn)生結(jié)果,因此用中藥的指紋圖譜來結(jié)合指標(biāo)成分含量對中藥材進行質(zhì)量控制,既可量化、綜合性地闡述中藥的特征,又可以彌補單一有效成分定量控制模式的缺陷[2]。中藥成分復(fù)雜,分離和測定均有一定的難度,因此能否選擇主要的藥物成分進行準(zhǔn)確的分析,直接關(guān)系到對于該中藥質(zhì)量的評價[3]。并且考慮到實際應(yīng)用的情況,成分是否可測又是指標(biāo)成分選擇的前提[4]。近年來,隨著多種多樣的儀器分析技術(shù)的出現(xiàn),以及其在天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)鑒定中的應(yīng)用,牛蒡根中發(fā)現(xiàn)了越來越多的綠原酸類化合物[5],目前主要發(fā)現(xiàn)的已分離出來的化合物有1,5-二咖啡酰-3-蘋果??崴?、3,5-二咖啡酰-1-(2-咖啡酰-4-蘋果酰甲酯)-奎尼酸、3,5-二咖啡酰-1-(2-咖啡酰-4-蘋果酰)-奎尼酸等[6]。有藥理學(xué)研究表明,該類化合物具有明顯的神經(jīng)保護、抗癌、抗菌、抗氧化、降血脂及免疫調(diào)節(jié)等作用[7-14]。筆者通過文獻檢索發(fā)現(xiàn),目前對牛蒡根藥材質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)研究尚不完整,對其化學(xué)成分的測定方法和指紋圖譜研究尚淺。

    中藥指紋圖譜是一種綜合的、宏觀的、可量化的手段,可反映中藥化學(xué)成分的整體組成和特征。為進一步完善牛蒡根藥材質(zhì)量評價體系,本研究參考相關(guān)文獻[15-16],采用高效液相色譜(HPLC)法建立了14 批牛蒡根藥材的HPLC 指紋圖譜,得到能夠標(biāo)示其特性的共有色譜峰圖譜,為牛蒡根藥材的應(yīng)用及其內(nèi)在質(zhì)量的均一性提供全面的質(zhì)量控制依據(jù)。

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器

    島津LC-16 系列高效液相色譜儀(SPD-16型紫外檢測器、LC-16 型泵、SIL-16 型進樣器、CTO-16 型柱溫箱)(日本島津儀器有限公司);Shimadzu AUW 120 D 十萬分之一分析天平(日本Shimadzu 公司);2012 版中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(國家藥典委員會);KQ3200 型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司,150 W,40 kHz);Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)(安捷倫)。

    1.2 試藥

    3,5-二咖啡??鼘幩釋φ掌罚℉PLC 純度,四川省維克奇生物科技有限公司,批號:wkq20020403,純度≥98%);甲醇、乙腈(色譜純,Sigma 公司);磷酸(分析級,天津永大化學(xué)試劑有限公司);95%乙醇(美華公司,沈陽市遼河化工廠);雙蒸水為自制。

    14 批牛蒡根藥材,產(chǎn)地分別為遼寧、山東、安徽、浙江、江西、吉林、廣西、河北、湖北。將各產(chǎn)地編號為S1 ~S14,其中,S1(批號:191115)、S2(批號:191001)產(chǎn)地為安徽;S3(批號:191026)、S4(批號:20191103)產(chǎn)地為廣西;S5(批號:191225)產(chǎn)地為河北;S6(批號:191101)、S7(批號:191201)產(chǎn)地為湖北;S8(批號:191210)產(chǎn)地為吉林;S9(批號:191210)產(chǎn)地為江西;S10(批號:20200326)產(chǎn)地為遼寧;S11(批號:200301)、S12(批號:200115)、S13(批號:200322)產(chǎn)地為山東;S14(批號:200325)產(chǎn)地為浙江。藥材購于遼寧九州通醫(yī)藥有限公司、亳州三峰中藥飲片有限公司。經(jīng)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥檢室何靜副主任藥師鑒定為菊科植物牛蒡Arctium lappaL.的干燥塊根。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 HPLC 色譜條件

    色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為0.4%磷酸水溶液(A)-乙腈(B),梯度洗脫(0 ~25 min,10%→15%B;25 ~35 min,15%→20%B,35 ~60 min,20%→30%B);流速1.0 mL·min-1;檢測波長330 nm;柱溫35℃;檢測時間為60 min;進樣量:10 μL。

    2.2 溶液的制備

    2.2.1 對照品溶液的制備 取適量3,5-二咖啡??鼘幩釋φ掌罚芊Q定,置于棕色量瓶中,加入少量甲醇,振搖使溶解,后加甲醇定容至刻度,制成每1 mL 含有3,5-二咖啡??鼘幩?5 μg 的溶液,即得對照品溶液。

    2.2.2 牛蒡根提取物的制備 稱取各產(chǎn)地的牛蒡根藥材適量置于圓底燒瓶中,加入10 倍量55%乙醇溶液浸泡過夜,次日回流提取,每次2 h,共2 次,合并提取液并過濾,分產(chǎn)地合并提取液。將各產(chǎn)地的提取液分別加熱濃縮至含藥材1 g·mL-1,4 ℃冰箱保存。

    2.2.3 供試品溶液的制備 取濃縮后的提取液4 mL,置10 mL 棕色量瓶中,加入甲醇定容,靜置24 h,取上清液,經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,即得。

    2.3 指紋圖譜

    2.3.1 精密度試驗 取牛蒡根提取物(S6)樣品溶液,按照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6 次,記錄色譜圖,將圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價體系》(2012 版),計算相似度,相似度均為1.000。以6 號峰的保留時間(tR)和峰面積(A)為參照,計算得其他各共有峰相對于6 號峰的tR和A,結(jié)果顯示指紋圖譜中11 個共有峰的相對保留時間、相對峰面積的RSD值分別小于0.24%、3.7%,表明儀器精密度良好。

    2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取牛蒡根提取物(S6)樣品溶液,按照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液,分別在0、2、4、8、12、24 h 進樣,按“2.1”項下色譜條件記錄色譜圖。將其導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價體系》(2012 版),得到各個樣品的相似度,結(jié)果顯示相似度均大于0.999。以6 號峰的相對保留時間(tR)和相對峰面積(A)為參照,計算得其他各共有峰相對于6 號峰的tR和A的RSD值分別小于0.32%、5.5%,表明牛蒡根提取物供試品溶液在常溫下24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.3.3 重復(fù)性試驗 取牛蒡根提取物(S6)樣品溶液,按照“2.2.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液,按“2.1”項下色譜條件進樣,記錄色譜圖。將圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價體系》(2012 版),得到各個樣品的相似度,結(jié)果顯示均大于0.999,以6 號峰的相對保留時間(tR)和相對峰面積(A)為參照,計算得其他各共有峰相對于6 號峰的tR和A的RSD分別小于0.090%、5.0%,表明該種分析方法的重復(fù)性良好。

    2.3.4 指紋圖譜建立 取14 批不同產(chǎn)地的藥材,按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液,根據(jù)“2.1”項下色譜條件進樣測定,記錄HPLC 色譜圖,樣品的色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2012 版)軟件進行分析,以中位數(shù)法生成對照圖譜,時間窗寬度為0.1 min,經(jīng)多點校正、自動匹配后生成牛蒡根提取物指紋圖譜的共有模式如圖1,對照指紋圖譜見圖2。

    圖1 14 批次牛蒡根提取物的指紋圖譜Fig 1 HPLC fingerprints of 14 batches of Arctium lappa L.root

    圖2 牛蒡根提取物HPLC 對照指紋圖譜Fig 2 Common HPLC model fingerprint of Arctium lappa L.root

    2.3.5 共有峰的標(biāo)定 通過對14 批牛蒡根提取物中的共有峰進行比對分析,利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價體系》(2012 版)的數(shù)據(jù)匹配功能,在對照指紋圖譜上標(biāo)定共有峰,牛蒡根提取物HPLC 指紋圖譜共有11 個共有峰。同時與對照品色譜圖(見圖3)比對,可確認(rèn)6 號峰為3,5-二咖啡酰奎寧酸。選擇出峰時間適中、峰面積較大、對稱性較好的6 號峰作為參照峰(S),分別計算其他各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果見表1和表2。

    表1 牛蒡根提取物共有峰的相對保留時間Tab 1 Relative retention time of common peaks of Arctium lappa L.root

    表2 牛蒡根提取物共有峰的相對峰面積Tab 2 Relative peak areas of common peaks of Arctium lappa L.root

    圖3 對照品3,5-二咖啡??鼘幩岬纳V圖Fig 3 HPLC chromatogram of 3,5-dicaffeoylquinic acid

    2.3.6 相似度評價 將各個批次的牛蒡根提取物指紋圖譜分別導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》(2012 版)軟件,對各批次樣品的指紋圖譜與對照圖譜進行相似度評價。從圖1可以看出14 批牛蒡根藥材的整體圖貌基本一致。14 個產(chǎn)地的牛蒡根藥材的相似度達到了0.966,有較好的相似性,見表3。

    表3 牛蒡根提取物相似度Tab 3 Similarity of Arctium lappa L.root

    2.3.7 系統(tǒng)聚類分析 分別將14 批牛蒡根提取物樣品的HPLC 指紋圖譜中各自的共有峰的峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 17.0 統(tǒng)計分析軟件,采用組間聯(lián)接法,以歐式平方距離作為分類的依據(jù),對樣品進行聚類分析,結(jié)果見圖4。當(dāng)歐氏距離大于10時,14 批牛蒡根藥材主要被聚為兩類,Ⅰ類包括S1 ~S9、S11 ~S14,各個批次的樣品相似度較高(0.981 ~0.999),產(chǎn)地包括山東、安徽、浙江、江西、吉林、廣西、河北、湖北,Ⅱ類為S10(遼寧產(chǎn)地,相似度0.966)。表明這14 批樣品不完全相同,存在一定差異,但差異不大(整體在0.966 以上)。

    圖4 14 批藥材指紋圖譜聚類分析的樹狀圖Fig 4 Dendrogram of hierarchical clustering analysis of 14 batches of samples

    3 討論

    本研究對牛蒡根檢測的色譜條件進行了選擇及優(yōu)化,分別考察了甲醇/水、乙腈/水、甲醇/磷酸水、乙腈/磷酸水不同比例洗脫溶劑對HPLC 色譜圖的影響,結(jié)果顯示乙腈-0.4%磷酸水為較優(yōu)溶劑;并進行了全波長掃描,結(jié)果顯示330 nm 下色譜峰的數(shù)量較多,峰面積較大且分離度較好,故選擇330 nm 作為檢測波長。

    對提取方法進行考察,比較了提取溶劑(水、甲醇、乙醇)和不同濃度乙醇(55%乙醇、65%乙醇、75%乙醇)溶液的提取效果。發(fā)現(xiàn)以55%的乙醇溶液為溶劑加熱回流提取120 min,提取效果最優(yōu)。同時比較了多種流動相的比例對于牛蒡根提取物的分離效果,結(jié)果表明使用乙腈(B)-0.4%磷酸水(A)梯度洗脫:0 ~25 min,10%~15%B;25 ~35 min,15% ~20%B;35 ~60 min,20%~30%B,并使用Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱可以使樣品中各組分得到良好的分離,且保留時間適中。該方法簡潔方便,易于操作,還可減少對色譜儀的損耗,可準(zhǔn)確測定牛蒡根藥材中的指標(biāo)成分。

    指紋圖譜中11 個共有峰相對保留時間的RSD值均小于 1.2%,表明本文建立的指紋圖譜研究方法為一種穩(wěn)定的共有模式,可以作為牛蒡根藥材品質(zhì)評價的方法。14 批樣品相對峰面積RSD值較大,說明各批樣品間組分含量差異較大,提示牛蒡根的品質(zhì)與其產(chǎn)地密切相關(guān),需對牛蒡根化學(xué)成分進行含量測定,闡明藥材品質(zhì)與產(chǎn)地之間的關(guān)系,進一步為臨床使用牛蒡根提供依據(jù)。

    從相似度分析結(jié)果可知,除 S10(遼寧)外,其他相似度均在 0.98 以上,說明不同產(chǎn)地的牛蒡根藥材存在一定差異,但差異不大。同時從聚類分析結(jié)果可知,14 批牛蒡根藥材聚為兩類,區(qū)域特征不明顯,與相似度分析結(jié)果相一致,說明牛蒡根藥材質(zhì)量穩(wěn)定。

    HPLC 在檢測中藥等物質(zhì)中有很高的的應(yīng)用價值,可以清晰指認(rèn)分離藥物中的各類活性物質(zhì)[17]。本文通過建立牛蒡根藥材的HPLC 指紋圖譜,9 個產(chǎn)地的牛蒡根藥材的圖譜整體外形相近,且相似度也達到了0.966 以上,有較好的相似性。所建立的指紋圖譜,共有峰數(shù)目達到11 個,且分離度較好、保留時間合適,相鄰色譜峰之間的分離度較高,色譜峰強度也較大,且根據(jù)方法學(xué)的驗證結(jié)果均滿足要求。綜上可采用HPLC 法對牛蒡根藥材進行質(zhì)量把控,并對牛蒡根藥材進行綜合宏觀分析,可促進牛蒡根藥材及其相關(guān)制劑的研發(fā)并對其質(zhì)量的控制得到全面提高。

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