知母配方顆粒中4種成分在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)研究

朱琳，毛夢(mèng)倩，劉亮亮，劉玨玲（山西衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院，山西 晉中 030619）

知母為百合科植物知母Anemarrhena asphodeloidesBge.的干燥根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是常用中藥復(fù)方的組成部分[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明，知母提取物具有抗腫瘤、抑制血小板聚集、改善阿爾茨海默病癥狀、降脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、降血糖作用[2-8]。知母中的活性成分主要有甾體皂苷類、雙苯吡酮類、木脂素類、黃酮類、多糖類等[9-13]，其中皂苷類成分像知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ被證實(shí)是治療阿爾茨海默病、抗凝血、抗血栓以及抗癌的重要活性物質(zhì)[4，6]。知母配方顆粒是本實(shí)驗(yàn)室課題組將知母飲片經(jīng)水提醇沉、減壓濃縮、凍干、制粒等工藝優(yōu)化后制備而成的。然而，中藥制劑的生產(chǎn)過(guò)程受多環(huán)節(jié)、多因素的影響，容易造成標(biāo)準(zhǔn)化程度不高、體內(nèi)過(guò)程有差異等問(wèn)題，進(jìn)而導(dǎo)致臨床藥效的差異[14-15]。等效性研究是評(píng)價(jià)新劑型質(zhì)量的重要方式，即通過(guò)測(cè)定血藥濃度的方法來(lái)比較不同的制劑對(duì)藥物吸收的影響，以及藥物不同制劑之間的差異，以此來(lái)推測(cè)其臨床治療效果差異的可接受性。

本研究采用HPLC-MS/MS 法同時(shí)測(cè)定大鼠血漿中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ和知母皂苷AⅢ 4 種成分的血藥濃度，并比較健康大鼠給予配方顆粒與飲片提取物后4 種成分的藥動(dòng)學(xué)行為差異，初步評(píng)價(jià)知母配方顆粒的生物等效性特征，為其臨床合理用藥及后續(xù)研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Exion LC AC 液相系統(tǒng)串聯(lián)4000 Tripe Quad質(zhì)譜儀（美國(guó)AB Sciex 公司）；XPE 105 十萬(wàn)分之一電子天平（瑞士梅特斯-托利多公司）；Sorvall ST 8R 高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo Scientific公司）；AutoVap S60 型多樣品濃縮氮吹儀（美國(guó)ATR 公司）；Analyst V1.5.2 工作站（美國(guó)AB Sciex 公司）。

1.2 試藥

新芒果苷（批號(hào)：20190319）、芒果苷（批號(hào)：20181013）、知母皂苷BⅡ（批號(hào)：20190219）、知母皂苷AⅢ（批號(hào)：20190423）（純度≥98%，成都克洛瑪生物科技有限公司）；磺胺甲噁唑（批號(hào)：100025-201505，純度≥98%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；甲醇、乙腈、甲酸（色譜純，德國(guó)Fisher Scientific 公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。知母購(gòu)于國(guó)大藥房晉中分店，經(jīng)山西衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院生藥教研室楊翠玲副教授鑒定為百合科植物知母Anemarrhena asphodeloidesBge.的干燥根莖。

1.3 動(dòng)物

雄性SD 大鼠12 只，體質(zhì)量（200±20）g[山西衛(wèi)生健康職業(yè)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK（晉）2019-0001]。飼養(yǎng)于普通環(huán)境中，室溫20 ～30℃，相對(duì)濕度30%～70%，室內(nèi)光照明暗交替12 h，普通飼料投喂，自由飲用凈化水。

2 方法

2.1 色譜條件與質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Phenomenex Kinetex C18（75 mm×2.1 mm，2.6 μm）， 流動(dòng)相為水（0.1%甲酸，A）-甲醇（0.1%甲酸，B），梯度洗 脫（0 ～1 min：90% ～68%A；1 ～5 min：68%～ 25%A；5 ～7 min：25%～10%A；7 ～8 min：10%A），流速0.4 mL·min－1，進(jìn)樣量2μL，柱溫30℃。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源（ESI 源），負(fù)離子方式掃描；離子噴霧電壓－4500 V，離子源溫度500 ℃；真空度（10 e－5）3.0 Torr；GS1、GS2與CUR 均為氮?dú)?，壓力分別為40、40 和20 psi；掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；待測(cè)物離子通道及各參數(shù)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜條件Tab 1 Mass spectrometry condition of analyte and IS

2.2 系列混合對(duì)照品溶液的制備

分別取新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ和知母皂苷AⅢ對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇適量，制成質(zhì)量濃度為1.0、3.0、3.0、1.0 mg·mL－1的待測(cè)物儲(chǔ)備液。分別精密量取各儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋成含新芒果苷（0.01、0.02、0.1、0.2、0.4、1.0 μg·mL－1），芒果苷（0.1、0.2、1.0、2.0、4.0、10.0 μg·mL－1），知母皂苷BⅡ（0.1、0.2、1.0、2.0、4.0、10.0 μg·mL－1）和知母皂苷AⅢ（0.01、0.02、0.1、0.2、0.4、1.0 μg·mL－1）的系列混合對(duì)照品溶液，4℃冰箱內(nèi)保存，備用。

2.3 內(nèi)標(biāo)溶液的配制

取磺胺甲噁唑?qū)φ掌愤m量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1.0 mg·mL－1的儲(chǔ)備液。再精密量取儲(chǔ)備液適量，加甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為10.0 μg·mL－1的內(nèi)標(biāo)對(duì)照品溶液，4℃冰箱保存，備用。

2.4 大鼠灌胃給藥溶液的制備

知母飲片：取知母飲片約60 g，稱定，加入10 倍量30%乙醇，浸泡30 min，回流提取1 h，過(guò)濾，濾渣再加8 倍量30%乙醇，回流提取1 h，過(guò)濾，合并兩次提取液，減壓濃縮至0.95 g·mL－1，備用。

知母配方顆粒：取實(shí)驗(yàn)室自制配方顆粒適量，加水溶解，制成質(zhì)量濃度為0.95 g·mL－1（知母飲片含量）的溶液，備用。

2.5 血漿樣品的采集

知母飲片組和配方顆粒組大鼠各6 只，給藥前禁食12 h，期間自由飲水。兩組分別灌胃給予知母飲片和配方顆粒灌胃液。于口服給藥前和給藥后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、10、12、24、36 h 大鼠眼眶靜脈取血約0.5 mL，置于經(jīng)肝素處理的離心試管中，搖勻后靜置30 min，低速（4000 r·min－1）離心5 min，取上層血漿，于－80 ℃冰箱中凍存待測(cè)。

2.6 血漿樣品的預(yù)處理

取大鼠空白血漿100 μL 置1.5 mL EP 管中，加甲醇10 μL，內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，渦旋混合30 s 后，加乙腈100 μL，渦旋混合3 min，離心（12 000 r·min－1）5 min，取上清液置另一1.5 mL EP 管中，氮?dú)饬鞔蹈?，殘?jiān)映跏急壤鲃?dòng)相100 μL 復(fù)溶，渦旋1 min，離心（12 000 r·min－1）5 min，取上清液，進(jìn)樣分析。

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 專屬性 分別取6 份不同來(lái)源的大鼠空白血漿100 μL，按“2.6”項(xiàng)下方法操作（不加內(nèi)標(biāo)溶液），進(jìn)樣2 μL，得空白血漿樣品色譜圖（見(jiàn)圖1a）；取線性最低點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液加入空白血漿，按“2.6”項(xiàng)下方法操作，得模擬血漿樣品色譜圖（見(jiàn)圖1b）：新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅢ和IS 的保留時(shí)間分別為2.56、3.98、5.06、6.78 和3.67 min；取大鼠灌胃給予知母配方顆粒6.0 h 后的血漿樣品，按“2.6”項(xiàng)下方法操作，得給藥后血漿樣品色譜圖（見(jiàn)圖1c）。結(jié)果表明，內(nèi)源性物質(zhì)以及代謝物不干擾血漿中待測(cè)物和IS 的測(cè)定，方法專屬性良好。

圖1 空白血漿（a）、空白血漿加待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)（b）、給藥6 h 后血漿加內(nèi)標(biāo)（c）的色譜圖Fig 1 Chromatogram of a blank plasma sample（a），blank plasma spiked with analytes and IS（b）and plasma sample 6 h after the oral administration of Anemarrhenae Rhizoma granules（c）

2.7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量限 取大鼠空白血漿100μL，加入待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)系列溶液10 μL，制備模擬血漿生物樣品，除不加甲醇外，其余按“2.6”項(xiàng)下方法操作，每一濃度進(jìn)行雙樣本分析，進(jìn)樣2μL，記錄色譜圖。待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為標(biāo)準(zhǔn)曲線縱坐標(biāo)y，待測(cè)物質(zhì)量濃度（ng·mL－1）為橫坐標(biāo)x，用加權(quán)（w＝1/x2）最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得各組分標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ和知母皂苷AⅢ的標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)和定量下限Tab 2 Linearity and LLOQ of neomangiferin，mangiferin，timosaponin BⅡ and timosaponin AⅢ

2.7.3 精密度和準(zhǔn)確度 取大鼠空白血漿100μL，制備定量限、低、中、高4 個(gè)濃度（新芒果苷、知母皂苷AⅢ的濃度分別為1.0、2.5、12.5、80.0 ng·mL－1；芒果苷、知母皂苷BⅡ的濃度為10.0、25.0、125.0、800.0 ng·mL－1）的質(zhì)控（QC）樣品，每一濃度平行6 份，連續(xù)3 個(gè)分析批進(jìn)樣分析（不小于兩天），計(jì)算QC 樣品濃度。結(jié)果表明，4 種成分的日內(nèi)和日間準(zhǔn)確度的RE 分別小于10.3%和12.2%，日內(nèi)和日間精密度的RSD分別小于11.4%和13.3%，符合相關(guān)要求。

2.7.4 提取回收率 取大鼠空白血漿上清液100μL，平行制備低、中、高3 個(gè)濃度的QC 樣品各6 份進(jìn)行分析，獲得相應(yīng)峰面積A；另取空白血漿100 μL，按“2.6”項(xiàng)下方法操作（不加內(nèi)標(biāo)溶液），向獲得的上清液中加入低、中、高濃度的混合對(duì)照品溶液和內(nèi)標(biāo)溶液各10 μL，渦旋混合3 min 后于氮?dú)饬飨麓蹈?，?00 μL 初始流動(dòng)相復(fù)溶。取2 μL 上清液進(jìn)樣，獲得相應(yīng)峰面積B。以峰面積比值（A/B）計(jì)算提取回收率。結(jié)果表明，各待測(cè)物提取回收率在80.2%～116.6%，RSD＜2.0%，符合相關(guān)要求。

2.7.5 基質(zhì)效應(yīng) 取不同來(lái)源的大鼠血漿樣品100 μL，除不加內(nèi)標(biāo)溶液外，按“2.6”項(xiàng)下方法操作，向獲得的樣品中加入低、中、高3 個(gè)濃度的混合對(duì)照品溶液10 μL 和內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，渦旋混合3 min 后于氮?dú)饬飨麓蹈?，?00 μL 初始流動(dòng)相復(fù)溶，離心，取2 μL 上清液進(jìn)樣，獲得相應(yīng)峰面積；另取相應(yīng)濃度的混合對(duì)照品溶液10μL 和內(nèi)標(biāo)溶液10 μL，渦旋混合3 min 后于氮?dú)饬飨麓蹈桑?00 μL 初始流動(dòng)相復(fù)溶，取2 μL上清液進(jìn)樣，獲得相應(yīng)峰面積，上述每一濃度平行6 份。計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)，各待測(cè)物基質(zhì)效應(yīng)穩(wěn)定，在78.9%～109.7%，RSD＜15%。

2.7.6 樣品穩(wěn)定性 取大鼠空白血漿100 μL，制備低、高2 個(gè)濃度（新芒果苷、知母皂苷AⅢ的質(zhì)量濃度分別為2.5、80.0 ng·mL－1；芒果苷、知母皂苷BⅡ的質(zhì)量濃度為25.0、800.0 ng·mL－1）的QC 樣品，平行制備3 份，考察樣品在－80℃凍藏1 個(gè)月、3 次凍融循環(huán)、室溫放置24 h 以及自動(dòng)進(jìn)樣器放置（4℃）8 h 的穩(wěn)定性。結(jié)果各待測(cè)物在上述條件下穩(wěn)定性良好，RSD均＜10%。

2.8 樣品測(cè)定和數(shù)據(jù)處理

血漿樣品按“2.6”項(xiàng)下方法處理后分析測(cè)定。同時(shí)制備不少于當(dāng)批樣品總數(shù)5%的QC 樣品（含低、中、高3 個(gè)濃度），將QC 樣品均勻穿插于待測(cè)樣品中于同一批進(jìn)樣分析。由QC 樣品決定此分析批數(shù)據(jù)是否可用。采用非房室模型分別處理上述血藥濃度測(cè)定數(shù)據(jù)，求算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（Phoenix WinNonlin 8.1）。其中達(dá)峰時(shí)間tmax和峰濃度Cmax為實(shí)測(cè)值；梯形法計(jì)算藥時(shí)曲線下面積AUC；以血藥濃度對(duì)時(shí)間作半對(duì)數(shù)曲線，以消除相最后4 點(diǎn)進(jìn)行線性擬合，計(jì)算半衰期t1/2。

將得到的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（AUC0～t、AUC0～∞、Cmax）經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后應(yīng)用SPSS 20.0 進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，其余參數(shù)（tmax、t1/2）應(yīng)用SPSS 20.0 進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)，新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ和知母皂苷AⅢ 4 種成分的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖2，主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3。

表3 灌胃給藥后知母配方顆粒與飲片后各成分的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(Mean±SD，n ＝6)Tab 3 Pharmacokinetic parameters of 4 components in rat plasma after the oral administration of Anemarrhenae Rhizoma granules and pieces (Mean±SD，n ＝6)

圖2 知母配方顆粒和飲片中4 種成分在大鼠體內(nèi)平均血藥濃度-時(shí)間曲線（n ＝6）Fig 2 Mean plasma concnetration-time curve of 4 active ingredient in the Anemarrhenae Rhizoma granules and pieces in rats（n ＝6）

3 討論

3.1 HPLC-MS/MS 條件的優(yōu)化

新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ和知母皂苷AⅢ在電噴霧離子源正負(fù)離子檢測(cè)模式下均有響應(yīng)，但在正離子模式下響應(yīng)較低，因此選擇負(fù)離子檢測(cè)。考察乙腈與甲醇作為有機(jī)相，結(jié)果用甲醇作為有機(jī)相時(shí)，各待測(cè)物的響應(yīng)值較大，且背景噪音小，因此選擇甲醇作為有機(jī)相。當(dāng)流動(dòng)相中加入甲酸后，色譜行為明顯改善，隨著甲酸含量的增加，各待測(cè)物的響應(yīng)逐漸降低，最終選擇0.10%甲酸濃度。

3.2 血漿樣品處理方法的考察

血漿樣品預(yù)處理中本研究考察了沉淀蛋白法和液液萃取法對(duì)各成分的影響，發(fā)現(xiàn)不同萃取劑下的提取效率都不是很好，而采用乙腈沉淀蛋白時(shí)較有效除去內(nèi)源性雜質(zhì)，且提取回收率較高，之后又考察了乙腈比例對(duì)提取率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)空白血漿與乙腈比例為1∶1 時(shí)，回收率最高，因此選擇乙腈（1∶1）沉淀蛋白法進(jìn)行血漿樣品預(yù)處理。

3.3 藥動(dòng)學(xué)結(jié)果

方差分析結(jié)果表明，健康大鼠分別灌胃給予知母配方顆粒和飲片提取物后，4 種有效物質(zhì)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)均無(wú)顯著性差異；經(jīng)雙單側(cè)檢驗(yàn)法分析，知母配方顆粒和飲片各成分的AUC比值在0.80 ～1.25，即ln0.80 ≤lnAUCT/AUCR ≤ln1.25，該置信區(qū)間在[ln0.80 ～ln1.25]，認(rèn)為在90%的置信度下，兩種劑型AUC具有生物等效性；知母配方顆粒和飲片各成分的Cmax比值在0.70 ～1.43，即Cmax比值為ln0.70 ≤lnCmaxT/CmaxR ≤ln1.43，該置信區(qū)間在[ln0.70 ～ln1.43]，可以認(rèn)為在90%的置信度下，兩種劑型Cmax具有生物等效性，實(shí)驗(yàn)表明新劑型和古方劑型之間生物等效，輔料和制備工藝對(duì)藥方中有效成分無(wú)明顯影響。

此外，芒果苷、知母皂苷BⅡ在兩組大鼠體內(nèi)均呈現(xiàn)雙峰現(xiàn)象。雙峰現(xiàn)象在一定程度上可延長(zhǎng)藥物在體內(nèi)的作用時(shí)間，有一定的藥理學(xué)意義，但更明確的作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

本研究建立了同時(shí)測(cè)定大鼠血漿中新芒果苷、芒果苷、知母皂苷BⅡ和知母皂苷AⅢ4 種成分的HPLC-MS/MS 方法，并對(duì)健康大鼠分別灌胃給予知母配方顆粒和飲片后4 種化合物的藥動(dòng)學(xué)行為進(jìn)行了比較，結(jié)果表明，配方顆粒與飲片之間具有生物等效性，為知母配方顆粒的工業(yè)化生產(chǎn)及臨床合理用藥提供了一定的參考。